于進(jìn) 沈瑤 劉楚玲 何正力 張袁松

(1. 西南大學(xué)醫(yī)院, 重慶 400716;2. 西南大學(xué)蠶桑紡織與生物質(zhì)科學(xué)學(xué)院, 重慶 400716)

從植物中提取的天然葉綠素在醫(yī)藥、食品、化妝品、著色劑等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用,但天然葉綠素不溶于水,穩(wěn)定性差,其應(yīng)用受到極大限制。天然葉綠素經(jīng)過置銅反應(yīng),將卟啉環(huán)中心的配位金屬離子置換為銅原子,葉綠素銅酸再經(jīng)過成鹽反應(yīng),生成的葉綠素銅鈉鹽則是一種高穩(wěn)定性的金屬卟啉,具有較高的生物活性,無毒副作用,對腫瘤具有直接或間接的抑制作用[1]。葉綠素銅鈉鹽是聯(lián)合國糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO)和我國食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)委員會批準(zhǔn)使用的天然綠色素[2-4]。在養(yǎng)蠶業(yè)的大宗副產(chǎn)物蠶沙中,葉綠素的含量約為0.50%～1.79%,是提取葉綠素的重要原料之一[5]。早在20世紀(jì)80年代,華南農(nóng)業(yè)大學(xué)黃自然教授研究團隊就建立了利用蠶沙提取葉綠素銅鈉鹽的技術(shù)體系,并實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn),產(chǎn)品已經(jīng)在醫(yī)藥、食品、保健品及化妝品中被廣泛地應(yīng)用[6]。

松針中的葉綠素含量較一般綠色植物高,是潛在的葉綠素產(chǎn)品原料來源。我國松樹資源分布廣泛,僅松針葉的蘊藏量就在1億t以上,而且松針是一種可再生的天然資源,因此,利用松針為原料制備葉綠素,開發(fā)前景看好[7-8]。我們用馬尾松的松針為原料提取葉綠素并制備成葉綠素銅鈉鹽,采用紫外吸收光譜法測試松針葉綠素銅鈉鹽的穩(wěn)定性,為其應(yīng)用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 原料及主要試劑和儀器

采集冬季馬尾松松針,攤開室內(nèi)自然晾干,60 ℃以下熱風(fēng)風(fēng)干至含水率在12%以下,切成3～5 cm的長段,粉碎后過篩(30目),放冰箱內(nèi)4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑:丙酮、乙醇、石油醚、NaOH、CuSO4、鹽酸,均為分析純。

主要儀器:HH-4恒溫水浴鍋(國華實驗儀器有限公司),JA2003A電子天平(Acculab),78-1磁力加熱攪拌器,Y802N型八籃恒溫烘箱(南通宏大實驗儀器有限公司),TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析),data color 110TM 分光測色儀(美國德塔)。

1.2 提取工藝基本流程

松針粉→加水潤濕軟化→浸提→過濾→皂化→石油醚萃取→酸化→銅代→過濾→析出葉綠素銅酸→成鹽→干燥。

1.3 葉綠素銅鈉鹽樣品的穩(wěn)定性測試方法

1.3.1 紫外光譜吸收曲線的測定

將按上述方法提取制得的葉綠素銅鈉鹽粗品加蒸餾水配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的溶液,以蒸餾水作參比,用雙光束紫外可見分光光度計在350～700 nm 波段掃描,測定其吸光度獲取吸收曲線[4]。

1.3.2 不同光照條件下的穩(wěn)定性測試

將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的葉綠素銅鈉鹽溶液分3份(每份50 mL),分別置于直射光下、室內(nèi)自然光下及黑暗條件下處理,每天用雙光束紫外可見分光光度計測定403 nm處的吸光度,連續(xù)測試25 d。計算各處理樣品的葉綠素銅鈉鹽保存率:保存率= 末吸光值/ 初吸光值×100%。

1.3.3 不同pH條件下的穩(wěn)定性測試

取配好的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的葉綠素銅鈉鹽溶液,分成7份(每份30 mL),用NaOH、HCl調(diào)節(jié)葉綠素銅鈉鹽溶液的pH值分別為2、4、6、7、8、10、12,在室溫下放置60 min,用紫外可見分光光度計測定不同pH的樣品溶液在403 nm處的吸光度。

1.3.4 不同溫度條件下的穩(wěn)定性測試

將提取的葉綠素銅鈉鹽樣品配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、pH 值為7 的溶液,分成6份(每份30 mL),然后放在恒溫水浴鍋中分別經(jīng)20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃處理60 min,再冷卻至室溫,用雙光束紫外可見分光光度計測定其在403 nm處的吸光度(以蒸餾水作參比),并與加熱前進(jìn)行比較,計算其保存率。

1.3.5 耐氧化性及耐還原性測試

分別配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的Na2SO3、H2O2溶液,各取2 mL分別加入已配好的30 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的葉綠素銅鈉鹽溶液中,在60 min內(nèi)觀察溶液顏色的變化,并以蒸餾水作比較,用雙光束紫外可見分光光度計測量2份處理樣品溶液在403 nm 處隨時間變化的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠素銅鈉鹽的紫外吸收光譜

測定用松針制備葉綠素銅鈉鹽樣品的吸光度,得到的吸收曲線如圖1所示,其最大吸收波長為403 nm。與詹永樂[5]利用蠶沙制得的葉綠素鋅鈉鹽的吸收曲線比較,曲線最大吸收峰位置一致。

圖1 用松針提取葉綠素銅鈉鹽的紫外吸收光譜

2.2 葉綠素銅鈉鹽的穩(wěn)定性

2.2.1 光照對葉綠素銅鈉鹽穩(wěn)定性的影響

測定用松針制備的葉綠素銅鈉鹽在不同光照條件下的穩(wěn)定性,結(jié)果如圖2所示。在黑暗條件下放置的葉綠素銅鈉鹽其吸光度無大的變化,溶液的顏色仍保持透明的亮綠色;在室內(nèi)自然光和直射光照射條件下,葉綠素銅鈉鹽的吸光度明顯下降,溶液的顏色也變淺呈淺黃綠色。計算3組樣品放置25 d后的葉綠素銅鈉鹽保存率,黑暗組樣品為96.5%,室內(nèi)自然光組樣品為91.8%,直射光組樣品為72.9%。由此可見,光照對葉綠素銅鈉的穩(wěn)定性有很大的影響,產(chǎn)品在保存時建議避光存放。

圖2 不同光照條件下葉綠素銅鈉鹽的吸光度變化

2.2.2 pH對葉綠素銅鈉鹽穩(wěn)定性的影響

測定用松針制備的葉綠素銅鈉鹽在不同pH條件下的穩(wěn)定性,結(jié)果如圖3所示。葉綠素銅鈉鹽在pH 7～12 的范圍內(nèi)吸光值變化不大,說明在中性和堿性環(huán)境中葉綠素銅鈉鹽較穩(wěn)定;在pH<6 的酸性條件下,樣品的吸光值明顯較小,而且隨酸性的增強吸光值逐漸減小,當(dāng)pH=2時,溶液顏色變成淺綠色并出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象。分析可能是由于在強酸性條件下,葉綠素銅鈉鹽變成葉綠素銅酸,由于葉綠素銅酸難溶于水,故使得溶液中出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象,溶液的顏色變淺。該結(jié)果說明強酸性環(huán)境中葉綠素銅鈉鹽不太穩(wěn)定,容易分解。

圖3 不同pH條件下葉綠素銅鈉鹽的吸光度變化

2.2.3 溫度對葉綠素銅鈉鹽穩(wěn)定性的影響

測定用松針制備的葉綠素銅鈉鹽在不同溫度條件下的穩(wěn)定性,結(jié)果如圖4所示。在溫度<80 ℃時,隨著溫度的升高,葉綠素銅鈉鹽溶液的吸光度變化不大,溶液顏色仍為綠色;當(dāng)溫度上升至80～100 ℃之間,其吸光度明顯減少。據(jù)此建議葉綠素銅鈉鹽的儲存溫度最好控制在80 ℃以下。

圖4 不同溫度條件下葉綠素銅鈉鹽溶液的吸光度變化

2.2.4 葉綠素銅鈉鹽的耐氧化性及耐還原性

測定用松針制備葉綠素銅鈉鹽的耐氧化性和耐還原性,由圖5可知:隨著放置時間的延長,加入5% H2O2的葉綠素銅鈉鹽溶液的吸光度下降,顏色變?yōu)闇\綠色,且放置時間越長其樣品溶液的顏色越來越淺,最終接近無色;而加入5% Na2SO3的葉綠素銅鈉鹽溶液其吸光度基本上沒有變化,溶液顏色始終呈亮綠色。測試結(jié)果說明:氧化劑在短時間內(nèi)對葉綠素銅鈉鹽的影響不大,但長時間會產(chǎn)生很大的影響;而還原劑對葉綠素銅鈉鹽的影響不大。

圖5 加入氧化劑或還原劑后葉綠素銅鈉鹽的吸光度變化

3 小結(jié)

本試驗利用來源豐富的松針制備葉綠素銅鈉鹽,測試樣品的紫外光譜吸收曲線有2個吸收峰值,其最大峰值的吸收波長λ=403 nm。對制備的松針葉綠素銅鈉鹽溶液的穩(wěn)定性進(jìn)行測試,結(jié)果提示:葉綠素銅鈉鹽對光照敏感,應(yīng)注意避光存放;葉綠素銅鈉在低于80 ℃的條件下穩(wěn)定,但溫度高于80 ℃時穩(wěn)定性明顯下降,其最佳保存溫度應(yīng)控制在80℃以下;氧化劑短時間內(nèi)對葉綠素銅鈉鹽穩(wěn)定性影響不大,但長時間會造成較大影響,而還原劑對松針葉綠素銅鈉鹽穩(wěn)定性影響很小,故在使用時應(yīng)盡量避免接觸氧化劑;葉綠素銅鈉鹽適合于在pH 6～12范圍內(nèi)的微酸、中性或堿性條件下使用。