龐碧瀅，黃娜娜，黃曉霞，李 馨，熊文婷，孔 波，姚 焱

廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州510000

除酒精、病毒、藥物等脂肪肝致病因素外，大泡性肝細(xì)胞脂肪變性超過5%診斷為非酒精性脂肪性肝病（NAFLD），其疾病譜包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝纖維化、肝硬化和肝癌［1,2］。2018年NAFLD全球患病率高達(dá)25%［3］。我國(guó)NAFLD患病率已趕超歐美發(fā)達(dá)國(guó)家，嚴(yán)重危害國(guó)民健康和社會(huì)發(fā)展［1］。脂肪肝是NAFLD早期階段，肝臟脂肪分解利用與新生脂肪生成的失調(diào)是重要的致病風(fēng)險(xiǎn)因素，因此，促進(jìn)肝內(nèi)脂肪酸β-氧化分解，降低肝臟脂肪堆積可有效延緩或阻止NAFLD發(fā)展。

過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）是肝臟脂質(zhì)代謝的主要調(diào)控蛋白，調(diào)控過氧化物酶體β-氧化、線粒體β-氧化、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)與合成等多種代謝途徑［4,5］。有研究證實(shí)，PPARα激動(dòng)劑（GW7647）可逆轉(zhuǎn)NAFLD小鼠模型中脂質(zhì)在肝細(xì)胞的積累［6］。此外，NAFLD 患者肝臟PPARα基因表達(dá)水平與NASH嚴(yán)重程度和脂肪積累呈負(fù)相關(guān)，而與NASH 組織學(xué)的改善呈正相關(guān)［7］。PPARα的調(diào)控在NAFLD疾病發(fā)展過程中對(duì)肝臟有重要的保護(hù)作用，以其為靶點(diǎn)的藥物Saroglitazar，用于治療NAFLD/NASH，已進(jìn)入臨床II 期試驗(yàn)，但具體機(jī)制尚不明了［8］。

研究表明miR-21-5p［9］、miR-22-3p［10］和miR-34a-5p［11］等miRNAs特異性靶向PPARα，參與PPARα的穩(wěn)定性調(diào)控。其中，miR-21在NASH小鼠模型及患者肝細(xì)胞中高量表達(dá)，與脂肪變性、炎癥和纖維化等過程相關(guān)，是NAFLD疾病發(fā)展的關(guān)鍵誘導(dǎo)因子［12-15］。miR-21的表達(dá)水平受磷酸化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶MAPK/ERK和活化蛋白（AP-1）信號(hào)通路的調(diào)節(jié)［12,16］。激活的ERK信號(hào)通路介導(dǎo)exportin-5磷酸化影響成熟miRNA水平［17］?，F(xiàn)有研究主要集中于miRNA對(duì)下游基因的調(diào)控，但對(duì)于miRNA的上游調(diào)節(jié)途徑不明。

膽汁酸主要由膽固醇衍生而來(lái)，在肝臟中形成初級(jí)膽汁酸，經(jīng)腸道細(xì)菌轉(zhuǎn)化成次級(jí)膽汁酸。在二型糖尿病并發(fā)的NAFLD患者和NAFLD疾病的早晚期纖維化進(jìn)展中，機(jī)體大部分膽汁酸水平增加，其中次級(jí)膽汁酸石膽酸水平均明顯增加［18,19］。腸道菌群失調(diào)是NAFLD的重要特征，膽汁酸等腸道菌群代謝物水平和組成的改變常影響NAFLD發(fā)病過程［20,21］。有研究表明，腸道菌群可依賴于FXR信號(hào)通路誘導(dǎo)肝臟脂肪變性和炎癥增加，可通過感應(yīng)PXR信號(hào)通路參與肝臟脂肪酸代謝過程［22,23］。因此，疏水性強(qiáng)的石膽酸可通過腸肝軸激活肝臟FXR和PXR等受體，激活細(xì)胞內(nèi)ERK1/2和JNK1/2等信號(hào)通路，以響應(yīng)腸道菌群帶來(lái)的變化，影響肝臟代謝功能。

本研究主要從石膽酸與PPARα的mRNA和蛋白表達(dá)，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，以及mRNA穩(wěn)定性的關(guān)系，探究毒性膽汁酸石膽酸誘導(dǎo)MAPK/ERK1/2 信號(hào)通路對(duì)肝細(xì)胞中miR-21水平的調(diào)控，及石膽酸通過miR-21影響PPARα mRNA穩(wěn)定性與肝臟脂質(zhì)代謝紊亂的可能關(guān)系，為NAFLD疾病發(fā)展的基礎(chǔ)研究和治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑

人肝母細(xì)胞瘤HepG2細(xì)胞（中科院上海細(xì)胞庫(kù)）；ExFect?Transfection Reagent（南京Vazyme）；PPARα抗體（Proteintech）；phospho-p44/42 MAPK（ERK1/2）（Thr202/Tyr204）抗體（CST）；ERK1/2、β-actin、HRP 標(biāo)記山羊抗兔、HRP 標(biāo)記山羊抗鼠抗體和Renilla Luciferase（R-Luc）或Firefly Luciferase（F-Luc）報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（上海Beyotime）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2 細(xì)胞用DMEM 完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清，1%青霉素/鏈霉素）培養(yǎng)（37 ℃，5%CO2），細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 構(gòu)建phR_hPPARα-3'UTR載體 在NCBI獲得人的PPARα（NR1C1,NM_001001928.4）3'UTR 序列，再在TargetScanHuman，miRWalk和DIANA數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)富含miR-21-5p、miR-22-3p和miR-34a-5p等miRNA作用靶點(diǎn)的PPARα 3'UTR序列，按含同一miRNA多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的序列為一目的片段，得3個(gè)短片段，分別命名為3'UTR1（771-1339）、3'UTR2（771-2366）和3'UTR3（4717-5126）。從HepG2細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增目的片段，用NotI內(nèi)切酶將phR載體線性化，按同源重組方法分別構(gòu)建3個(gè)野生型質(zhì)粒。將3'UTR1中2個(gè)miR-21結(jié)合序列突變?yōu)閷?duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列，構(gòu)建突變型質(zhì)粒：hPPARα-3'UTR1_Mut1、hPPARα-3'UTR1_Mut2 和 hPPARα-3'UTR1_Mut1+Mut2。

1.2.3 單熒光素酶報(bào)告基因細(xì)胞轉(zhuǎn)染 準(zhǔn)備對(duì)數(shù)期細(xì)胞，按ExFect?Transfection Reagent說明書，6孔板每孔轉(zhuǎn)染3 μg質(zhì)粒，分別將phR_hPPARα-3'UTR載體轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞，8～10 h后，收集細(xì)胞。將新鮮的完全培養(yǎng)基進(jìn)行化合物預(yù)處理，分至96孔板，每孔加入50 μL處理后的培養(yǎng)基，每種處理重復(fù)3次，再將收集的細(xì)胞分至含處理培養(yǎng)基的孔中，每孔分50 μL懸浮細(xì)胞，輕輕混勻使細(xì)胞均勻鋪滿培養(yǎng)皿底部。實(shí)驗(yàn)處理如下：以50 μmol/L和100 μmol/L 石膽酸為實(shí)驗(yàn)處理組，DMSO 為對(duì)照組。48 h后，按R-Luc報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書，制備蛋白樣品，于酶標(biāo)儀中檢測(cè)得到每個(gè)樣品的熒光值。以對(duì)照組熒光值/對(duì)照組熒光值均值為1，各插入片段的實(shí)驗(yàn)組熒光值與對(duì)照組熒光值均值之比表示該化合物處理后對(duì)該插入片段的調(diào)控作用。

1.2.4 RT-qPCR 實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)備對(duì)數(shù)期細(xì)胞，用DMSO，50 μmol/L和100 μmol/L 石膽酸處理48 h，每種處理重復(fù)3 次，按RNA-easyTMIsolation Reagent 試劑盒說明書，提取總RNA，使用隨機(jī)引物于PCR儀中完成反轉(zhuǎn)錄得cDNA。莖環(huán)法設(shè)計(jì)miR-21-5p逆轉(zhuǎn)錄引物：5'-GTC GTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTG GATACGACTCAACAT-3'及qPCR引物，表1中U6引物R 作逆轉(zhuǎn)錄引物，配制成混合引物使用。準(zhǔn)備總RNA，每10 μL 反轉(zhuǎn)錄體系中，250 ng 總RNA、DEPCtreated Water與逆轉(zhuǎn)錄引物（each primer 0.5 μmol/L)于PCR 儀70 ℃預(yù)變性10 min，立即4 ℃冰浴，再加入其他成分完成反轉(zhuǎn)錄（16 ℃30 min；42 ℃30 min；85 ℃5 min；4 ℃hold）。qPCR 擴(kuò)增均按ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 說明書，于QuantStudioTM3 System中進(jìn)行擴(kuò)增，β-actin為內(nèi)參基因，U6 snRNA為miRNAs內(nèi)參基因，目的基因相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt表示。引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for RT-qPCR

1.2.5 miRNAPCR array 在TargetScanHuman、miRDB和DIANA中預(yù)測(cè)靶向3'UTR1和3'UTR2的miRNAs，取miRDB中Target Score大于50且至少在兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中相互交集的miRNAs為候選miRNAs，以U6 snRNA、SNORD44和SNORD47作內(nèi)參基因，設(shè)置陰性對(duì)照，設(shè)計(jì)miRNA PCR array。以DMSO 為對(duì)照，100 μmol/L石膽酸為實(shí)驗(yàn)組處理48 h，重復(fù)3次，按miRNA cDNA合成試劑盒和miRNAPCR array說明書，各取500 ng總RNA，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。以3個(gè)內(nèi)參基因Ct值的均值作標(biāo)準(zhǔn)化，miRNA相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt表示，以log2FC絕對(duì)值≥1為差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.6 Western blot 分析 準(zhǔn)備蛋白樣品，測(cè)定蛋白濃度，每孔上樣100 μg蛋白進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜（230 mA，90 min），室溫封閉2 h（5%脫脂奶粉），洗膜，4 ℃孵育一抗12 h：鼠抗PPARα（1∶1000）和兔抗phospho-p44/42 MAPK（ERK1/2）（Thr202/Tyr204）（1∶500），洗膜，用HRP標(biāo)記山羊抗鼠或HRP標(biāo)記山羊抗兔（1∶10000）室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光顯影結(jié)束后，膜再生重新封閉，分別4 ℃孵育兔抗ERK1/2（1∶1000）、鼠抗β-actin（1∶1000）過夜，進(jìn)行后續(xù)步驟。數(shù)據(jù)用Image J處理。

1.2.7 構(gòu)建pGL4-miPPR-21載體 據(jù)已報(bào)道的miR-21轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)（CATTTTATT）［24］，從NCBI 獲得VMP1（NM_001329394.2）中hsa-miR-21初始轉(zhuǎn)錄本的啟動(dòng)子序列（miPPR-21），經(jīng)hTFtarget預(yù)測(cè)確定ERK1/2信號(hào)通路下游的主要轉(zhuǎn)錄因子—早期生長(zhǎng)應(yīng)答因子（early growth response 1,EGR1）與miPPR-21存在潛在結(jié)合作用，TransmiR和JASPAR同時(shí)預(yù)測(cè)到EGR1與miR-21啟動(dòng)子區(qū)有潛在靶點(diǎn)（AGACCGCCCCCTCTG，-161～-146）。從基因組DNA中獲得目的片段，構(gòu)建pGL4-miPPR-21（-241～-30）載體，將EGR1與miPPR-21結(jié)合位點(diǎn)突變?yōu)榛パa(bǔ)序列，為突變型載體。

1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告基因細(xì)胞轉(zhuǎn)染 準(zhǔn)備對(duì)數(shù)期細(xì)胞，按轉(zhuǎn)染試劑說明書，6 孔板每孔共轉(zhuǎn)染3 μg 載體（pEnCMV-EGR1 和pGL4-miPPR-21）與20 ng phR 內(nèi)參質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染8～10 h，收集細(xì)胞，將新鮮的完全培養(yǎng)基進(jìn)行化合物預(yù)處理，按每孔50 μL分至96孔板中，每種處理重復(fù)3次，再將收集的細(xì)胞按每孔50 μL懸浮細(xì)胞分至含預(yù)處理培養(yǎng)基的孔中，輕輕混勻使細(xì)胞均勻鋪滿培養(yǎng)皿底部。培養(yǎng)24 h后，按F-Luc報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書，制備蛋白樣品，于酶標(biāo)儀中檢測(cè)得到每個(gè)樣品的螢火蟲熒光值（F）和海腎熒光值（R），以對(duì)照組F/R與對(duì)照組F/R的均值之比為1，實(shí)驗(yàn)組每個(gè)樣品的F/R與對(duì)照組F/R的均值之比表示該化合物處理后對(duì)插入片段的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，比較該化合物處理后的相對(duì)熒光素酶活性變化。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS和GraphPad Prism 9.0統(tǒng)計(jì)并作圖。數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，兩組間數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 石膽酸下調(diào)PPARα mRNA和蛋白水平

100 μmol/L 石膽酸處理HepG細(xì)胞48 h后，PPARα mRNA水平顯著下調(diào)（P＜0.01，圖1A），同時(shí)，在Western blot實(shí)驗(yàn)中，PPARα蛋白水平比對(duì)照組下調(diào)了54%（P＜0.01，圖1B）。

圖1 石膽酸下調(diào)HepG2細(xì)胞中PPARα mRNA和蛋白水平Fig.1 LCA downregulates PPARα at both mRNA and protein levels in HepG2 cells.A:PPARα mRNA levels induced by 50 μmol/Land 100 μmol/LLCAfor 48 h.B:Effect of 100 μmol/LLCAon PPARα protein expression at 48 h.**P＜0.01.

2.2 單熒光素酶報(bào)告基因體系確證石膽酸參與了PPARα轉(zhuǎn)錄后調(diào)控

生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miRNA靶點(diǎn)豐富的3'UTR區(qū)，構(gòu)建克隆載體（圖2A）。與對(duì)照組相比，50 μmol/L 石膽酸處理48 h后3'UTR1和3'UTR2的熒光酶活力均顯著下降，100 μmol/L 石膽酸處理48 h后，這兩個(gè)片段的熒光素酶活力均顯著下降超過50%（P＜0.01），而且降幅均大于3'UTR3（圖2B）。

圖2 石膽酸對(duì)PPARα轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的影響Fig.2 Effect of LCA on post-transcriptional regulation of PPARα.A,B: HepG2 cells transfected with 3 reporter vectors containing binding sequences of miR-21-5p,miR-22-3p and miR-34a-5p and treated with 50 and 100 μmol/L LCAfor 48 h.*P＜0.05,**P＜0.01.

2.3 石膽酸上調(diào)miR-21和miR-22表達(dá)

通過生物信息學(xué)確定作用于3'UTR1和3'UTR2的候選miRNAs（圖3A），100 μmol/L 石膽酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞48 h后，miRNA PCR array檢測(cè)各候選miRNAs表達(dá)水平，以log2FC絕對(duì)值≥1為差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示，miR-22-3p，miR-21-5p和miR-184的log2FC值分別為1.1，1.0和0.9，則miR-22-3p和miR-21-5p表達(dá)上調(diào)（圖3A）。采用莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄，RT-qPCR進(jìn)一步檢測(cè)不同濃度石膽酸誘導(dǎo)miR-21-5p表達(dá)，其中100μmol/L石膽酸誘導(dǎo)miR-21高水平表達(dá)，上調(diào)了2.35倍（P＜0.05，圖3C）。

圖3 石膽酸上調(diào)miR-21和miR-22表達(dá)Fig.3 LCA upregulates miR-21 and miR-22 expressions in HepG2 cells.A: Expression changes of candidate miRNAs in miRNA PCR array induced by 100 μmol/L LCA for 48 h.B,C:hsa-miR-21 levels detected by RT-qPCR with Stem-loop reverse transcription induced by 50 μmol/L(B)and 100 μmol/L(C)LCAfor 48 h.*P＜0.05.

2.4 石膽酸通過調(diào)控miR-21降低PPARα mRNA穩(wěn)定性

已知miR-21-5p表達(dá)上調(diào)（圖3C），構(gòu)建3'UTR1中miR-21位點(diǎn)突變載體（圖4A）。與對(duì)照組相比（圖4B），50 μmol/L 石膽酸處理48 h時(shí)WT、Mut1和Mut2的熒光素酶活性顯著下調(diào)，且降幅相當(dāng)；Mut1+Mut2的熒光素酶活性與對(duì)照組相比無(wú)顯著變化。用100 μmol/L 石膽酸處理48 h（圖4C），WT、Mut1和Mut2的熒光素酶活力比對(duì)照組顯著下調(diào)（P＜0.01），分別下調(diào)51%，37%、39%；Mut1+Mut2 僅下調(diào)13%（P＜0.05）。顯然，兩個(gè)miR-21位點(diǎn)全部突變后，明顯減弱了石膽酸對(duì)PPARα的降解。

圖4 石膽酸通過調(diào)控miR-21降低PPARα mRNA穩(wěn)定性Fig.4 LCA reduces the stability of PPARα mRNA by regulating miR-21.A:Target and mutation sequences of miR-21 in PPARα 3'UTR1.B,C: Changes of luciferase activity after miR-21 sites mutation in cells treated with 50 μmol/L(B) and 100 μmol/L(C) LCA for 48 h.*P＜0.05,**P＜0.01.

2.5 石膽酸上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子EGR1并影響PPARα蛋白表達(dá)水平

Western bolt結(jié)果顯示：石膽酸在30 min內(nèi)磷酸化ERK1/2（圖5A）。用50 μmol/L 石膽酸處理48 h，EGR1表達(dá)上調(diào)1.98倍（P＜0.05，圖5B）；100 μmol/L 石膽酸分別處理24 h 和48 h，EGR1 表達(dá)上調(diào)3.09 倍和5.83 倍（P＜0.01，圖5C），呈時(shí)間劑量正相關(guān)。而且瞬時(shí)轉(zhuǎn)染過表達(dá)EGR1后PPARα蛋白顯著下降（P＜0.05，圖5D），與石膽酸下調(diào)PPARα蛋白表達(dá)量結(jié)果相同（P＜0.01，圖1B）。

圖5 石膽酸調(diào)控EGR1對(duì)PPARα蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of EGR1 regulated by LCA on PPARα protein expression.A:Western blots of phosphorylated MAPK/ERK1/2(Thr202/Tyr204)induced by 50 μmol/L and 100 μmol/L LCA for 30 min and 1 h.B,C:EGR1 mRNA expression induced by 50 μmol/L(B)and 100 μmol/L(C)LCA for 48 h.D:Effect of EGR1 overexpression on PPARα protein expression for 48 h.NC:Non-overexpressed EGR1;EGR1 overexpression:Transfection pEnCMV-EGR1.*P＜0.05,**P＜0.01.

2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因體系確證EGR1與miR-21啟動(dòng)子區(qū)的靶向關(guān)系

生物信息學(xué)預(yù)測(cè)EGR1 與pri-miR-21 啟動(dòng)子區(qū)（miPPR-21）潛在靶點(diǎn)，構(gòu)建野生型和位點(diǎn)突變型質(zhì)粒（圖6A）。以DMSO對(duì)照組酶活性為1，用50 μmol/L 石膽酸處理24 h，不過表達(dá)與過表達(dá)EGR1時(shí)WT的酶活性分別上調(diào)，為1.37 和1.58；100 μmol/L 石膽酸處理24 h，不過表達(dá)EGR1時(shí)WT的熒光素酶活力顯著上調(diào)1.67，過表達(dá)EGR1 時(shí)WT 中上調(diào)1.90。同時(shí)，過表達(dá)EGR1時(shí)，50 μmol/L 石膽酸處理后Mut的酶活性上升幅度與WT 酶活性升幅相比，呈輕微下降趨勢(shì)；過表達(dá)或不過表達(dá)EGR1時(shí)，與對(duì)照組相比，100 μmol/L石膽酸處理后WT 的酶活性與Mut 的酶活性升幅相當(dāng)（P＜0.01，圖6B）。

圖6 EGR1與miR-21啟動(dòng)子區(qū)的靶向關(guān)系Fig.6 Targeting relationship between EGR1 and the promoter region of miR-21.A:Vector of pGL4-miPPR-21.B: Effect of EGR1 overexpression on regulation pGL4-miPPR-21 for 24 h.WT:pGL4-miPPR-21;Mut:pGL4-miPPR-21-Mut(-161～-146);EGR1:pEnCMV-EGR1.*P＜0.05,**P＜0.01.

3 討論

膽汁酸是營(yíng)養(yǎng)傳感器和代謝調(diào)節(jié)器，是代謝疾病的重要驅(qū)動(dòng)因素［25］。石膽酸可激活FXR、TGR5、PXR、VDR、EGFR 等受體和JNK1/2、蛋白激酶B（AKT）、ERK1/2等信號(hào)通路，參與調(diào)控葡萄糖穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)和脂蛋白代謝、能量消耗、炎癥和肝癌的發(fā)生［26,27］。臨床數(shù)據(jù)表明NAFLD不同疾病階段石膽酸水平異常升高，參與NAFLD的疾病進(jìn)展［18,19］。本研究發(fā)現(xiàn)次級(jí)膽汁酸石膽酸顯著下調(diào)肝細(xì)胞中PPARα的mRNA和蛋白表達(dá)水平，因此有必要了解肝臟中毒性膽汁酸石膽酸對(duì)PPARα mRNA穩(wěn)定性的調(diào)控。本文熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)了石膽酸參與PPARα轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，通過調(diào)控富含miRNA 潛在靶點(diǎn)的3'UTR1 和3'UTR2 序列促使PPARα降解。腸道微生物組分析顯示高脂飲食小鼠模型中腸道菌群的改變導(dǎo)致石膽酸水平升高，促進(jìn)NAFLD發(fā)展［28］。肝臟中高脂飲食誘導(dǎo)PPARα mRNA表達(dá)下調(diào)，經(jīng)降脂藥物治療后表達(dá)上調(diào)［29］。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其趨勢(shì)一致，說明腸道代謝物石膽酸可能通過降低PPARα mRNA穩(wěn)定性影響脂質(zhì)代謝。

miRNA PCR arrary 篩選發(fā)現(xiàn)石膽酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞miR-21和miR-22差異表達(dá)，在本研究中miR-21高水平表達(dá)，石膽酸可進(jìn)一步誘導(dǎo)miR-21表達(dá)上調(diào)，表明石膽酸對(duì)下游基因的調(diào)控作用主要通過調(diào)節(jié)miR-21水平變化來(lái)實(shí)現(xiàn)。miR-21是肝細(xì)胞癌和以脂肪變性為特征的早期肝病中表達(dá)豐度高的miRNAs之一，其表達(dá)水平的改變與肝臟脂肪變性、脂質(zhì)過氧化、胰島素抵抗以及癌癥的發(fā)生有關(guān)［30,31］。miR-21在NAFLD疾病的肥胖、肝炎、肝纖維化及肝硬化階段中異常高表達(dá)，并隨NAFLD發(fā)展而升高，可促進(jìn)NAFLD向NASH發(fā)展，加速NAFLD進(jìn)程［32,33］。miR-21表達(dá)增加，發(fā)生脂質(zhì)堆積，并直接靶向脂肪酸氧化關(guān)鍵基因PPARα，降低PPARα蛋白表達(dá)量［9］。但miR-21其上游調(diào)節(jié)來(lái)源途徑不明確。本研究確證了石膽酸對(duì)PPARα 3'UTR存在明顯的調(diào)控作用，并呈劑量相關(guān)。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)到3'UTR1中miR-21 與PPARα的2 個(gè)靶點(diǎn)，靶點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)表明miR-21主要通過兩個(gè)位點(diǎn)起作用，進(jìn)一步證明石膽酸可通過誘導(dǎo)miR-21作用于PPARα 3'UTR1，在轉(zhuǎn)錄后水平降低PPARα mRNA穩(wěn)定性和蛋白表達(dá)，證實(shí)了miR-21調(diào)控PPARα 3'UTR區(qū)的上游石膽酸調(diào)節(jié)途徑?？蔀榻忉尅癗AFLD不同疾病階段石膽酸水平異常升高”和“高豐度的miR-21促進(jìn)從肥胖、肝炎到肝纖維化和肝癌的NAFLD疾病發(fā)展”的現(xiàn)象提供有力支撐。

MEK/ERK/miR-21在非小細(xì)胞癌和癌相關(guān)成纖維細(xì)胞中表達(dá)增加［34］，結(jié)直腸癌細(xì)胞中石膽酸通過ERK1/2信號(hào)通路，轉(zhuǎn)錄因子AP-1 和STAT3 啟動(dòng)miR-21 轉(zhuǎn)錄［35］。本研究中石膽酸可使肝細(xì)胞的ERK1/2磷酸化，高劑量石膽酸可快速激活肝細(xì)胞中MAPK/ERK1/2信號(hào)通路，與石膽酸上調(diào)肝細(xì)胞miR-21 表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相呼應(yīng)，說明肝細(xì)胞中ERK1/2 信號(hào)通路可能與miR-21 表達(dá)相關(guān)。研究表明ERK1/2 信號(hào)通路下游主要轉(zhuǎn)錄因子EGR1在膽汁淤積性肝病患者中的表達(dá)增強(qiáng)［36］。本文進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)石膽酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的EGR1 mRNA表達(dá)，并呈時(shí)間劑量相關(guān)，與石膽酸磷酸化ERK1/2結(jié)果相同。因此推測(cè)轉(zhuǎn)錄因子EGR1參與調(diào)控miR-21的轉(zhuǎn)錄和PPARα表達(dá)。過表達(dá)EGR1后的PPARα蛋白相對(duì)表達(dá)量與石膽酸處理后的檢測(cè)結(jié)果一致，均下調(diào)PPARα蛋白表達(dá)，證實(shí)石膽酸誘導(dǎo)EGR1參與PPARα蛋白表達(dá)調(diào)控的過程。生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)EGR1與miPPR-21有潛在靶點(diǎn)（-161～-146），距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)較近。雙熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明EGR1 參與miR-21 轉(zhuǎn)錄的過程，在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)降低PPARα mRNA穩(wěn)定性有一定的作用，但突變?cè)摪悬c(diǎn)后，沒有減弱過表達(dá)EGR1對(duì)miPPR-21片段的調(diào)控，可見該靶點(diǎn)不是EGR1與miPPR-21的主要結(jié)合位點(diǎn)。由過表達(dá)EGR1下調(diào)PPARα蛋白表達(dá)推測(cè)，EGR1可能從轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和翻譯水平多方面調(diào)控PPARα表達(dá)。研究表明，EGR1可通過直接抑制脂肪甘油三酯脂酶的轉(zhuǎn)錄，抑制脂肪分解［37］。脫氧膽酸DCA-EGR1-炎癥因子軸途徑增強(qiáng)CCl4 誘導(dǎo)的肝損傷與PPARα信號(hào)相關(guān)［38］?？梢奅GR1與膽汁酸代謝失調(diào)、脂質(zhì)代謝異常和PPARα信號(hào)通路密切相關(guān)。進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)錄因子EGR1影響肝細(xì)胞中PPARα mRNA 穩(wěn)定性和基因表達(dá)的具體分子機(jī)制，將有助于了解石膽酸下游信號(hào)調(diào)控PPARα mRNA穩(wěn)定性的復(fù)雜機(jī)理。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)石膽酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞miR-21和miR-22表達(dá)上調(diào)，并通過誘導(dǎo)miR-21作用于3'UTR參與PPARα轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，促進(jìn)PPARα降解；石膽酸激活MAPK/ERK1/2信號(hào)通路，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子EGR1并降低PPARα蛋白表達(dá)；石膽酸通過MAPK/ERK1/2信號(hào)通路及調(diào)控miR-21 和miR-22 表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄后水平降低PPARα mRNA穩(wěn)定性，下調(diào)肝細(xì)胞PPARα mRNA和蛋白水平，加重肝損傷。本文結(jié)果為深入探討膽汁酸代謝失調(diào)在NAFLD疾病發(fā)展中的作用機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。