李婉瑩,于淼淼,彭豫鵬,牟 華,c,2,高 煥,c,2,閻斌倫,c,2

(1.江蘇海洋大學(xué) a.海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院; b.江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗室; c.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 連云港 222005; 2.江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺,江蘇 南京 210014)

0 引言

脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)屬于甲殼動物,體長為5～9 cm,體色透明,是我國特有的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種。脊尾白蝦一般生活在泥沙底質(zhì)的淺海海域,在我國的渤海、黃海、東海和南海等區(qū)域的近海區(qū)域都有分布[1]。該蝦環(huán)境適應(yīng)力強(qiáng),具有廣溫和廣鹽的特性,在水溫2～38 ℃,鹽度4～35范圍內(nèi)均能存活,同時生長周期短,2～3個月即可長到成體,所制成的海產(chǎn)品美味且營養(yǎng)豐富,深受消費(fèi)者歡迎,已經(jīng)成為重要的經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)動物之一[2]。

維生素是動物體內(nèi)維持生命所需的一類有機(jī)化合物。目前已知的維生素種類很多,如維生素A、維生素B1、維生素C、維生素E等。其中維生素E又稱為生育酚,能有效防止體內(nèi)紅細(xì)胞和細(xì)胞膜的氧化,但其在動物體內(nèi)不能自主合成,動物只能通過外界攝入來獲取[3]。在水產(chǎn)動物營養(yǎng)生理研究方面,維生素E對水產(chǎn)動物的生長性能和抗氧化能力影響情況一直備受研究者的關(guān)注,維生素E也是甲殼類動物維持生殖和生理活動必需的營養(yǎng)素[4]。例如在飼料里添加適量的維生素E可以顯著提高羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)的抗氧化能力[5]。作為重要經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖對蝦的脊尾白蝦,目前關(guān)于其人工配制飼料中應(yīng)該添加的最適維生素E量還未見報道,這不利于脊尾白蝦大規(guī)模人工養(yǎng)殖活動的開展。因此本文希望通過對不同維生素E添加水平對脊尾白蝦生長和抗氧化能力影響的研究,來為精準(zhǔn)研制脊尾白蝦人工飼料提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗用脊尾白蝦為健康個體,用電子天平稱量各組蝦平均體質(zhì)量為(1.31±0.31)g。維生素E添加劑、超氧化物歧化酶(SOD)(批號20230103)、過氧化氫酶(CAT)(批號20230103)、過氧化物酶(POD)(批號20221115)測定所用試劑盒由南京建成生物公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 實(shí)驗設(shè)計 選取大小均勻、體格健壯、活力強(qiáng)的脊尾白蝦450尾,分成5組,每組設(shè)置3個平行,每個重復(fù)30尾,放入水箱(50 cm×40 cm×30 cm)進(jìn)行養(yǎng)殖,維生素E添加劑按0 mg/kg(A組,對照)、200 mg/kg(B組)、400 mg/kg(C組)、800 mg/kg(D組)、1 600 mg/kg(E組)加入到配制的基礎(chǔ)飼料中進(jìn)行投喂。脊尾白蝦基礎(chǔ)飼料配方和成分含量如表1所示。

1.2.2 實(shí)驗飼料制備 根據(jù)表1,參考王玉等[6]的方法準(zhǔn)備材料,用篩子篩過后,于盆中加入各種材料并攪拌混勻,隨后再加入魚油攪拌混勻;混勻之后開始一邊攪拌一邊加入清水,進(jìn)一步混勻后用擠壓機(jī)擠壓成1.0 mm大小的顆粒。擠壓出來的飼料放置于烘干箱中50 ℃烘干3～4 h,烘干完畢后取出進(jìn)行含水量檢測,當(dāng)含水量低于10%時即可封裝于袋中,現(xiàn)做現(xiàn)用。

1.2.3 養(yǎng)殖管理 在江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗室進(jìn)行養(yǎng)殖實(shí)驗,自然采光,全天24 h充氧,鹽度為25,水溫為25 ℃,在全天曝氣的養(yǎng)殖環(huán)境中暫養(yǎng)一周。實(shí)驗前將脊尾白蝦饑餓24 h。每天投喂2次,投喂量為蝦體質(zhì)量的3%,期間及時清理養(yǎng)殖環(huán)境里的殘餌和糞便并換水。

1.2.4 樣品采集 飼養(yǎng)結(jié)束后,饑餓脊尾白蝦24 h,測定蝦的體質(zhì)量,每箱隨機(jī)取樣3尾,稱取肝胰腺質(zhì)量;在樣品中按質(zhì)量比1∶10的比例加入生理鹽水,冷凍勻漿,轉(zhuǎn)速為2 500 r/min,離心10 min,取上清液,棄沉淀,上清液于-80 ℃冰箱里保存。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 生長指標(biāo)測定 養(yǎng)殖實(shí)驗結(jié)束后,計算各組脊尾白蝦的生長指標(biāo):增質(zhì)量率(WGR)和特定生長率(SGR)。計算公式分別為

增質(zhì)量率(%)=(實(shí)驗結(jié)束時脊尾白蝦的平均體質(zhì)量-實(shí)驗初始脊尾白蝦的平均體質(zhì)量)/實(shí)驗初始脊尾白蝦的平均體質(zhì)量×100%,

特定生長率(%/d)=(ln(實(shí)驗結(jié)束時脊尾白蝦的平均體質(zhì)量)-ln(實(shí)驗初始脊尾白蝦的平均體質(zhì)量))/t×100%。

1.3.2 肝胰腺組織蛋白濃度測定 酶活測定前需要先測定脊尾白蝦肝胰腺組織蛋白濃度,蛋白濃度測定步驟如下。

(1) 首先配制標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度為25 mg/mL,保存?zhèn)溆谩?/p>

(2) 接著吸取標(biāo)準(zhǔn)液到96孔板里,加入適量生理鹽水,稀釋為等梯度的標(biāo)準(zhǔn)品(0,0.025,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mg/mL)。

(3) 然后用移液槍吸取200 μL的BCA工作液(V(A液)∶V(B液)=50∶1)到每個微孔里,在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱里靜置30 min。

(4) 利用標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)。

1.3.3 肝胰腺組織抗氧化指標(biāo)測定 取組織上清液用試劑盒進(jìn)行酶活測定,步驟如表2～表4所示。

表2 ACP活力測定操作Table 2 ACP activity determination operation μL

表3 AKP活力測定操作Table 3 AKP activity determination operation μL

表4 SOD活力測定操作Table 4 SOD activity determination operation μL

(1) 孵育。將準(zhǔn)備好的樣品逐一添加至96孔板中,在適當(dāng)溫度下孵育一段時間。

(2) 讀取結(jié)果。使用酶標(biāo)儀讀取每個孔的顏色強(qiáng)度,顏色強(qiáng)度與組織中酶活性成正比。

(3) 數(shù)據(jù)分析。根據(jù)已知濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算樣本中抗氧化酶活性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用軟件SPSS進(jìn)行差異顯著性分析,P<0.05表示存在顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 飼料維生素E對脊尾白蝦生長的影響

脊尾白蝦的生長指標(biāo)變化情況如表5所示?？梢钥闯?生長指標(biāo)隨著維生素E的水平增加而逐漸增加,脊尾白蝦增質(zhì)量率和特定生長率呈現(xiàn)先上升后下降趨勢;其中在維生素E添加量為400 mg/kg時,蝦的增質(zhì)量率和特定生長率最高,超過此質(zhì)量分?jǐn)?shù)則呈現(xiàn)下降趨勢。

表5 飼料中維生素E水平對脊尾白蝦生長的影響(平均差±標(biāo)準(zhǔn)差)Table 5 Effect of vitamin E level in feed on the growth of Exopalaemon carinicauda (Mean±SD)

2.2 飼料維生素E對脊尾白蝦抗氧化酶活性的影響

本實(shí)驗通過對各組脊尾白蝦肌肉中抗氧化酶的活性來反應(yīng)脊尾白蝦的抗氧化指標(biāo)情況。具體影響如表6所示,隨著維生素E水平的增加,脊尾白蝦肌肉中SOD酶活性呈現(xiàn)先上升后下降趨勢;在添加量為400 mg/kg時SOD酶活性最高,超過此質(zhì)量分?jǐn)?shù)則呈現(xiàn)下降趨勢。各組間CAT和POD酶活性并沒有顯著性差異。

表6 飼料中添加維生素E水平對脊尾白蝦抗氧化酶活性的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Table 6 Effect of vitamin E level in feed on antioxidant enzyme activity of Exopalaemon carinicauda (Mean±SD)

3 討論

3.1 飼料維生素E對脊尾白蝦生長的影響

維生素E可以防止DNA結(jié)構(gòu)變異,促進(jìn)酶的合成和抑制活性氧(ROS)反應(yīng),保證機(jī)體各項生理活動正常運(yùn)行,具有促進(jìn)生長發(fā)育的功能[7]。單凡等[8]研究表明,飼料中維生素E添加量為103.4～631.7 mg/kg組的羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)增質(zhì)量率(WGR)和特定生長率(SGR)顯著增加?？子星俚萚9]研究表明,隨著飼料中維生素E添加量增加,日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)的WGR呈先升高后下降的趨勢。這與本研究結(jié)果相似,與對照組相比,當(dāng)維生素E添加量為200～400 mg/kg時脊尾白蝦的WGR和SGR增加,添加量為400 mg/kg時達(dá)到最高,但添加量為600～800 mg/kg時呈下降趨勢,并在800 mg/kg時顯著低于對照組。說明飼料中添加維生素E量太高反而會破壞蝦體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,增加蝦體內(nèi)代謝負(fù)擔(dān),從而抑制蝦的生長發(fā)育活動[10]。

3.2 飼料維生素E對脊尾白蝦抗氧化酶活性的影響

由于沒有成對的電子,所以ROS化學(xué)活性很強(qiáng),主要包括O2-,O3和H2O2等,ROS為機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分,通過氧化攻擊病原體,達(dá)到保護(hù)機(jī)體的目的[11]。通常,在機(jī)體抗氧化酶作用下,過多的ROS可以通過化學(xué)反應(yīng)等方式降低氧化作用,避免其無差別攻擊體內(nèi)細(xì)胞[12],但一旦產(chǎn)生過多自由基,會導(dǎo)致細(xì)胞加速衰老并且產(chǎn)生病變[13]。在正常的生理狀態(tài)下,機(jī)體代謝產(chǎn)生的活性氧可被抗氧化系統(tǒng)控制得以及時清除[14];抗氧化酶可防止細(xì)胞組織被氧化損壞[15]。

本次實(shí)驗通過提取脊尾白蝦的肝胰腺組織來測定抗氧化酶的酶活。結(jié)果表明,維生素E水平為200～400 mg/kg時,脊尾白蝦SOD活性隨著維生素E水平升高而升高,且在400 mg/kg時活性最高,超過這個水平范圍便呈現(xiàn)下降趨勢。這說明維生素E水平過高,可能會增加脊尾白蝦肝胰腺代謝的負(fù)擔(dān),導(dǎo)致SOD酶活力下降[16]。已有研究表明,各組日本沼蝦肝胰腺的SOD酶活力隨飼料維生素E水平的增加呈先上升后下降的變化趨勢[10];陳文燕[17]研究發(fā)現(xiàn)雜交鱧(Channaargus×Channamaculata)的SOD活性隨維生素E水平的增加呈先升高后降低的趨勢,這與本文實(shí)驗結(jié)果相似。但本實(shí)驗中蝦肌肉中CAT和POD活性并沒有隨著維生素E添加量增加而發(fā)生顯著性變化。王海燕[18]研究中發(fā)現(xiàn),在飼料中添加不同水平維生素E的幼蛙肝臟的CAT活力差異不顯著;Wang等[19]研究發(fā)現(xiàn),在黃菇魚(Nibeaalbiflora)飼料中添加維生素E對于CAT活性無影響,但是使SOD活性顯著增加。孔有琴等[9]發(fā)現(xiàn)日本沼蝦CAT活性隨著飼料中維生素E水平的升高而下降,原因可能是維生素E作為一種抗氧化劑,可代替多種抗氧化酶來保護(hù)機(jī)體免受氧化損害。所以在本實(shí)驗中脊尾白蝦肌肉中CAT和POD酶活性沒有隨著維生素E的添加而增加,并不能代表飼料中添加維生素E沒有提高脊尾白蝦抗氧化能力。

4 結(jié)論

本實(shí)驗通過在飼料中添加不同水平維生素E,來探究維生素E水平對脊尾白蝦生長性能和抗氧化酶活性的影響。結(jié)果顯示,與對照組相比,飼料維生素E水平在400 mg/kg時,脊尾白蝦增質(zhì)量率、特定生長率和SOD酶活性最高。