謝瀟瀟，趙青冬，胡凌云，姜淑芳，王曉萍，張文玲，李 珍，游艷琴，盧彥平

解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心1婦產(chǎn)科，2臨檢科，北京100853

罕見的染色體三體（RATs）是指除21、18、13號染色體之外的常染色體三體，其嵌合體的發(fā)生機制可能是早期著床前胚胎配子減數(shù)分裂發(fā)生錯誤后三體/單體自救的結果，或有絲分裂階段染色體不分離導致［1-3］。罕見的染色體三體的真性嵌合在胎兒期并不多見，但隨著產(chǎn)前檢測技術的發(fā)展，已有越來越多的罕見染色體三體嵌合體被檢出。近幾年，非侵入性產(chǎn)前檢測技術（NIPT）的檢測范圍由傳統(tǒng)的常見染色體非整倍體逐漸拓展為全基因組檢測，由此檢測出更多的其他染色體異常，包括RATs，給后續(xù)的遺傳咨詢和處理帶來很多困難。2022年美國ACMG關于NIPT的指南認為尚沒有足夠的證據(jù)支持NIPT常規(guī)用于RATs的篩查［4］，但也有研究發(fā)現(xiàn)NIPT檢測到的RATs與不良妊娠結局有關，認為NIPT是否有益于RATs的檢出，NIPT檢測到哪種RATs與不良妊娠結局有關，以及嵌合體的百分比是否有助于妊娠風險分層等問題仍需要更多臨床數(shù)據(jù)來進一步評估［5-8］。本研究擬分析本院5年中通過NIPT檢出的RATs高風險病例的產(chǎn)前診斷結果及妊娠結局，評估NIPT對RATs的檢測價值。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

選取2019年1月～2023年4月在我院建檔的或轉診至我院行非侵入性產(chǎn)前檢測提示為罕見的染色體三體高風險的病例，向孕婦及家屬進行產(chǎn)前咨詢后進行侵入性產(chǎn)前診斷，根據(jù)檢測結果及超聲檢查進行產(chǎn)前遺傳咨詢，所有病例隨訪妊娠結局。研究已獲得孕婦及其家人的知情同意，獲得倫理委員會批準（S2019-112-01）。

1.2 染色體核型分析

在超聲引導下行羊膜腔穿刺或臍血穿刺，留取羊水20 mL 或臍血2～3 mL，分別放入兩個無菌培養(yǎng)瓶中37 ℃培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，收獲細胞后行G顯帶染色體核型分析。使用北昂醫(yī)藥公司的圖像分析軟件V4.20，鏡下分析5～10組核型，至少計數(shù)30組分裂相，分別來自兩個培養(yǎng)瓶的15個細胞克隆，細胞核型圖分析按照人類遺傳學國際命名法要求。

1.3 單核苷酸多態(tài)性微陣列（SNParray）檢測及數(shù)據(jù)分析

留取7～10 mL羊水使用QIAamp DNA Mini Kit提取試劑盒（QIAGEN，德國）按照標準步驟提取DNA，并測定提取DNA的數(shù)量和質(zhì)量。質(zhì)控合格（＞0.5 μg；A260/A280＞1.8；A260/A230＞1.5）的樣品用于后續(xù)SNP array。應用CytoScan 750K Array Kit and Reagent Kit Bundle（Thermo Fisher Scientific）配套試劑和設備進行染色體微陣列分析檢測，實驗流程包括：DNA 消化和連接、PCR擴增和純化、定量和片段化、標記、微陣列雜交、洗染和掃描。將數(shù)據(jù)導入ChAS 4.3（Thermo Fisher Scientific）軟件中進行分析，在25 探針/50 Kb 為閾值進行染色體拷貝數(shù)變異（CNV）結果的分析，一般報告≥100 Kb 的CNVs，≥10 Mb的雜合性的缺失（LOH）和20%以上的嵌合，參考數(shù)據(jù)庫包括UCSC、OMIM、DECIPHER、DGV、ClinGen和PubMed。

1.4 染色體拷貝數(shù)變異測序（CNV-seq）

留取10～15 mL羊水，使用核酸提取試劑盒（鄂漢械備20150250號），參考標準提取SOP進行羊水DNA提取，并對提取質(zhì)量進行質(zhì)控，將提取的基因組DNA，通過酶切試劑將基因組DNA進行打斷和末端修復加“A”，利用連接酶在DNA 兩端加上含標簽序列的接頭，經(jīng)PCR擴增純化進行片段選擇，完成單個患者的DNA建庫并質(zhì)控。利用BGISEQ-500測序平臺進行測序，并利用測序儀自帶的數(shù)據(jù)處理軟件zebracall讀出原始測序數(shù)據(jù)。對所得數(shù)據(jù)進行質(zhì)量評估，經(jīng)過標準化等步驟對數(shù)據(jù)進行矯正，最后得到最終的CNV結果。下機數(shù)據(jù)使用SOAP比對到人類參考基因組（hg19）上，通過統(tǒng)計算法進行CNV 變異分析，得到變異分析結果，結合OMIM、HGMD、DGV等數(shù)據(jù)庫對變異結果進行解讀判定。

1.5 間期熒光原位雜交（FISH）

使用雅培公司的探針試劑盒，探針定位于7p11.1-q11.1（綠色）；2p11.1-q11.1（綠色）；14qte 14q32.3-（紅色）；3p11.1q11.1（紅色）；15p11.1q11.1（紅色）。取新鮮羊水10 mL，經(jīng)過離心固定后，根據(jù)探針數(shù)目確定雜交區(qū)，制片并烤片后進行雜交與染色，鏡檢使用圖像分析軟件Cytovision，羊水病例每雜交區(qū)至少計數(shù)30個細胞；如遇到低比例嵌合情況需相應加大計數(shù)。

1.6 非侵入性產(chǎn)前檢測（NIPT）

抽取5 mL 孕婦外周血經(jīng)雙重離心法處理得到DNA溶液。所得cfDNA質(zhì)控合格后，使用NIFTY?全因1.0試劑盒（華大基因）進行文庫制備，將純化后的DNA文庫，進行濃度質(zhì)控，質(zhì)控要求每個文庫＞2 ng/μL。將DNA文庫按比例混合準備上機進行測序，然后使用BGISEQ-500高通量測序儀進行測序。測序數(shù)據(jù)質(zhì)控和去接頭后，樣本下機fastq 數(shù)據(jù)與hg19 的人類參考基因組進行比對，采用Z 檢驗判斷待檢樣本與正常樣本是否存在顯著性差異，來判斷是否存在染色體非整倍性。

2 結果

2.1 NIPT檢出的RATs的基本情況

共25282例孕婦進行NIPT，檢出56例（0.22%）罕見的染色體三體高風險，其中7號染色體檢出率最高（45%，25/56），其次為3號染色體（11%，6/56），2例病例同時存在兩種染色體三體高風險（表1）。所有病例的平均年齡為31.8歲，其中34%（19/56）為高齡孕婦。經(jīng)過產(chǎn)前咨詢后，45例接受侵入性產(chǎn)前診斷，1例因胎死宮內(nèi)引產(chǎn)后進行遺傳學檢測；52例已隨訪到妊娠結局，3例目前在妊娠期，1例失訪（圖1）。

圖1 NIPT檢出RATs高風險病例基本情況Fig.1 High-risk cases of RATs detected by NIPT.

表1 NIPT檢出的RATs高風險的病例數(shù)Tab.1 Number of high-risk cases of rare autosomal trisomies(RATs)detected by NIPT

2.2 胎兒真性嵌合病例及其妊娠結局

獲得遺傳學檢測結果的46例病例中，45例采集羊水進行了染色體核型分析與染色體微缺失微重復檢測（SNParray/CNV-seq），1例引產(chǎn)后組織進行染色體微缺失微重復檢測，懷疑胎兒真性嵌合的病例均經(jīng)過兩種以上的檢測方法進行驗證。10例為胎兒真性嵌合病例（表2），陽性預測值（PPV）為22%（10/46），7號染色體胎兒真性嵌合PPV為10%（2/20）。足月分娩4例，隨訪新生兒結局良好（隨訪2月～3年），分別為T3嵌合2例、T7、T14嵌合各1例，嵌合比例6%～15%。5例選擇終止妊娠，分別為T2、T7、T10、T12、T15嵌合各1例（表2，病例1，5，7，8，10），嵌合比例16%～88%，其中T2、T10嵌合胎兒存在超聲結構異常，分別為：T2嵌合胎兒“草莓頭“，雙膽囊，胎兒生長受限（FGR）；T10嵌合胎兒鼻骨缺失、唇裂、單臍動脈和心臟畸形；T15嵌合存在母源單親二體（UPD）（表2a）。1例T3低比例嵌合病例（1%～7%）仍在妊娠期（表2，病例4），超聲未見異常，咨詢后決定繼續(xù)妊娠。共6例獲得胎盤進行驗證，均存在不同比例的嵌合細胞系（表2，病例1，3，5，6，9，10）。

表2 胎兒真性嵌合病例Tab.2 Data of cases of true fetal mosaicism

2.3 非真性嵌合病例及其妊娠結局

胎兒遺傳學檢測未發(fā)現(xiàn)嵌合細胞系的36例病例中，35例獲得妊娠結局，1例在妊娠期（表4，病例41）。35例獲得妊娠結局病例中27例妊娠結局良好，8例發(fā)生不良妊娠結局，分別為3、6、7、11、16號染色體異常。3號染色體異常病例（表4，病例34），因臍帶因素孕20周胎死宮內(nèi)。11號染色體異常病例（表4，病例43），孕25+2周超聲體質(zhì)量414g（＜P1），選擇致死性引產(chǎn)，胎盤驗證為44%T11限制性胎盤嵌合（CPM）。16號染色體異常的2例病例（表4，病例47，48）均發(fā)生嚴重的胎兒生長受限（體質(zhì)量＜P1），生后轉NICU；其中病例48孕34+5周合并重度子癇前期、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積、肝功能損傷、胎盤早剝、凝血功能異常，緊急剖宮產(chǎn)終止妊娠，出生體質(zhì)量1680 g；病例47合并妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積、肝功能損傷，37+4周剖宮產(chǎn)，出生體質(zhì)量1550 g，此例胎盤驗證為完全性的T16 CPM。7號染色體異常的3例病例（表3，病例13，23，25）中，病例13孕30+5周因臍血流阻力增高、胎心減速緊急剖宮產(chǎn)，新生兒出生低體質(zhì)量1080 g（＜P1），合并尿道下裂，生后轉NICU，胎盤驗證存在14%T7；病例23孕35周無誘因胎盤早剝緊急剖宮產(chǎn)，生后轉NICU；病例25孕36周自發(fā)早產(chǎn)剖宮產(chǎn)。6號染色體異常病例（表4，病例39），合并妊娠期高血壓，38+2周因“羊水過少，胎心減速”緊急剖宮產(chǎn)，新生兒出生低體質(zhì)量2200 g（＜P1），生后轉NICU。不良妊娠結局比例23%（8/35）。

表3 NIPT檢出T7高風險病例的遺傳學檢測結果及妊娠結局Tab.3 Genetic results and pregnancy outcomes of cases with T7 high-risk detected by NIPT

表4 NIPT檢出其他RATs高風險病例的遺傳學檢測結果及妊娠結局Tab.4 Genetic results and pregnancy outcomes of cases with other RATs high-risk detected by NIPT

2.4 未獲得遺傳學結果的病例及其妊娠結局

未獲得遺傳學檢測結果共10例，8例獲得妊娠結局，其中1例同時存在3號和7號染色體異常（表4，病例56）合并輕度子癇前期，35+5周早產(chǎn)，新生兒體質(zhì)量2550 g，生后轉NICU，另1例7號染色體異常（表3，病例31）咨詢后選擇直接致死性引產(chǎn)，余6例妊娠結局良好。

3 討論

NIPT是基于母血中的胎兒游離DNA（cfDNA）片段的非侵入性產(chǎn)前檢測，目前在臨床上廣泛應用于常見的染色體非整倍體的篩查，隨著生物信息學算法的不斷改進，NIPT篩查范圍逐漸擴展至全基因組檢測，因此檢出了更多的其他染色體異常，其中包括罕見的染色體非整倍體［7,9］。罕見的染色體完全三體一般在孕早期胚胎停育或流產(chǎn)［10］，因此，孕中期NIPT檢出的RATs高風險病例通常為嵌合體。染色體三體嵌合體包括胎兒真性嵌合體（TFM）和CPM。母血中的cfDNA片段來自于凋亡的滋養(yǎng)細胞，其來源與絨毛細胞相似，因此NIPT可以反映細胞滋養(yǎng)層的遺傳結構［9,11,12］，但無法區(qū)分TFM和CPM，只能通過侵入性產(chǎn)前檢測來明確。目前評估NIPT對罕見的染色體三體嵌合體的檢測價值的研究較少。

本研究總結了本院近5年NIPT檢測出的RATs高風險的數(shù)據(jù)，RATs 檢出率為0.22%，較Zhang 等［13］（0.36%）及Raymond等［14］（0.39%）的研究略低；檢出異常的染色體包括2、3、5、6、7、8、9、10、11、12、14、15、16、20，其中7號染色體檢出例數(shù)最多（45%），與其他研究的結果相似［6,13,14］，其次為3號染色體11%，其余染色體檢出病例數(shù)不多，1、4、17、19號染色體未檢出；多數(shù)病例檢出一種染色體異常，也有少數(shù)病例同時檢出兩種染色體異常。獲得胎兒遺傳學檢測結果的46例中，TFM共10例，PPV為22%，顯著低于常見的染色體21、18、13三體的PPV［4,12］。本研究共獲得10例胎盤進行多點驗證，其中6例TFM病例，4例非TFM病例，結果均提示胎盤存在不同比例的嵌合細胞系，證實了NIPT對于胎盤中存在的罕見染色體三體嵌合具有一定的檢測效能，因此，當侵入性產(chǎn)前診斷未提示TFM時，存在CPM的可能性較大，這也可以解釋研究中RATs 陽性預測值較低的現(xiàn)象。

RATs的TFM比較罕見，其臨床結局的嚴重程度因嵌合發(fā)生的時間、發(fā)生的部位、在關鍵組織中的分布、印記基因以及異常細胞的數(shù)量不同而不同［1,15］。在產(chǎn)前診斷中，可以使用多種檢測手段檢測樣本的嵌合細胞比例，本研究10例TFM均使用兩種以上的檢測方法進行驗證，妊娠結局良好的4例病例均為低比例嵌合，超聲未發(fā)現(xiàn)異常，經(jīng)過充分的產(chǎn)前咨詢后選擇繼續(xù)妊娠，隨訪妊娠結局良好，而不良妊娠結局的發(fā)生主要與超聲異常和UPD相關；6例留取胎盤進行檢測，證實均存在胎盤嵌合。本研究檢出的真性嵌合病例50%為沒有高危因素的低齡孕婦，因此NIPT能夠在一定程度上增加沒有高危因素孕婦的TFM的檢出。在本研究中雖然獲得良好妊娠結局的均為低比例嵌合病例，但產(chǎn)前能夠獲得的胎兒樣本來源非常有限，因此不能僅用嵌合比例來判斷胎兒表型的嚴重程度及預后，此類病例需結合有經(jīng)驗的超聲科醫(yī)生的產(chǎn)前超聲篩查進行評估，并對孕婦及家屬進行充分而慎重的產(chǎn)前咨詢后進行決策。

Zhang等［13］對97例RATs假陽性的病例中的81例進行了隨訪，37例發(fā)生不良妊娠結局，其中小于胎齡兒、生長受限和早產(chǎn)的發(fā)生率較高。Lin等［6］的研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，NIPT顯示16-三體、22-三體、9-三體和2-三體的孕婦發(fā)生不良結局的風險更高，包括早產(chǎn)、流產(chǎn)和超聲異常。Xiang等［16］的研究也認為，RATs假陽性的病例仍處于不良妊娠結局的高風險中，特別是NIPT顯示16三體和15三體的孕婦。本研究中除真性嵌合之外的病例共43例獲得妊娠結局，發(fā)生不良妊娠結局10例，發(fā)生率為23%，6例新生兒生后轉NICU治療。最常見的為胎兒生長受限（FGR），共7例，且程度均較重，見于6、7、11、16號染色體異常，其中5例體質(zhì)量小于第一百分位數(shù)；最早出現(xiàn)嚴重FGR的為T11 CPM的病例，孕22+5周胎兒體質(zhì)量即小于P1，孕婦選擇致死性引產(chǎn)。5例病例早產(chǎn)，其中自發(fā)性早產(chǎn)1例（7號染色體），治療性早產(chǎn)4例，7例活產(chǎn)病例均行剖宮產(chǎn)終止妊娠，其中緊急剖宮產(chǎn)4例（6、7、16號染色體），孕周最小的一例為T7 CPM的病例，孕30+5周即因出現(xiàn)嚴重的胎盤功能下降，F(xiàn)GR、胎心減速而行緊急剖宮產(chǎn)終止妊娠。5例病例發(fā)生妊娠期合并癥或并發(fā)癥，如妊娠期高血壓疾病、肝功能損傷、胎盤早剝等，見于6、7、16號染色體，以及1例3、7號兩種染色體異常病例。既往已有不少研究發(fā)現(xiàn)，T16 CPM病例通常與不良妊娠結局有關，常見FGR、胎兒結構性異常及先兆子癇［17-19］。本研究2例16號染色體異常病例除發(fā)生FGR，孕晚期均出現(xiàn)母體肝功能損傷，膽汁酸升高，其中1例孕37+4周剖宮產(chǎn)，胎盤驗證為T16 CPM，另一例病例孕33+2周時出現(xiàn)肝功能損傷未重視，孕34+5周重度子癇前期，發(fā)生胎盤早剝及凝血功能異常而行緊急剖宮產(chǎn)，但此例未獲得胎盤組織，不排除與T16 CPM有關。CPM引起不良妊娠結局的機制還不清楚，有研究發(fā)現(xiàn)CPM中胎盤梗死和蛻膜血管變化的比例與正常胎盤相比幾乎翻倍，認為可能是染色體異常導致胎盤局部功能失調(diào)［20］。與普通孕婦人群相比，CPM病例子癇前期和低出生體質(zhì)量的風險顯著增加，且排除T16 CPM之后仍具有顯著意義［21］。根據(jù)本研究的數(shù)據(jù)，雖然NIPT對于TFM的檢測PPV不高，但NIPT提示罕見染色體異常的病例仍有可能發(fā)生較嚴重的妊娠合并癥或并發(fā)癥，尤其是存在CPM時，較常見的為FGR和早產(chǎn)，F(xiàn)GR常為首發(fā)表現(xiàn)，因此，對于此類病例需重視和加強妊娠期的監(jiān)測與管理，及時干預。

在既往多項研究中，7號染色體異常是NIPT檢測中最常檢出的罕見的染色體非整倍體異常，本研究中亦是7號染色體異常病例檢出最多，近一半（45%）的RATs高風險病例均為7號染色體，篩查陽性率為0.099%，但PPV僅為10%，隨訪完整的22例中，82%病例妊娠結局良好。7號染色體攜帶印記基因，如果三體是減數(shù)分裂錯誤導致，三體自救后可能存在UPD而影響新生兒預后［22-24］。然而，在Benn等［25］的研究中，93例CPM7沒有一例檢出UPD7，Zhu等［26］的研究也認為，大多數(shù)7號嵌合三體形成的原因不是三體自救，胎兒存在UPD7的風險低。本研究未能對所有7號染色體三體高風險的病例進行UPD檢測，僅在活產(chǎn)的1例T7 TFM病例和1例T7 CPM病例中排除了UPD7，活產(chǎn)的21例新生兒均未發(fā)現(xiàn)UPD7相關異常表現(xiàn)。

本研究中進行侵入性產(chǎn)前檢測的病例年齡小于35歲約占67%，NIPT在一定程度上增加了低危孕婦侵入性產(chǎn)前檢測的需求，而且，NIPT檢測結果給孕婦及其家庭帶來的心理焦慮不容忽視［27］，本研究有1例孕婦僅因NIPT結果提示7號染色體異常而自行直接選擇孕中期致死性引產(chǎn)。因此，對于NIPT檢出RATs高風險的結果的咨詢需謹慎，且還需要更多的研究來權衡侵入性產(chǎn)前檢測對于此類病例的利弊。

綜上所述，非侵入性產(chǎn)前檢測技術的發(fā)展增加了胎兒罕見染色體三體真性嵌合病例的檢出，在一定程度上避免了此類缺陷兒的出生，但陽性預測值不高，與限制性胎盤嵌合現(xiàn)象有關。當侵入性產(chǎn)前檢測未提示胎兒存在嵌合細胞系，大部分病例預后良好，尤其是7號染色體，但仍有發(fā)生母兒不良妊娠結局的風險，最常見為FGR及早產(chǎn)，F(xiàn)GR常為首發(fā)表現(xiàn)。因此，當NIPT檢出RAT高風險，應向孕婦進行相應的產(chǎn)前咨詢以減輕其焦慮，同時結合侵入性產(chǎn)前診斷結果及超聲隨訪對胎兒預后進行評估，加強妊娠期監(jiān)測和管理能夠使這部分孕婦獲益；對于未行NIPT的孕婦，孕中晚期發(fā)現(xiàn)FGR，如侵入性產(chǎn)前檢測未提示異常，可以補充NIPT 協(xié)助查找FGR原因。