鞏長(zhǎng)芹，卞常芝，毛傳偉，孫永喜

（1.臨沂市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 臨沂 276001；2.臨沂天源中藥飲片有限公司，山東 臨沂 276000；3.翔宇藥業(yè)股份有限公司，山東 臨沂 276023）

保心寧膠囊是由丹參干浸膏、當(dāng)歸干浸膏、枳殼干浸膏及三七藥材粉末加入生姜水煎濃縮液組成的中藥復(fù)方膠囊劑，具有活血化瘀，行氣止痛之功效，用于心絞痛，心律失常，改善冠心病癥狀等[1]。其標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第十一冊(cè)，僅有性狀、紫外光譜鑒別、化學(xué)反應(yīng)鑒別和檢查項(xiàng)，無含量測(cè)定項(xiàng)，不能有效控制該產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量。通過檢索文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)目前已有對(duì)本制劑中的某些成分進(jìn)行含量測(cè)定的報(bào)道[2-4]，但不能全面監(jiān)測(cè)本制劑的質(zhì)量。本文以丹參素、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B和丹參酮IIA7個(gè)指標(biāo)性成分為檢測(cè)目標(biāo)，進(jìn)行含量測(cè)定，為本制劑的內(nèi)在質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（配備Agilent 1260四元泵，Agilent 1260 DAD檢測(cè)器，Agilent四元在線脫氣機(jī)，Agilent Chemstation工作站），Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱（美國(guó)安捷倫科技公司）；XS 205DU電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q超純水機(jī)（默克公司）。

1.2 藥品與試劑

保心寧膠囊（翔宇藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：200201，201001，210301，210302，210303，210901，210902，210903，220101）。丹參素鈉對(duì)照品（批號(hào)：110855-201915，含量以97.8 %計(jì)），柚皮苷對(duì)照品（批號(hào)：110722-202116，含量以93.5%計(jì)），橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)：110721-202019，含量以95.3%計(jì)），新橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)：111857-201804，含量以99.4 %計(jì)），迷迭香酸對(duì)照品（批號(hào)：111871-202007，含量以98.1%計(jì)）、丹酚酸B對(duì)照品（批號(hào)：111562-201917，含量以96.6 %計(jì)），丹參酮IIA對(duì)照品（批號(hào)：110766-202022，含量以98.9 %計(jì)）等均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，均為供含量測(cè)定用；甲醇、乙腈均為色譜純（默克公司），磷酸為色譜純[阿拉丁試劑（上海）有限公司]，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAXSB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1 %磷酸溶液（B），梯度洗脫（見表1）；流速；1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：283 nm（0～50 min，檢測(cè)丹參素、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B），270 nm（50～70 min，檢測(cè)丹參酮IIA）；進(jìn)樣量：10 μl。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取丹參素鈉對(duì)照品19.12 mg、柚皮苷對(duì)照品38.40 mg、橙皮苷對(duì)照品10.75 mg、新橙皮苷對(duì)照品28.53 mg、迷迭香酸對(duì)照品11.19 mg、丹酚酸B對(duì)照品29.08 mg、丹參酮IIA對(duì)照品11.30 mg，分別置50 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，均作為各自的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

分別精密量取丹參素鈉對(duì)照品儲(chǔ)備液5 ml、橙皮苷對(duì)照品儲(chǔ)備液5 ml、迷迭香酸對(duì)照品儲(chǔ)備液5 ml、丹參酮IIA對(duì)照品儲(chǔ)備液5 ml、柚皮苷對(duì)照品儲(chǔ)備液10 ml、丹酚酸B對(duì)照品儲(chǔ)備液10 ml、新橙皮苷對(duì)照品儲(chǔ)備液10 ml，置同一50 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，混勻，作為混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的配制 取保心寧膠囊10粒，精密稱定內(nèi)容物重量，混勻，研細(xì)，精密稱取0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml，稱定重量，超聲（功率300 W，頻率40 kHz）提取30 min，放冷至室溫，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性溶液的配制 按保心寧膠囊的處方和工藝要求，分別制備缺少丹參和枳殼的陰性樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制成陰性溶液。

2.3 干擾試驗(yàn)

分別取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果在供試品色譜圖中，呈現(xiàn)與混合對(duì)照品保留時(shí)間一致的特征峰，陰性溶液未呈現(xiàn)與對(duì)照品保留時(shí)間一致的特征峰，說明陰性樣品對(duì)所測(cè)組分沒有干擾，理論塔板數(shù)均大于10 000；7種成分的分離度均大于2.0。色譜圖見圖1。

圖1 干擾試驗(yàn)HPLC圖譜

2.4 線性關(guān)系

取混合對(duì)照品溶液0.2，0.5，1.0，2.5，4.0，5.0 ml，分別置5 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以進(jìn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程。結(jié)果見表2。

表2 回歸方程及其范圍

2.5 精密度

取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量為10 μl，記錄峰面積。結(jié)果丹參素、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、丹參酮IIA峰面積平均值分別為107.6，1030，152.9，922.7，64.37，363.6，215.6，RSD分別為0.73 %，0.59 %，0.71 %，0.47 %，0.88 %，1.19 %，1.03 %，表明儀器精密度較好。

2.6 重復(fù)性

分別精密稱取同一樣品6份（批號(hào)：210901），按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量為10 μl。結(jié)果丹參素、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、丹參酮IIA峰面積平均值分別為106.3，1926，189.1，1830，64.81，636.5，294.3，平均含量分別為1.491，12.035，1.136，10.081，0.991，8.814，1.367 mg/粒；RSD分別為0.57 %，0.68 %，0.56 %，0.86 %，1.13 %，1.07 %，1.23 %，表明方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性

取同一樣品（批號(hào)：210901）溶液，置室溫中，分別在配制后0，2，4，6，8，10，12，24 h，進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量為10 μl，記錄峰面積。結(jié)果丹參素、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、丹參酮IIA峰面積的平均值分別為105.9，1913，187.6，1807，65.67，621.7，289.8，RSD分別為0.27 %，0.49 %，0.57 %，0.90 %，0.94 %，1.67 %，1.09 %，表明供試品溶液24 h內(nèi)比較穩(wěn)定。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

取已知含量的同一樣品6份（批號(hào)：210901），精密稱取0.1 g，置具塞錐形瓶中，每份分別精密加入各對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別為丹參素1 ml、柚皮苷3.5 ml、橙皮苷1 ml、新橙皮苷4 ml、迷迭香酸1 ml、丹酚酸B 3.5 ml、丹參酮IIA1.5 ml，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量為10 μl。結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，方法準(zhǔn)確度良好。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.9 含量測(cè)定

取9 批次保心寧膠囊（批號(hào)：200201，201001，210301，210302，210303，210901，210902，210903，220101），按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量為10 μl，記錄各峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見表4。

表4 含量測(cè)定結(jié)果（n=2）

3 討論

3.1 波長(zhǎng)的選擇

對(duì)丹參素、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、丹參酮IIA7種成分在190～400 nm進(jìn)行DAD全波長(zhǎng)掃描，得到柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷3種成分在283 nm、丹參素在280 nm、迷迭香酸和丹酚酸B在286 nm、丹參酮IIA在270 nm處各有最大吸收，但丹參素、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B 6種成分的最大吸收波長(zhǎng)相差無幾，在283 nm處均有明顯吸收，因此選擇283 nm作為此6種成分的測(cè)定波長(zhǎng)，選擇270 nm作為丹參酮IIA測(cè)定波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的選擇

參考《中國(guó)藥典》和相關(guān)文獻(xiàn)[5-15]，確定采用梯度洗脫模式，并對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行篩選，包括乙腈-0.1 %磷酸溶液、乙腈-0.4 %磷酸溶液、乙腈-0.2 %磷酸溶液、乙腈-20 %乙腈溶液（溶劑為含0.08 %十二烷基硫酸鈉的2.4 %冰醋酸）、甲醇-0.2 %甲酸溶液，結(jié)果以乙腈-0.1 %磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，7種成分峰形好，各峰分離度高，陰性樣品沒有干擾。

3.3 提取條件的選擇

參考相關(guān)文獻(xiàn)[2-21]，考察了50 %甲醇、70 %甲醇、甲醇、50 %乙醇、乙醇作為提取溶劑，以及提取溶劑的不同用量（20，25，50，100 ml）對(duì)提取效果的影響，結(jié)果用50 ml甲醇作為提取溶劑，提取率最高；考察了超聲時(shí)間（20，30，45，60 min）對(duì)提取率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入50 ml甲醇超聲處理30 min之后，測(cè)得的結(jié)果相差很小，故選擇加入50 ml甲醇超聲處理30 min提取樣品。