潘瑞雪，江玉娟，許 敏，王 莉，袁倩倩，高 超，崔 陽，劉 杰

（山東明仁福瑞達制藥股份有限公司 山東省骨科疼痛類藥物工程研究中心，山東 濟南 250104）

他達拉非是磷酸二酯酶（PDE5）的選擇性抑制劑，用于治療男性勃起功能障礙及勃起功能障礙合并良性前列腺增生的癥狀和體征，與其他同類藥物相比，他達拉非具有選擇性高、半衰期長、耐受性好等優(yōu)點[1-2]。他達拉非片原研公司為美國禮來，2002年11月在歐盟15個成員國獲準上市；2003年11月獲美國FDA批準上市，2004年12月獲批進口中國[3]。

近年，仿制藥質(zhì)量和療效一致性評價工作不斷推進。本研究以國家藥品監(jiān)督管理局公布的參比制劑目錄為依據(jù)，選定由禮來公司生產(chǎn)的希愛力作為參比制劑，仿制了規(guī)格為20 mg的他達拉非片。參考國家頒布的相關指導原則[4-5]，通過槳法研究他達拉非片在不同pH介質(zhì)中的溶出行為，建立了他達拉非片具有區(qū)分力的溶出度檢查法，以期為后續(xù)仿制藥一致性評價提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-2040C 3D型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Logan 812A-12型智能溶出儀（美國LOGAN公司）；XPE205型電子天平（梅特勒-托利多公司）；ZWY-111B型恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智誠）。

1.2 藥品與試劑

他達拉非對照品（E P 標準物質(zhì)，批號：2.0）；他達拉非原料藥（山東海佑福瑞達制藥有限公司，批號：20170908）；他達拉非自制片（山東明仁福瑞達制藥股份有限公司，批號：20041601，20051801，20051901）；他達拉非參比制劑（美國禮來公司，商品名希愛力，批號：D189502）；十二烷基硫酸鈉（SDS，西隴科學，化學純）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用高效液相色譜法（HPLC）檢測他達拉非溶解度及他達拉非片溶出度。色譜柱：Agilent Zorbax SB-C8柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）；流動相：甲醇-水（65:35）；檢測波長：225 nm；流速：1.0 ml/min；進樣量20 μl。

2.2 溶出介質(zhì)配制

0.2 %SDS水溶液：精密稱取SDS 2.0 g，加水適量溶解，并用水稀釋至1000 ml，搖勻。

0.2 %SDS鹽酸溶液（pH 1.2）：精密量取鹽酸7.65 ml，加水適量稀釋，加入SDS 2.0 g，用水溶解并稀釋至1000 ml，搖勻。

0.2 %SDS醋酸鹽緩沖液（pH 4.5）：精密量取2 mol/L醋酸溶液（取冰醋酸120.0 g或114 ml，用水稀釋至1000 ml）14 ml，加入醋酸鈉2.99 g，加水適量使溶解，加入SDS 2.0 g，用水溶解并稀釋至1000 ml，搖勻。

0.2 %SDS磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）：取0.2 mol/L磷酸二氫鈉溶液（取磷酸二氫鈉24 g，用水溶解并稀釋至1000 ml，搖勻）250 ml與0.2 mol/L氫氧化鈉溶液（取8.00 g氫氧化鈉，用水溶解并稀釋至1000 ml，搖勻）112.0 ml，混合，加水適量稀釋，加入SDS 2.0 g，用水溶解并稀釋至1000 ml，搖勻。

2.3 溶液的配制

2.3.1 對照品溶液 取他達拉非對照品約25 mg，精密稱定，置于100 ml量瓶中，加50 %乙腈溶液適量，超聲30 min使他達拉非完全溶解，用50 %乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，作為他達拉非對照品儲備液；精密量取他達拉非對照品儲備液適量，分別用4種溶出介質(zhì)稀釋配制成每1 ml中約含他達拉非2 μg的對照品溶液。

2.3.2 線性溶液 精密稱取他達拉非對照品約20 mg，置100 ml量瓶中，加50 %乙腈溶液適量，振搖使他達拉非完全溶解，用50 %乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為他達拉非對照品貯備液；精密量取對照品儲備液1，2，3，5，7 ml至50 ml量瓶中，分別用2.2項下溶出介質(zhì)稀釋至刻度，即得線性1～線性5溶液，濃度約為4，8，16，20，28 μg/ml。

2.3.3 不同pH值溶液的配制

pH 1.2水溶液：取鹽酸7.65 ml，加水稀釋至1000 ml。

pH 2.0水溶液：取鹽酸1.17 ml，加水稀釋至1000 ml。

pH 3.8水溶液：取2 mol/L醋酸溶液22.6 ml與醋酸鈉0.67 g，加水溶解并稀釋至1000 ml。

pH 4.5水溶液：取2 mol/L醋酸溶液14.0 ml與醋酸鈉2.99 g，加水溶解并稀釋至1000 ml。

pH 5.5水溶液：取2 mol/L醋酸溶液3.0 ml與醋酸鈉5.98 g，加水溶解并稀釋至1000 ml。

pH 6.0水溶液：取0.2 mol/L磷酸二氫鈉溶液250 ml與0.2 mol/L氫氧化鈉溶液28 ml，加水稀釋至1000 ml。

pH 6.8水溶液：取0.2 mol/L磷酸二氫鈉溶液250 ml與0.2 mol/L氫氧化鈉溶液112 ml，加水稀釋至1000 ml。

pH 8.0水溶液：取0.2 mol/L磷酸二氫鈉溶液250 ml與0.2 mol/L氫氧化鈉溶液230.5 ml，加水稀釋至1000 ml。

2.3.4 不同pH值0.2 %SDS溶液的制備 分別按2.3.3項下方法制備不同pH溶液，加入SDS 2 g，溶解，即得不同pH值0.2 %SDS溶液。

2.4 溶出曲線測定方法

采用槳法，溶出介質(zhì)體積為1000 ml，轉(zhuǎn)速為每分鐘50轉(zhuǎn)，分別于5，10，15，20，30，45，60，90 min時，取出溶出液5 ml，濾過，作為供試品溶液，并即時補充相同溫度、相同體積的溶出介質(zhì)。取上述溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，繪制溶出曲線。

2.5 溶解度的測定

2.5.1 不同pH值溶液中溶解度的測定 取過量的他達拉非原料藥，置50 ml量瓶中，精密加入pH 1.2，pH 2.0，pH 3.8，pH 4.5，pH 5.5，pH 6.0，pH 6.8，pH 8.0溶液及水各25 ml，置恒溫振蕩器中，37 ℃下振搖24 h，過濾，取續(xù)濾液，按2.1項下色譜條件進樣測定，采用外標法計算他達拉非溶解度。結(jié)果顯示，他達拉非為水難溶性藥物，且無pH依賴性，水作為溶出介質(zhì)無區(qū)分能力。結(jié)果見表1。

表1 他達拉非在不同pH溶液及水中溶解度

2.5.2 不同濃度SDS溶液中溶解度的測定 取過量的他達拉非原料藥，置50 ml量瓶中，精密加入0.1 %，0.15 %，0.20 %，0.25 %，0.30 %，0.35 %，0.40 %，0.45 %，0.50 %，0.55 %SDS溶液各25 ml，置恒溫振蕩器中，37 ℃下振搖24 h，過濾，取續(xù)濾液，按2.1項下色譜條件進樣測定，采用外標法計算他達拉非溶解度。結(jié)果顯示，他達拉非溶解度與介質(zhì)中SDS濃度基本呈正比，且在0.2 %SDS中的溶解度與他達拉非片在1000 ml溶出介質(zhì)中完全溶出時的濃度（20 μg/ml）基本一致，說明本品在0.2 %及以上濃度SDS溶液中可達到完全溶出。結(jié)果見表2。

表2 他達拉非在不同濃度SDS溶液中的溶解度

2.5.3 不同pH值0.2 %SDS溶液中溶解度的測定 取過量他達拉非原料藥，置50 ml量瓶中，精密加入含0.2 %SDS的pH 1.2、pH 2.0、pH 3.8、pH 4.5、pH 5.5、pH 6.0、pH 6.8、pH 8.0介質(zhì)和水各25 ml，置恒溫振蕩器中，37 ℃下振搖24 h，過濾，取續(xù)濾液，按2.1項下色譜條件進樣測定，采用外標法計算他達拉非溶解度。結(jié)果見表3。

表3 他達拉非在不同pH值0.2 %SDS溶液中溶解度

SDS濃度為0.2 %時，不同pH溶液中的溶解度無明顯的pH依賴性。參照普通口服固體制劑溶出度試驗技術(shù)指導原則[5-6]、他達拉非片進口注冊標準及美國藥典（USP41）溶出數(shù)據(jù)庫中的內(nèi)容，選擇2.2項下0.2 %SDS鹽酸溶液（pH 1.2）、0.2 %SDS醋酸鹽緩沖液（pH 4.5）、0.2 %SDS磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）和0.2 %SDS水溶液4種介質(zhì)進行篩選。

2.6 溶出度測定方法學驗證

2.6.1 專屬性試驗 稱取按處方比例配制的空白輔料約33 mg，置100 ml量瓶中，分別加2.2項下4種溶出介質(zhì)適量，振搖，并用相應的溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為空白輔料溶液。

精密量取空白輔料溶液、4種溶出介質(zhì)、2 μg/ml他達拉非對照品溶液各20 μl，按2.1項下色譜條件進樣測定，結(jié)果顯示4種溶出介質(zhì)及空白輔料均不干擾溶出度測定。色譜圖見圖1～3。

圖1 溶出介質(zhì)（0.2 %SDS水溶液）色譜圖

圖2 空白輔料溶液（以0.2 %SDS水溶液配制）色譜圖

圖3 對照品溶液（以0.2 %SDS水溶液配制）色譜圖

2.6.2 線性試驗 取2.3.2項下線性溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，以濃度（C，μg/ml）對峰面積（A）進行線性回歸，結(jié)果見表4。由表4可見，他達拉非在4種溶出介質(zhì)中線性關系良好。

表4 線性關系

2.6.3 定量限 取2.3.2 項下線性溶液1（濃度約為4 μg/ml），分別用4種溶出介質(zhì)依次逐級稀釋，按2.1項下色譜條件進樣測定，以信噪比為10計算定量限。結(jié)果顯示，他達拉非在0.2 %SDS鹽酸溶液（pH 1.2）、0.2 %SDS醋酸鹽緩沖液（pH 4.5）、0.2 %SDS磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）和0.2 %SDS水溶液中的定量限分別為0.2431，0.1616，0.1135，0.1926 μg/ml。

2.6.4 精密度試驗 取2.3.2 項下線性溶液4（濃度約為20 μg/ml）為對照品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，4種溶出介質(zhì)配制的對照品溶液連續(xù)進樣6次峰面積的RSD依次1.4 %，0.1 %，0.2 %，0.1 %，均小于2.0 %，說明儀器的精密度良好。

2.6.5 回收率試驗 取他達拉非對照品約50 mg，置100 ml量瓶中，用50 %乙腈溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為回收率貯備液。稱取處方量空白輔料，置25 ml量瓶中，加入回收率貯備液0.3 ml（30 %濃度水平）、0.5 ml（50 %濃度水平）、0.8 ml（80 %濃度水平）、1.0 ml（100 %濃度水平），分別用4種溶出介質(zhì)稀釋至刻度，每個濃度平行配制3份，取續(xù)濾液作為回收率試驗供試品溶液。按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，以測得量與加入量計算回收率。結(jié)果顯示，方法準確度良好，見表5。

表5 回收率試驗結(jié)果

2.6.6 溶液穩(wěn)定性試驗 取分別以2.2項下4種溶出介質(zhì)配制的濃度為20 μg/ml他達拉非對照品溶液及2.6.5項下加樣濃度水平為100 %的回收率試驗供試品溶液，室溫放置，分別于0，2，4，6，8，12 h時按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。隨著時間的增加，各樣品溶液峰面積RSD均在2 %以內(nèi)，表明各樣品溶液至少在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

以上溶出度測定方法學驗證指標均滿足要求，提示建立的溶出度測定方法可行。

2.7 參比制劑溶出曲線的測定

取他達拉非片參比制劑（批號：D189502），分別考察于不同溶出介質(zhì)[0.2 %SDS鹽酸溶液（pH 1.2）、0.2 %SDS醋酸鹽緩沖液（pH 4.5）、0.2 %SDS磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）和0.2 %SDS水溶液]中溶出曲線，結(jié)果見圖4。他達拉非片參比制劑（批號：D189502）在4種溶出介質(zhì)中，30 min溶出率均能達到85 %，無拐點和突釋，表明溶出介質(zhì)具有較強的區(qū)分能力，且不會過度區(qū)分，適用于評價參比制劑和自制片的一致性[6]。

圖4 參比制劑在不同溶出介質(zhì)中的溶出曲線（n=12）

2.8 溶出曲線相似性評價

采用相似因子（?2）法比較參比制劑和自制片溶出曲線的相似性：若50≤?2≤100，可認為2條溶出曲線相似，計二者的溶出量平均差異＜10 %。比較不同處方自制片與參比制劑在4種溶出介質(zhì)[0.2 %SDS鹽酸溶液（pH 1.2）、0.2 %SDS醋酸鹽緩沖液（pH 4.5）、0.2 %SDS磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）和0.2 %SDS水溶液]中溶出曲線的?2值，結(jié)果見表6。由表6可見，參比制劑和自制他達拉非片在4種溶出介質(zhì)中的溶出曲線間的?2值均大于50，表明自制他達拉非片具有與參比制劑相似的溶出特性。

表6 自制他達拉非片在不同溶出介質(zhì)中的溶出曲線對比

3 討論

他達拉非為水難溶性藥物，且無pH依賴性，水作為溶出介質(zhì)無法滿足漏槽條件且無區(qū)分能力。通過溶解度試驗結(jié)果可知，他達拉非溶解度與溶劑中SDS濃度基本成正比，但當SDS濃度濃度過大時，他達拉非片呈快速溶出狀態(tài)，滿足漏槽條件但基本無區(qū)分力。本研究最終確定在溶出介質(zhì)中加入0.2 %SDS可使溶出條件更具有區(qū)分力。參考指導原則推薦的溶出條件，最終篩選得到具有區(qū)分力的4種不同的溶出介質(zhì)。

他達拉非片進口藥品注冊標準中溶出度定量檢測方法為UV法，采用吸光度的一階導數(shù)法計算他達拉非溶出量，計算過程比較復雜；美國藥典USP43中溶出度測定方法為HPLC法，但流動相為甲醇-水（50:50），黏度較大，極易損傷色譜柱，且主成分出峰時間較晚，分析時間較長。本研究所用液相色譜條件可使他達拉非快速出峰且峰形良好，溶劑及輔料峰均不干擾測定，能較大程度提高檢測效率，同時采用標準曲線法進行定量計算，即使供試品溶液濃度范圍波動較大也能保證計算結(jié)果的準確性。此外，本研究對他達拉非在不同溶出介質(zhì)中的溶出度定量測定方法進行了驗證，本方法專屬性、準確度、精密度良好，且在最低與最高溶出度范圍內(nèi)，他達拉非濃度與峰面積呈良好的線性關系，各項試驗結(jié)果均符合規(guī)定。最終確定本方法用于測定他達拉非溶出度準確可靠。

溶出曲線相似性評價結(jié)果表明，自制片與參比制劑在各溶出介質(zhì)中的溶出行為基本相似，為仿制藥一致性評價提供了試驗依據(jù)。