免疫快速同步檢測玉米中5種真菌毒素膠體金試紙條的構(gòu)建和應(yīng)用

邢常瑞, 鄭 欣, 董 雪, 李光磊, 劉崇靖,張 勛,2, 袁 建, 鞠興榮

(南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院;江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心;江蘇省糧油品質(zhì)控制及深加工技術(shù)重點實驗室1,南京 210023)

(山東美正生物科技有限公司2,日照 102100)

玉米是生物經(jīng)濟的基本原料,用途十分廣泛,自2012年以來超過稻谷成為我國第一大糧食作物,其產(chǎn)業(yè)鏈和價值鏈不斷增長和擴張。然而,玉米在田間收獲、干燥、運輸和儲藏等多個環(huán)節(jié)中都易受到真菌的污染而導(dǎo)致黃曲霉毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮毒素等多種真菌毒素危害[1],影響以玉米為原料的相關(guān)食品的質(zhì)量,對居民身體健康造成潛在的健康風(fēng)險。

研究表明谷物中真菌毒素的混合污染對生物體造成的危害情況更為復(fù)雜,風(fēng)險更大[2],當(dāng)多種真菌毒素同時存在時,他們之間可能發(fā)生拮抗或協(xié)同作用,將對動物機體產(chǎn)生不同程度的負(fù)面影響。目前在細胞水平有證據(jù)表明毒素共存會導(dǎo)致不同的聯(lián)合毒性。比如James等[3]研究表明DON和ZEN共存時在細胞毒性和DNA斷裂方面呈現(xiàn)加和作用,在DNA合成方面呈現(xiàn)亞加性作用,在脂質(zhì)過氧化反應(yīng)方面呈現(xiàn)協(xié)同作用。2018—2020年間來自歐洲、非洲、亞洲和南美洲的超過1 000份玉米樣品的檢測結(jié)果表明,75%的樣品受到了多重毒素的污染[4]。一項針對廣西省百色市玉米真菌毒素污染狀況的調(diào)查表明,收集自2017—2019年間的玉米樣品中AFB1、DON和ZEN的檢出率分別為91.94%、5.38%和45.16%;其中,AFB1和ZEN超標(biāo)率為68.28%和22.04%[5]。玉米中真菌毒素的多重污染在糧食收儲運過程中備受關(guān)注,在極端天氣條件下情況更為嚴(yán)重。

目前,糧食中真菌毒素的檢測方法有液相色譜法(LC)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)、免疫學(xué)檢測方法和電化學(xué)檢測方法等。LC和LC-MS/MS方法可以對多種目標(biāo)物進行定量檢測,靈敏度較高,適用于多種真菌毒素的同時檢測[6]。然而,儀器檢測方法價格昂貴,場所受限,且需要熟練的操作人員,不適合用于糧食收獲及收購現(xiàn)場多毒素的快速篩查。近年來,單一真菌毒素的免疫層析試紙條(ICA)由于其特異性好、準(zhǔn)確度高、使用簡便、價格便宜、易于推廣等特點得到了廣泛應(yīng)用[7, 8],因此,將ICA應(yīng)用于多種真菌毒素的檢測開始受到人們的關(guān)注并具有極大的推廣價值[9-11]。目前,由于合成方法簡單、可視化判斷方便、標(biāo)記方法成熟,膠體金是免疫試紙條中使用較多的信號材料。黃馨雨[12]利用膠體金作為免疫標(biāo)記物制備可同時檢測FB1和DON的免疫層析試紙條。Kong等[13]利用抗體的交叉性能,可以通過多線檢測試紙條方法實現(xiàn)20種真菌毒素的半定量和定量檢測,Liu等[14]建立了基于手機雙模檢測方法,實現(xiàn)谷物中多種真菌毒素膠體金和熒光雙模檢測。因此,建立快速、高通量、高靈敏度的多種真菌毒素同時檢測方法,用于糧食加工與收儲相關(guān)企業(yè)現(xiàn)場篩查具有十分重要的意義。

本研究優(yōu)化了玉米中的多種毒素同時提取前處理方法,建立一種同步快速檢測玉米基質(zhì)中5種真菌毒素膠體金多檢測線試紙條,該方法具有操作簡便、靈敏度高,檢測快速和成本較低等優(yōu)點,可以在糧食倉儲和加工企業(yè)中進行推廣和應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

黃曲霉毒素B1(AFB1)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮毒素(ZEN)、伏馬毒素B1(FB1)和T-2毒素(T-2)標(biāo)準(zhǔn)品溶液,單克隆抗體(anti-AFB1antibody、anti-FB1antibody、anti-T-2 antibody、anti-DON antibody和anti-ZEN antibody),包被抗原(AFB1-BSA、FB1-BSA、T-2-BSA、DON-BSA、ZEN-BSA)和羊抗鼠IgG (H+L)。

1.2 儀器設(shè)備

HM 3030三維劃膜噴金,ZQ 2002微電腦自動斬切機,真空冷凍干燥機,高速離心機,Xevo TQ液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀。

1.3 膠體金免疫層析試紙條方法的建立

1.3.1 單克隆抗體標(biāo)記金納米粒子的制備

取50 mL離心管加入10 mL金溶液,再加入一定量的0.1 mol/L K2CO3溶液調(diào)節(jié)合適的pH,蓋緊蓋子后用手輕輕搖晃至均勻。分別將5種真菌毒素的單克隆抗體,用0.002 mol/L的pH 8.0硼酸鹽緩沖液(BB)稀釋到0.2 mg/mL,分別加入一定量的抗體溶液,將各個混合物在25 ℃下恒溫振蕩(500 r/min)1 h后,加入2 mL 10% BSA封閉,室溫振蕩2 h(500 r/min)。以10 000 r/min離心30 min,去除上清液,將沉淀物溶解在2 mL金標(biāo)懸浮液中。根據(jù)流程分別制備AuNPs-AFB1mAb、AuNPs- FB1mAb、AuNPs- T-2 mAb、AuNPs- DON mAb和AuNPs- ZEN mAb的金標(biāo)抗體,并分別以每孔50 μL將其轉(zhuǎn)移到96孔酶標(biāo)板中,真空冷凍干燥后密封以防受潮[15]。

1.3.2 多檢測線免疫膠體金試紙條的制備

將NC膜、樣品墊和吸收墊逐層粘貼在PVC板上,制備免疫層析試紙條。硝酸纖維素膜貼在 PVC底板中部,吸水墊和樣品墊分別貼在PVC底板的上下兩端,并且與硝酸纖維素膜有1.5 mm左右的重疊。使用劃膜噴金儀,以1.0 μL /cm的速率分別將抗原AFB1-BSA、FB1-BSA、T-2-BSA、DON-BSA、ZEN-BSA和羊抗鼠二抗噴到硝酸纖維素膜表面形成測試線(T-1線、T-2線、T-3線、T-4線和T-5線)和控制線(C線),每條線之間的距離為3 mm,將組裝好的卡片置于37 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥6 h。組裝好的卡片烘干后用微電腦自動斬切機切成3.8 mm寬的條狀,裝于塑封袋中,放入干燥柜中保存。

1.3.3 玉米樣品中真菌毒素前處理條件優(yōu)化

首先確定玉米樣品中5種真菌毒素同時提取條件參數(shù),并對提取溶劑的組分進行了優(yōu)化。準(zhǔn)確稱取1 g(精確到0.01 g)空白玉米樣品于10 mL離心管,加入4 mL提取溶劑(V乙腈∶V水∶V甲酸=70∶29∶1),渦旋提取20 min,然后以6 000 r/min離心10 min,吸取0.5 mL上清液于1.5 mL離心管中,加入0.5 mL水并渦旋混勻,在4 ℃下以12 000 r/min離心10 min,上清液過0.2 μm的有機相濾膜,收集濾液于進樣瓶中。將5種毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到空白的玉米樣品提取液中,制備一系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,同時將空白玉米樣品提取液作為對照。

本實驗選擇體積分?jǐn)?shù)分別為60%、70%、80%、90%的乙腈水溶液和含體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸的60%、70%、80%、90%的乙腈水溶液作為提取溶劑。稱取8組1 g玉米陰性質(zhì)控樣品,每組包含3個平行,分別添加一定濃度的5種真菌毒素的混合溶液,按照以上處理步驟進行處理后通過液質(zhì)聯(lián)用儀器進行檢測,計算不同提取溶劑的提取率,確定最佳提取溶劑。

1.3.4 膠體金試紙條測定玉米中的真菌毒素

首先,在陰性玉米粉樣品中加入一系列濃度的真菌毒素溶液制備基質(zhì)添加樣品。玉米粉中添加AFB1終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0、8.0、16.0、40.0、80.0、160.0、400.0、800.0 μg/kg,FB1終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0、20.0、40.0、100.0、200.0、400.0、1 000.0、2 000.0 μg/kg,T-2終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0、1 000.0 μg/kg,DON終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0、40.0、80.0、200.0、400.0、800.0、2 000.0、4 000.0 μg/kg,ZEN終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0、1 000.0 μg/kg。

選擇優(yōu)化后的提取溶劑對玉米樣品中的五種真菌毒素進行提取,并通過多重免疫膠體金試紙條進行檢測。分別稱取玉米粉1.0 g,按不同濃度進行加標(biāo)后,加入4 mL乙腈-水(體積比為90∶10)溶液,快速振蕩1 min后,渦旋混勻20 min。6 000 r/min離心5 min后,將上清液轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中備用。分別取1 mL上清液加入10 mL離心管中,在氮氣流下吹干,以消除有機試劑對試紙條顯色的影響,最后加入5 mL PBST溶解樣品。溶液中AFB1的質(zhì)量濃度為 0.0、0.4、0.8、2.0、4.0、8.0、20.0、40.0 ng/mL,FB1的質(zhì)量濃度為0.0、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL,T-2的質(zhì)量濃度為0.0、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 ng/mL,DON質(zhì)量濃度為0.0、2.0、4.0、10.0、20.0、40.0、100.0、200.0 ng/mL,ZEN的質(zhì)量濃度為0.0、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 ng/mL。

分別取150 μL樣品溶液加入含有5種真菌毒素金標(biāo)抗體的微孔中,室溫反應(yīng)15 min。試紙條檢測結(jié)果通過手機拍攝記錄檢測結(jié)果并通過肉眼判斷消線值(Cut off Value,免疫層析試紙條T線顯色完全消失時對應(yīng)真菌毒素的濃度值)。通過ImageJ軟件對5條檢測線的灰度條帶進行自動提取,并計算峰面積,以加標(biāo)濃度和檢測線的峰面積建立5種真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算最低檢測限。

1.4 應(yīng)用多重膠體金試紙條快速同步檢測玉米樣品中的真菌毒素

利用所制備的膠體金試紙條對含有真菌毒素污染的玉米實際樣品進行檢測,檢測結(jié)果通過肉眼判斷,并結(jié)合Image J對樣品進行定量判定。

2 結(jié)果與討論

2.1 玉米基質(zhì)中5種真菌毒素前處理方法優(yōu)化

2.1.1 玉米基質(zhì)中5種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

將5種毒素(AFB1、FB1、T-2、DON和ZEN)混合的標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到空白玉米樣品提取液中,并稀釋成一系列濃度梯度,同時將空白玉米樣品提取液作為陰性對照,液質(zhì)測定結(jié)果見表1,結(jié)果表明5種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.998,線性關(guān)系良好。

表1 玉米基質(zhì)中5種真菌毒素的線性關(guān)系及檢測限

2.1.2 玉米基質(zhì)中5種真菌毒素前處理優(yōu)化

選擇(添加體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸)8種不同的乙腈水溶液提取溶劑,渦旋20 min,比較不同提取溶劑下的5種真菌毒素的添加回收率,結(jié)果見圖1。

圖1 玉米基質(zhì)中樣品提取溶劑的優(yōu)化

從圖1中可以看出,提取溶劑不同,同種真菌毒素的提取效率存在差異;相同提取溶劑對于每種真菌毒素提取效率也不同。對于AFB1,添加體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸的70%、80%乙腈水溶液的回收率高于未添加甲酸的同等乙腈濃度的提取溶劑,而添加體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸的60%乙腈水溶液的ZEN回收率高于未添加甲酸的60%乙腈水溶液。AFB1,FB1和T-2毒素在提取液為90%乙腈水溶液時,回收率最高;DON在提取溶劑為80%乙腈水溶液時回收率最高,其次為體積分?jǐn)?shù)為90%乙腈水溶液;ZEN在提取溶劑為體積分?jǐn)?shù)為90%乙腈水溶液和添加體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸的乙腈水溶液時,回收率相當(dāng)?？紤]這5種真菌毒素的提取效率,選擇體積分?jǐn)?shù)為90%乙腈-水溶液作為玉米基質(zhì)中5種真菌毒素的最佳提取溶劑。

2.1.3 玉米樣品添加回收實驗

分別向玉米陰性樣品中添加低、中、高3個濃度水平的5種真菌毒素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,AFB1/FB1/T-2/DON/ZEN加標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1/5/5/50/5、2/20/20/200/20、4/40/40/400/40 μg/kg。按照優(yōu)化的提取條件處理樣品,每個加標(biāo)水平重復(fù)3次(n=3),并計算玉米基質(zhì)中5種真菌毒素的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。玉米基質(zhì)中低、中、高3個濃度添加水平的加標(biāo)回收率AFB1為99.3%～113.3%,FB1為100.5%～103.4%,T-2為71.9%～81.1%,DON為73.4%～87.6%,ZEN為106.9%～111.9%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.9%～7.5%之間,表明該方法回收率高、準(zhǔn)確度較好。

因此,本實驗所優(yōu)化的提取方法適用于玉米樣品中5種真菌毒素的同時提取,并用于后續(xù)膠體金試紙條玉米樣品的前處理。

2.2 玉米基質(zhì)中5種真菌毒素多重檢測膠體金試紙條方法的建立

當(dāng)150 μL含有高濃度目標(biāo)毒素的溶液添加到微孔,目標(biāo)物(AFB1、FB1、T-2、DON、ZEN或全部毒素)與對應(yīng)毒素金標(biāo)抗體特異性結(jié)合,形成金標(biāo)抗體-毒素復(fù)合物。然后,將組裝好的免疫層析試紙條插入微孔中,5種毒素的金標(biāo)抗體-目標(biāo)毒素復(fù)合物從樣品墊端向吸水墊端移動。在向上遷移的過程中,被結(jié)合的金標(biāo)抗體不會與固定在硝酸纖維素膜T線上的包被原(AFB1-BSA、FB1-BSA、T-2-BSA、DON-BSA和ZEN-BSA)發(fā)生特異性結(jié)合,T線不顯色;而金標(biāo)抗體-目標(biāo)毒素復(fù)合物將與羊抗鼠二抗IgG發(fā)生反應(yīng),C線顯色。當(dāng)沒有目標(biāo)物或者濃度非常低時,大部分的金標(biāo)抗體處于游離狀態(tài),在自下而上流經(jīng)硝酸纖維素膜,與T線上的各毒素包被原發(fā)生特異性抗原抗體反應(yīng),形成金標(biāo)抗體-毒素包被原復(fù)合物,而多余的金標(biāo)抗體將被控制線上的羊抗鼠二抗IgG結(jié)合,從而在T線和C線位置上顯示出明顯的紅色條帶。待測樣品中目標(biāo)毒素的含量與T線條帶的顯色值呈反比例關(guān)系。

玉米基質(zhì)中5種真菌毒素多重檢測膠體金試紙條實驗結(jié)果見圖2。當(dāng)檢測溶液中AFB1、FB1、T-2、DON和ZEN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4.0、50.0、5.0、20.0、10.0 ng/mL時,T線顏色基本完全消失。根據(jù)樣品提取稀釋倍數(shù)換算,相當(dāng)于玉米樣品中同時含有AFB1、FB1、T-2、DON、ZEN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為80.0、1 000.0、100.0、400.0、200.0 μg/kg時,免疫膠體金試紙條上的5條檢測線顏色基本完全消失。

圖2 膠體金免疫層析試紙條同步檢測玉米基質(zhì)中5種不同濃度的真菌毒素

使用Image J提取多重檢測試紙條檢測線的灰度面積,根據(jù)檢測樣品溶液濃度和對應(yīng)的面積建立玉米基質(zhì)中五種真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見圖3。當(dāng)玉米樣品中AFB1、FB1、T-2、DON和ZEN的值分別為8.0、20.0、10.0、40.0、20.0 μg/kg時,各真菌毒素對應(yīng)的T線顯色值明顯比陰性對照顯色值淺,表明應(yīng)用軟件分析檢測線灰度值的變化,可以獲得更低的檢測限。

圖3 玉米基質(zhì)中5種真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 應(yīng)用多重膠體金試紙條檢測玉米樣品中5種真菌毒素

對11個玉米樣品用多重膠體金試紙條方法進行檢測,用手機記錄檢測結(jié)果,并進行肉眼觀察判定,結(jié)果見圖4。

圖4 多重膠體金試紙條檢測實際玉米樣品中的5種真菌毒素

由檢測結(jié)果可知,部分樣品中DON和ZEN濃度超過消線值,表明實際樣品中這2種毒素存在高濃度的污染;同時,用Image J軟件提取天然污染玉米樣品的灰度值,結(jié)合玉米基質(zhì)多毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線進行計算,可以得出污染玉米樣品中真菌毒素的濃度值。分析實際樣品的檢測結(jié)果表明,1號玉米樣品中,DON、ZEN的灰度值為0,肉眼可觀察到檢測線消失,因此可以判定DON質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于400 μg/kg,ZEN質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于200 μg/kg。同理,樣品3、4、5、6中DON質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于400μg/kg,ZEN質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于200 μg/kg。樣品2中AFB1的灰度值192.61,結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線可知,AFB1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為100 μg/kg。樣品7中DON和ZEN的灰度值分別為72.95和156.78,結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線知,DON的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于400 μg/kg,ZEN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為95 μg/kg。樣品8中DON的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于400 μg/kg,ZEN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為70 μg/kg,樣品9中,ZEN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為160 μg/kg,樣品10中,ZEN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為120 μg/kg,樣品11中,DON的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于400 μg/kg。11個樣品中,除樣品2以外,其他樣品中的ZEN和DON含量較高。樣品2雖受到ZEN和DON毒素的污染較小,但AFB1毒素污染的程度較重,不適合用于直接消費或作為食品原料使用。

3 結(jié)論

本研究優(yōu)化了適用于玉米樣品中多種真菌毒素同時提取的樣品提取溶劑并進行添加回收實驗,建立5種真菌毒素同時檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用優(yōu)化后的最佳提取溶劑對11個玉米實際樣品進行前處理,結(jié)合膠體金試紙條對其進行檢測,發(fā)現(xiàn)樣品中存在不同程度的AFB1、DON和ZEN污染。本研究所研制的多重膠體金試紙條能用于玉米的現(xiàn)場快速檢測,并結(jié)合Image J軟件能夠進行定量分析。