馮芳蘭

（甘肅省畜牧技術(shù)推廣總站，甘肅 蘭州 730030）

非洲豬瘟（African Swine fever，ASF）是豬的一種急性、熱性、高接觸性傳染病，已被證明對(duì)全球豬肉行業(yè)造成破壞性影響。20世紀(jì)20年代，在肯尼亞引進(jìn)歐洲家豬后，該病首次被發(fā)現(xiàn)[1]，之后ASF病毒蔓延到全球各地，影響著豬產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）是一種直徑為200 nm的二十面體DNA病毒，包括包膜、衣殼、內(nèi)囊膜、核殼和內(nèi)核。病毒基因組是一個(gè)長(zhǎng)度為170～190 kb的線性雙鏈DNA分子，兩端共價(jià)閉合。根據(jù)病毒株的不同，編碼150～200種病毒蛋白，包括68種結(jié)構(gòu)蛋白和100多種非結(jié)構(gòu)蛋白[2-5]。ASFV基因組中某些序列的重復(fù)和丟失是導(dǎo)致不同來(lái)源或同一品系的世代ASFV菌株差異的因素之一[6]。p72是ASFV主要的衣殼蛋白，因其保守性而用于血清分型。單核-巨噬細(xì)胞是ASFV的主要靶細(xì)胞[7]。ASFV感染宿主細(xì)胞的分子機(jī)制尚不清楚。網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞途徑和大細(xì)胞吞噬途徑是ASFV侵襲的可能途徑。然而介導(dǎo)這一過(guò)程的細(xì)胞膜受體和病毒蛋白仍然未知。截至目前，仍然沒有有效的疫苗或抗病毒藥物來(lái)預(yù)防或治療非洲豬瘟。復(fù)雜的病毒基因組及其調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)的能力可能是開發(fā)疫苗困難的原因。

1 ASFV感染機(jī)制

病毒成功感染宿主細(xì)胞必須經(jīng)歷6個(gè)過(guò)程，包括吸附、滲透、脫衣、生物合成、包裝和脫落。ASFV在與宿主受體結(jié)合后或通過(guò)巨噬細(xì)胞增多途徑被內(nèi)化。病毒粒子在感染1～30 min時(shí)進(jìn)入早期核內(nèi)體，并在30～90 min運(yùn)輸?shù)酵砥诤藘?nèi)體。之后，ASFV完成了晚期核內(nèi)體的脫殼和基因組釋放?；虮磉_(dá)可分為3個(gè)階段：早期、中期和晚期。早期基因表達(dá)發(fā)生在感染后的4～6 h，主要編碼ASFV復(fù)制相關(guān)蛋白，隨后在感染后的6～8 h復(fù)制ASFV基因組。基因組復(fù)制首先發(fā)生在細(xì)胞核中（主要在細(xì)胞質(zhì)），復(fù)制后，編碼病毒顆粒結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白的中晚期基因在8～16 h開始表達(dá)。在16～24 h，病毒顆粒在病毒工廠聚集。大約24 h后，組裝好的病毒顆粒從細(xì)胞膜上發(fā)芽，釋放到細(xì)胞外[8]。單核巨噬細(xì)胞是ASFV的主要宿主細(xì)胞。此外，ASFV還感染次要靶細(xì)胞，如血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞或上皮細(xì)胞[9]。

2 ASFV入侵機(jī)制

研究表明，ASFV進(jìn)入宿主細(xì)胞是一種受體介導(dǎo)的內(nèi)吞過(guò)程，依賴于溫度、能量、膽固醇和低pH值，相關(guān)研究將這一過(guò)程描述為網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞作用（CME）和巨胞飲作用。CME和巨胞飲作用都需要?jiǎng)恿λ?。幾種藥物抑制劑和特異性蛋白對(duì)ASFV進(jìn)入所需的抑制關(guān)鍵蛋白具有明顯的負(fù)作用，表明ASFV進(jìn)入的主要途徑是巨胞飲作用。巨胞飲作用依賴于肌動(dòng)蛋白的重排，還涉及膽固醇、鈉/質(zhì)子交換器（Na/H）、EGFR、PKC、磷酸化PI3K、Pak1激酶和小Rho-GTPase Rac1的激活[10]。但在一些研究中，純化的病毒顆粒在Vero細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中沒有引起顯著的巨胞飲作用[11]。臨床癥狀提示ASFV感染的巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出抗體依賴性增強(qiáng)作用（ADE），也就是說(shuō)，F(xiàn)c受體可能參與該過(guò)程，但需要進(jìn)一步的研究來(lái)驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)[12]?？贵w依賴性增強(qiáng)作用說(shuō)明ASFV更喜歡利用不同的途徑來(lái)提高其感染各種靶細(xì)胞的能力，并適應(yīng)感染過(guò)程中不斷變化的條件。

3 ASFV在宿主細(xì)胞中的傳播機(jī)制

病毒粒子從早期核內(nèi)體到病毒工廠再到細(xì)胞膜的運(yùn)輸取決于微管的功能[13]。病毒粒子內(nèi)化后，囊泡在細(xì)胞中依次形成早期核內(nèi)體（EE）、成熟核內(nèi)體（ME）和晚期核內(nèi)體（LE）。隨著含ASFV的EEs成熟為L(zhǎng)Es，核內(nèi)體腔逐漸酸化，核內(nèi)體膜表面的分子標(biāo)記物逐漸改變，最終在酸性環(huán)境中病毒顆粒脫殼。ASFV感染會(huì)重新分布整個(gè)囊泡系統(tǒng)，因此病毒顆?？梢院苋菀椎乇贿\(yùn)輸?shù)胶酥軈^(qū)[14]。感染早期，衣殼蛋白和內(nèi)包膜蛋白立即與特定標(biāo)記物共同定位，如EE和大粒細(xì)胞體中的EEA1和Rab5。感染晚期，病毒內(nèi)包膜蛋白（p17）或核殼蛋白（p150）與晚期內(nèi)體標(biāo)記物（Rab7）和溶酶體標(biāo)記物（Lamp1）共同定位，后者是ASFV感染的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[15-19]。病毒顆粒在病毒工廠（VF）中組裝后，驅(qū)動(dòng)蛋白使用多端微管馬達(dá)將“貨物”從病毒工廠運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜。此外，ASFV還可以通過(guò)過(guò)度乙?；⒐軄?lái)增加微管的穩(wěn)定性，以確保成熟的病毒顆粒被運(yùn)輸?shù)劫|(zhì)膜上。肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架被認(rèn)為是病毒逆行運(yùn)輸?shù)囊环N可能的替代途徑[20]。

4 ASFV在宿主細(xì)胞中的復(fù)制及基因表達(dá)機(jī)制

ASFV從核內(nèi)體釋放出來(lái)，通過(guò)病毒內(nèi)膜蛋白pE183L（p54）結(jié)合微管動(dòng)力蛋白激活微管系統(tǒng)，遷移到核周微管組織中進(jìn)行DNA復(fù)制和生物合成[21-25]。病毒基因的表達(dá)分為4個(gè)階段：即刻、早期、中期和晚期。早期基因在病毒感染的4～6 h表達(dá)，包括病毒基因組復(fù)制所需的蛋白質(zhì)和酶，晚期基因的表達(dá)與免疫逃避的多基因家族相關(guān)。ASFV感染6～8 h后，病毒開始復(fù)制。雖然ASFV的復(fù)制主要發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)的VF中，但在早期的細(xì)胞核中也有短暫的復(fù)制時(shí)刻。8～16 h后，中晚期基因開始表達(dá)，合成形成新生病毒所需的結(jié)構(gòu)蛋白和包裝在病毒顆粒中的早期轉(zhuǎn)錄因子[26]。通過(guò)質(zhì)譜分析，共有68種病毒蛋白，包括結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，其是病毒轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)和蛋白質(zhì)修飾不可或缺的重要組成部分[27]。

5 ASFV病毒工廠形成機(jī)制

ASFV劫持并改變細(xì)胞反式高爾基體核內(nèi)體網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)以促進(jìn)病毒感染。宿主適配器蛋白AP-1介導(dǎo)蛋白質(zhì)從trans-Golgi網(wǎng)絡(luò)（TGN）到核內(nèi)體的轉(zhuǎn)運(yùn)，吸收網(wǎng)格蛋白形成網(wǎng)格蛋白包被的小泡，通過(guò)識(shí)別蛋白質(zhì)分選信號(hào)進(jìn)行選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)。AP-1在小GTP酶ADP核糖基化因子1（Arf1）的調(diào)控下被招募到TNG膜。細(xì)胞內(nèi)AP-1定位和細(xì)胞內(nèi)網(wǎng)格蛋白包被的體/核內(nèi)體遷移由于外包膜蛋白CD2v和AP-1之間的相互作用，可誘導(dǎo)新的膜結(jié)構(gòu)形成[28]。

相關(guān)研究表明，各種形式和小型的ASFV膜碎片的結(jié)構(gòu)和功能參與病毒工廠形成的早期過(guò)程，先形成彎曲的膜，再形成組裝中間產(chǎn)物。這些膜的組裝中間體積累和聚集形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[29]。病毒工廠是存在于微管組織中心（MTOC）[30]的單個(gè)并且比較大的核周結(jié)構(gòu)，病毒在這里完成復(fù)制以及新合成病毒體的組裝。病毒工廠膜結(jié)構(gòu)中存在結(jié)構(gòu)蛋白p54和p34，共聚焦顯微鏡顯示病毒工廠中的p72和p54在形態(tài)上是不同的，p72為點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，而p54為多態(tài)結(jié)構(gòu)，可能是p54與新形成的病毒顆粒之間的連接有關(guān)[31]。ASFV感染會(huì)改變細(xì)胞內(nèi)膽固醇的分布[32]。膽固醇對(duì)細(xì)胞的攝入是病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞、復(fù)制和形成病毒工廠的關(guān)鍵。相反，膽固醇不允許在核內(nèi)體積聚，否則病毒顆粒將滯留在核內(nèi)體。大量的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白，如羥甾醇結(jié)合蛋白（OSBP），介導(dǎo)病毒工廠中的脂質(zhì)和離子交換。病毒利用膜接觸位點(diǎn)（MCS）確保脂質(zhì)轉(zhuǎn)移到病毒工廠[33-34]。病毒顆粒招募PI4P激酶形成大量的PI4P聚集體，然后聚集PI4P蛋白形成大量MCS，MCS通過(guò)膽固醇和PI4P交換積累膽固醇。此外，在ASFV感染細(xì)胞的室顫中發(fā)現(xiàn)了完成脂質(zhì)交換和磷脂酰肌醇-4激酶β（PI4Kβ）所需的含有ACBD3的酰基輔酶A結(jié)合域。研究表明，ASFV編碼的g5Rp具有1個(gè)Nudix水解基序，該基序可能在調(diào)節(jié)病毒形態(tài)中起作用，涉及二磷酸肌醇多磷酸鹽介導(dǎo)的膜轉(zhuǎn)運(yùn)[35]。ASFV j4R蛋白與新生多肽相關(guān)復(fù)合體（NAC）的α鏈相互作用，這表明j4R可能參與新合成蛋白向病毒工廠的轉(zhuǎn)運(yùn)[36]。完整的病毒工廠是缺乏外部限制膜的單個(gè)結(jié)構(gòu)，由線粒體和波形蛋白包圍，其提供病毒工廠的物理支架或阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[37-38]。病毒感染期間病毒工廠的形態(tài)發(fā)生變化。由于病毒工廠形成，宿主細(xì)胞的重排機(jī)制以及病毒工廠與宿主細(xì)胞膜的關(guān)系仍不清楚[39]。

6 ASFV免疫調(diào)節(jié)機(jī)制

ASFV感染豬巨噬細(xì)胞后，宿主首先誘導(dǎo)先天性免疫反應(yīng)，然后產(chǎn)生適應(yīng)性免疫反應(yīng)[40]。ASFV的基因組是DNA，這可能被cGAS（DNA的一種模式識(shí)別受體）識(shí)別為病原體相關(guān)分子模式（PAMP），然后通過(guò)cGAS/STING信號(hào)通路激活I(lǐng)型IFN的表達(dá)。I型干擾素的下游抗病毒基因，如IFIT家族也被激活和表達(dá)。I型干擾素和干擾素刺激基因（ISG）可以抵抗ASFV感染。巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞是ASFV感染誘導(dǎo)的自然免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)細(xì)胞。巨噬細(xì)胞能夠釋放一系列細(xì)胞因子，如IL-1a、IL-1b和IL-18，并表達(dá)MHCI以啟動(dòng)適應(yīng)性免疫反應(yīng)。漿細(xì)胞樣DC（pDC）和自然殺傷細(xì)胞（NK）可以產(chǎn)生大量干擾素來(lái)抵抗ASFV感染。ASFV感染8 d后，抗體水平逐漸升高，這表明宿主存在體液免疫應(yīng)答。這些中和抗體有一定的保護(hù)作用。此外，細(xì)胞免疫，如CD8+T細(xì)胞，在ASFV感染中也起著重要的抗病毒作用。CD4+CD8+雙陽(yáng)性T細(xì)胞可分泌穿孔素和顆粒酶，這也可能在抵抗ASFV感染中發(fā)揮作用[41]。然而，為了生存并產(chǎn)生后代病毒，親本病毒編碼各種蛋白質(zhì)以逃避宿主的免疫反應(yīng)。

迄今為止，還沒有針對(duì)ASFV的有效疫苗，這使得ASF的預(yù)防或控制變得困難。因此，ASFV的基礎(chǔ)研究仍需為疫苗研究提供理論依據(jù)。一方面，ASFV在宿主細(xì)胞中的生命周期需要進(jìn)一步研究；另一方面，宿主對(duì)ASFV的免疫應(yīng)答以及ASFV進(jìn)化的免疫抑制機(jī)制有待進(jìn)一步研究。雖然ASFV感染細(xì)胞的詳細(xì)過(guò)程在以往的研究中已被描述，但涉及的細(xì)胞和病毒蛋白仍是未知的?？赡苡卸鄠€(gè)分子作為受體或共受體參與病毒感染過(guò)程。參與進(jìn)入宿主細(xì)胞的病毒蛋白可作為ASFV衰減的靶點(diǎn)，這為成功開發(fā)疫苗提供了可能性。ASFV成功進(jìn)入宿主細(xì)胞后，在核周區(qū)附近形成VF，這是新生病毒組裝所必需的。然而，VF膜結(jié)構(gòu)的形成機(jī)理尚不清楚。此外，ASFV也在細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制，ASFV DNA進(jìn)入細(xì)胞核可能與可以進(jìn)入細(xì)胞核的病毒蛋白p37、p14和p10有關(guān)[42]。然而，病毒蛋白介導(dǎo)的大病毒DNA到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)、DNA復(fù)制和DNA到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)有待進(jìn)一步研究。眾所周知，ASFV入侵機(jī)體會(huì)產(chǎn)生一系列抗病毒反應(yīng)，而ASFV也能形成自身的免疫逃逸機(jī)制對(duì)抗抗病毒反應(yīng)。此外，一些ASFV基因還可以通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子（如IRF3和NFkB）抑制巨噬細(xì)胞I型IFN的產(chǎn)生。ASFV的免疫侵襲和免疫抑制機(jī)制已部分闡明，但仍不清楚。ASFV通常以幾種方式抑制某些抗病毒蛋白或免疫反應(yīng)的表達(dá)。如A276R、I329L通過(guò)不同機(jī)制抑制IFN-b的表達(dá)，A179L、A224L、DP71L抑制細(xì)胞凋亡。這種冗余可能也是疫苗開發(fā)困難的原因之一。因此，研究ASFV編碼蛋白的功能，特別是介導(dǎo)ASFV免疫逃逸和免疫抑制的蛋白，對(duì)ASFV減毒活疫苗的開發(fā)和設(shè)計(jì)具有重要意義。