胡 貝, 李麗霞, 丁曉萍, 劉 紅, 黃 偉, 呂 穩(wěn), 李曉健

(湖北省藥品監(jiān)督檢驗研究院, 湖北省藥品質(zhì)量檢測與控制工程技術(shù)研究中心, 湖北 武漢 430075)

《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)[1]是國家及省級化妝品監(jiān)督抽檢工作的檢驗和判定依據(jù),其中列出的禁用原料按是否具有功效分為兩類:一類在化妝品中不具有功效,且不太可能以原料或雜質(zhì)的形式出現(xiàn)在化妝品中;另一類在化妝品中具有一定的功效,如具有美白祛斑、抗菌消炎、抗過敏、改善紅血絲、舒緩助眠和增加香味等功能。目前,許多禁用原料在《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)中尚無檢測方法,但已有學(xué)者檢出了非法添加標準方法以外的禁用原料[2-4],因此,化妝品禁用原料的篩查范圍亟待擴展,篩查維度也亟需加大。

目前,化妝品中多類別禁用原料的同時檢測方法主要有液相色譜-高分辨質(zhì)譜法[5-7]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-11]。液相色譜-高分辨質(zhì)譜法可以獲得精確的質(zhì)量數(shù),為目標化合物乃至未知物分析提供全面的數(shù)據(jù)[12],但儀器價格昂貴,檢驗成本高,在方法推廣上有一定難度。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有特異性好、靈敏度高等優(yōu)點,能快速、準確地定量化妝品中的禁用原料,在化妝品中性激素類[13-15]、抗感染類[16,17]、抗組胺類[18-19]、鎮(zhèn)痛類[20]等藥物的檢測方面均有應(yīng)用,是目前化妝品禁用原料檢測標準方法建立和日常監(jiān)督檢驗的首選方法。

本文基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜,通過優(yōu)化前處理和儀器條件,建立了化妝品中87種禁用原料的分析方法。87種禁用原料分別為33種性激素類、20種抗感染類、15種抗組胺類、7種香豆素類、4種鎮(zhèn)靜催眠類、4種解熱鎮(zhèn)痛類、2種致敏類藥物及2種具有收縮血管作用的藥物。本方法適用于3類常見化妝品基質(zhì)(水基類、乳液膏霜類和油基類)的檢測,可為化妝品中禁用原料的快速風(fēng)險篩查和高效日常監(jiān)管提供技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Acquity UPLC H-CLASS超高效液相色譜儀、Xevo TQ-S質(zhì)譜儀(美國Waters公司); HMV-50A多管漩渦混合器(上海珂淮儀器有限公司); LC-250超聲波清洗器(山東濟寧魯超超聲設(shè)備有限公司); ST16臺式離心機(德國Thermo Fisher Scientific公司); Milli-Q純水機(美國Millipore公司)。

甲醇和乙腈(色譜純,德國默克公司);正己烷(分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司);實驗用水為GB/T 6682中規(guī)定的一級水。87種禁用原料標準品購自中國食品藥品檢定研究院、德國Dr. Ehrenstorfer公司、壇墨質(zhì)檢標準物質(zhì)中心、上海義淮生物有限公司、廣州佳途科技股份有限公司、上海甄準生物科技有限公司、上海安譜璀世標準技術(shù)服務(wù)有限公司、上海源葉生物科技有限公司、天津阿爾塔科技有限公司和美國Stanford Chemicals公司,純度為95.0%～99.9%(CAS號見表1)。

表1 87種禁用原料的CAS號、保留時間和質(zhì)譜參數(shù)

1.2 標準溶液的配制

1.2.1標準儲備溶液

分別準確稱取10 mg標準品(精確至0.01 mg)置于10 mL容量瓶中,加入乙腈溶解(其中在乙腈中溶解較差的洛美沙星、司帕沙星、氟甲喹、麻保沙星、達氟沙星和加替沙星可以加入少量甲酸促進溶解),定容至刻度并搖勻,配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標準儲備溶液,于-20 ℃下冷凍保存。

1.2.2單標溶液

使用時準確移取20 μL各標準儲備溶液,分別置于不同的10 mL容量瓶中,用乙腈稀釋定容并搖勻,配制成質(zhì)量濃度為2 mg/L的各單標中間溶液。再準確移取1 mL各單標中間溶液分別置于不同的10 mL容量瓶中,用乙腈稀釋定容并搖勻,配制成質(zhì)量濃度為200 μg/L的各單標溶液。

1.2.3混合標準溶液及基質(zhì)匹配標準溶液

使用時準確移取0.1 mL各標準儲備溶液,置于10 mL容量瓶中,用乙腈稀釋定容并搖勻,配制成質(zhì)量濃度為10 mg/L的混合標準中間溶液;再準確移取1 mL混合標準中間溶液,置于10 mL容量瓶中,用乙腈稀釋定容并搖勻,配制成質(zhì)量濃度為1 mg/L的混合標準溶液。臨用前,用空白基質(zhì)提取液稀釋混合標準溶液,配制成所需質(zhì)量濃度的基質(zhì)匹配標準溶液。

1.3 樣品前處理

水基類和乳液膏霜類:稱取0.2 g樣品(精確至0.000 1 g)置于10 mL具塞比色管中,加入2 mL乙腈渦旋分散均勻后,再加入50%乙腈水溶液至近刻度,超聲提取20 min,靜置至室溫;之后用50%乙腈水溶液定容至刻度,搖勻,以8 000 r/min離心5 min,取上清液過0.22 μm有機濾膜,濾液作為供試品溶液備用。

油基類:稱取0.2 g樣品(精確至0.000 1 g)置于15 mL具塞離心管中,加入2 mL正己烷渦旋分散均勻后,再加入3 mL 70%乙腈水溶液渦旋2 min,以8 000 r/min離心5 min;用膠頭滴管移取下層溶液至10 mL具塞比色管中,再在上層正己烷層加入3 mL 70%乙腈水溶液渦旋2 min,以8 000 r/min離心5 min,用膠頭滴管移取下層溶液至同一10 mL具塞比色管中,加入50%乙腈水溶液定容至刻度,搖勻,過0.22 μm有機濾膜,濾液作為供試品溶液備用。

1.4 儀器條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:CORTECS C18色譜柱(150 mm×2.1 mm, 2.7 μm);流動相:A為乙腈,B為0.1%甲酸水溶液;柱溫:40 ℃;流速:0.3 mL/min;進樣體積:2 μL。梯度洗脫程序:0～2 min, 5%A; 2～4 min, 5%A～20%A; 4～13 min, 20%A～35%A; 13～16 min, 35%A; 16～18 min, 35%A～45%A; 18～26 min, 45%A～90%A; 26～31 min, 90%A; 31～31.1 min, 90%A～5%A; 31.1～33 min, 5%A。

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧電離(ESI)源,正、負離子掃描;檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;毛細管電壓:3.2 kV(正離子)和3.0 kV(負離子);脫溶劑氣流速:900 L/h;脫溶劑氣溫度:450 ℃;錐孔氣流速:150 L/h。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 UPLC-MS/MS條件優(yōu)化

2.1.1質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用電噴霧電離,分別將87種禁用原料的單標溶液(200 μg/L)注入離子源,在正、負離子掃描模式下對目標化合物進行一級質(zhì)譜全掃描。正離子模式下,目標化合物均產(chǎn)生[M+H]+準分子離子峰;負離子模式下,目標化合物均產(chǎn)生[M-H]-準分子離子峰。確定準分子離子峰后對錐孔電壓(CV)進行優(yōu)化,再進行二級質(zhì)譜掃描,選取豐度較高且干擾較小的2個子離子分別作為定性、定量離子,其中響應(yīng)較高的離子作為定量離子。再分別優(yōu)化2個子離子的碰撞能量(CE),經(jīng)優(yōu)化后得到的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.1.2色譜條件的優(yōu)化

根據(jù)相關(guān)文獻[5,6,8-11]及國家標準[1],同時分離激素類、抗感染類、抗組胺類和解熱鎮(zhèn)痛類藥物等多個類別禁用原料的流動相體系中,水相多采用含有不同體積分數(shù)的甲酸水溶液。本研究考察了0.1%甲酸水溶液和甲醇、0.1%甲酸水溶液和乙腈、0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈3種流動相體系對待測物峰形及響應(yīng)的影響。結(jié)果顯示,在流動相體系為0.1%甲酸水溶液和乙腈的條件下,87種目標物的響應(yīng)最好,且87種禁用原料中母離子和子離子質(zhì)荷比相同或相近的組分均可得到分離,87種禁用原料的總離子流色譜圖見圖1。

圖 1 87種禁用原料混合標準溶液的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion current chromatogram of mixed standard solution of the 87 prohibited ingredients

圖 2 乳液膏霜類基質(zhì)中87種禁用原料在不同提取溶劑下的加標回收率(n=6)Fig. 2 Spiked recoveries of the 87 prohibited ingredients with different extraction solvents in cream matrix (n=6)Compound Nos. 1-87 were the same as those in Table 1.

2.2 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.2.1水基類、乳液膏霜類樣品

提取溶劑的選擇 本研究所涉及的87種禁用原料中,大部分禁用原料在乙腈中有較好的溶解性。經(jīng)查閱相關(guān)文獻[13-15,17,20-25],本研究以乳液膏霜類樣品為典型基質(zhì),先加入適量1 mg/L的87種禁用原料混合標準溶液(加標水平均為2倍定量限(LOQ)),之后分別考察了用乙腈、50%乙腈水溶液、70%乙腈水溶液提取及先用乙腈提取再加水定容的4種提取方式對目標物提取效率的影響。結(jié)果顯示,使用乙腈和70%乙腈水溶液提取時,由于溶劑效應(yīng),部分出峰時間較早的化合物色譜峰變寬,峰形對稱性差。比較了用50%乙腈水溶液提取和先用乙腈提取再加水定容兩種提取方式下目標物的加標回收率,結(jié)果如圖2所示。在兩種提取方式下,87種禁用原料的加標回收率分別為91.7%～116.2%和81.8%～115.7%,相對標準偏差分別為0.7%～8.4%和1.2%～8.2%。使用50%乙腈水溶液進行提取時不僅回收率更高,且操作簡便、快捷,更符合化妝品快速篩查的目的,因此,選擇50%乙腈水溶液作為水基類和乳液膏霜類樣品的提取溶劑。

提取時間的選擇 以乳液膏霜類樣品為典型基質(zhì),考察了不同超聲提取時間(10、20、30 min)對87種禁用原料提取效率的影響。結(jié)果表明,以50%乙腈水溶液為提取溶劑、超聲提取20 min的條件下,絕大多數(shù)化合物可達最大提取效率。因此,實驗選擇超聲提取時間為20 min。

圖 3 油基類基質(zhì)中87種禁用原料在不同提取溶劑下的加標回收率(n=6)Fig. 3 Spiked recoveries of the 87 prohibited ingredients with different extraction solvents in oil matrix (n=6)Compound Nos. 1-87 were the same as those in Table 1.

2.2.2油基類樣品

提取溶劑的選擇 根據(jù)文獻[13,14]報道,本研究在空白油基類化妝品中先加入適量1 mg/L的87種禁用原料混合標準溶液(加標水平均為2倍LOQ),之后分別考察了不同體積分數(shù)(50%、70%、80%)的乙腈水溶液作為提取溶劑時對87種禁用原料提取效率的影響。結(jié)果如圖3所示,使用50%乙腈水溶液提取時,丙酸睪酮和苯丙酸諾龍的加標回收率僅為49.6%和42.4%;使用70%和80%乙腈水溶液提取時,87種禁用原料的加標回收率分別為83.6%～114.9%和78.3%～115.0%,相對標準偏差分別為1.4%～9.1%和0.8%～8.0%。由此可見,70%乙腈水溶液的提取效率更高,且在該提取溶劑下出峰時間較早的化合物的峰形對稱性更好。因此,選擇70%乙腈水溶液作為油基類樣品的提取溶劑。

提取次數(shù)的選擇 實驗分別考察了渦旋提取1、2、3次對87種禁用原料提取效率的影響。僅提取1次時,依美斯汀、丙酸諾龍、醋酸氯睪酮、丙酸睪酮和苯丙酸諾龍5個組分的回收率均小于80%;分別提取2次和3次時,87種禁用原料的加標回收率為83.7%～115.8%和82.0%～112.1%,相對標準偏差分別為0.9%～8.6%和0.6%～8.0%,由此可見,提取2次時已經(jīng)能夠滿足87種禁用原料篩查測定的要求。因此,為節(jié)省檢測時間,選擇渦旋提取次數(shù)為2次。

圖 4 水基類、乳液膏霜類和油基類樣品中87種禁用原料的基質(zhì)效應(yīng)Fig. 4 Matrix effects of the 87 prohibited ingredients in toner, cream and oil matricesCompound Nos. 1-87 were the same as those in Table 1.

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的考察

實驗分別考察了3類化妝品基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect, ME),并采用ME=基質(zhì)匹配標準曲線斜率/溶劑標準曲線斜率的計算方法對目標化合物的基質(zhì)效應(yīng)進行評價;其中,ME>1表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應(yīng),ME<1表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng);ME值越接近1,表示基質(zhì)效應(yīng)的影響越小,反之,則表明基質(zhì)效應(yīng)的影響越大[26]。實驗結(jié)果表明,3類化妝品基質(zhì)經(jīng)溶劑提取后均有部分共萃取基質(zhì)被提取,水基類、乳液膏霜類和油基類基質(zhì)的ME分別為0.58～1.82、0.68～7.15和0.89～1.55(圖4),均存在較明顯的基質(zhì)抑制或基質(zhì)增強效應(yīng)。因此,為了降低基質(zhì)效應(yīng)帶來的影響,本實驗采用基質(zhì)匹配標準溶液進行定量分析。

2.4 線性關(guān)系、檢出限及定量限

本實驗利用空白基質(zhì)(水基類、乳液膏霜類和油基類基質(zhì))提取液對87種禁用原料的混合標準溶液進行稀釋,配制成系列質(zhì)量濃度的基質(zhì)匹配標準溶液。以待測物的質(zhì)量濃度(x, μg/L)為橫坐標、定量離子對的峰面積(y)為縱坐標,繪制基質(zhì)匹配標準工作曲線。結(jié)果顯示,3種化妝品基質(zhì)中目標化合物在各自的線性范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.99。以信噪比≥3計算檢出限(LOD),以信噪比≥10計算LOQ, 87種禁用原料的LOD為0.07～0.38 μg/g,LOQ為0.21～1.15 μg/g。3種化妝品基質(zhì)中87種禁用原料的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、LOD和LOQ見表2。

2.5 回收率和精密度

在水基類、乳液膏霜類和油基類的空白樣品中分別添加低、中、高(1倍LOQ、2倍LOQ、10倍LOQ)3個水平的87種禁用原料混合標準溶液,根據(jù)所建立的方法進行加標回收試驗,每個加標水平重復(fù)測定6次,并計算回收率和相對標準偏差。結(jié)果如表3所示,水基類、乳液膏霜類和油基類樣品中87種禁用原料的回收率分別為84.8%～115.4%、82.0%～114.9%和81.7%～112.6%,相對標準偏差分別為0.4%～9.1%、0.4%～9.1%和0.6%～9.9%。以上結(jié)果表明,所建立的化妝品中87種禁用原料的高通量檢測方法準確、可靠,可用于實際樣品的分析。

2.6 實際樣品測定

采用所建立的方法對日常監(jiān)督抽檢中的349批化妝品進行分析,在8批樣品中檢出了禁用原料。其中,有2批樣品檢出甲氧芐啶,檢出含量分別為53.6 mg/g和15.0 mg/g;此外,1批樣品檢出特比萘芬,1批樣品檢出萘甲唑啉,3批樣品檢出7-甲氧基香豆素,1批樣品檢出7-甲基香豆素,檢出含量均大于LOD、小于LOQ。實驗結(jié)果表明,非法添加《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)標準方法以外的禁用原料的現(xiàn)象已經(jīng)較為普遍。因此,本方法的建立有利于加強化妝品安全監(jiān)管,為化妝品的風(fēng)險監(jiān)測和高通量篩查提供技術(shù)支撐。

3 結(jié)論

本研究建立了基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定化妝品中8類共87種禁用原料的方法。所建立的方法操作簡單、高效,定性、定量準確,適用于水基類、乳液膏霜類和油基類3類常見化妝品基質(zhì)的測定。本研究在進一步規(guī)范化妝品市場、服務(wù)化妝品安全監(jiān)管等方面具有較強的實用價值。