張?zhí)鞄?，周?lè)其 綜述，于冠宇，張 衛(wèi) 審校

（海軍軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院肛腸外科，上海 200433）

結(jié)腸直腸癌(colorectal cancer, CRC)在惡性腫瘤中發(fā)病率排名第三（占新發(fā)腫瘤病人的10.0%），且死亡率排名第二（占新增腫瘤死亡病人的9.4%）[1]。針對(duì)CRC 等實(shí)體腫瘤，傳統(tǒng)治療方式根據(jù)不同的類型與階段，選擇手術(shù)治療、放療、化療以及靶向治療等方式進(jìn)行治療[2]。但傳統(tǒng)治療方式對(duì)病人總生存期改善有限，CRC 發(fā)病率與死亡率仍高居不下。

近年來(lái)，免疫療法的提出改變了以往直接針對(duì)腫瘤的治療策略，并開(kāi)辟了對(duì)抗腫瘤的另一路徑——細(xì)胞免疫療法[3]。其中，嵌合抗原受體T 細(xì)胞（chimeric antigen receptor T cell, CAR-T 細(xì)胞）免疫治療是腫瘤治療的創(chuàng)新方式之一。通過(guò)基因修飾，病人回輸后的T 細(xì)胞可表達(dá)CAR，之后與獨(dú)立于主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)受體的靶抗原結(jié)合，得以定向識(shí)別和消除表達(dá)特定靶抗原的腫瘤細(xì)胞[4]。得益于良好的特異性和強(qiáng)大的殺傷作用，CAR-T 細(xì)胞免疫治療方式在血液腫瘤治療的臨床應(yīng)用中取得了顯著成效，且在實(shí)體腫瘤治療中具有極大的應(yīng)用潛力。

1 CAR-T細(xì)胞免疫治療CRC的靶點(diǎn)選擇

在CAR-T 細(xì)胞免疫治療CRC 過(guò)程中，CAR 與癌細(xì)胞表面靶抗原識(shí)別并結(jié)合是關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。尋找合適的治療靶點(diǎn)是CAR-T 細(xì)胞免疫治療得以開(kāi)展的基石。Qi 等[5]報(bào)道的應(yīng)用靶向密封蛋白（Claudin）18.2（CLDN18.2）CAR-T細(xì)胞對(duì)37 例胃腸道腫瘤治療的Ⅰ期臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，在CLDN18.2 陽(yáng)性表達(dá)的胃腸道腫瘤病人中獲得良好的療效和可接受的安全性。

治療靶點(diǎn)的選擇常需考慮腫瘤的組織病理特征，CRC腫瘤組織高表達(dá)的分子包括表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）以及磷酸酶張力蛋白同源物基因（phosphate and tension homolog,PTEN）表達(dá)的蛋白質(zhì)等多種實(shí)體腫瘤標(biāo)志物。目前，適用于CRC 的治療靶點(diǎn)有癌胚抗原（carcinoembryonic, CEA）、鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶2C（guanylyl cyclase 2C, GUCY2C)、上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule, EpCAM）等[6]。綜合來(lái)看，靶點(diǎn)選擇策略有如下共同之處。

1.1 良好的特異性

CAR-T 細(xì)胞實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的精準(zhǔn)殺傷需要治療靶點(diǎn)具有良好的特異性。急性淋巴細(xì)胞白血病等血液腫瘤細(xì)胞可普遍表達(dá)CD19 等腫瘤特異抗原（tumor specific antigen,TSA），與免疫細(xì)胞結(jié)合的特異性較高[7]。與之不同的是，實(shí)體腫瘤如CRC 腫瘤細(xì)胞缺乏TSA，更多的是腫瘤相關(guān)抗原(tumor associated antigen, TAA)作為治療靶點(diǎn)。此類抗原在腫瘤細(xì)胞高水平表達(dá)，但在正常細(xì)胞也有一定的表達(dá)[8]。因此，利用TAA 在腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞表達(dá)的差異來(lái)尋找合適的治療靶點(diǎn)是提高治療靶點(diǎn)特異性的主要策略。

GUCY2C 表達(dá)于胃腸上皮細(xì)胞，是治療CRC 及轉(zhuǎn)移性CRC 的重要靶點(diǎn)之一，在腸外細(xì)胞僅有下丘腦神經(jīng)元少量產(chǎn)生，具有一定的組織特異性[9]。同時(shí)，GUCY2C 在原發(fā)性CRC 中可穩(wěn)定表達(dá)，且在轉(zhuǎn)移灶中也維持表達(dá)。與具有極性、僅于上皮細(xì)胞的腔面膜表達(dá)GUCY2C 的正常腸上皮細(xì)胞相比，惡變的上皮細(xì)胞因失去極性而造成GUCY2C 廣泛表達(dá)于細(xì)胞整個(gè)表面[10]。這提高了GUCY2C 的特異性，使CAR-T細(xì)胞得以將其特異識(shí)別。

另一個(gè)在CRC 病人高表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原是CEA，其作為治療靶點(diǎn)的原因與GUCY2C 相類似。在正常腸上皮細(xì)胞中，CEA 被糖蛋白或微絨毛包裹，且表達(dá)同樣具有極性——僅在腸腔一側(cè)細(xì)胞膜表達(dá)。細(xì)胞發(fā)生惡變后，CEA表達(dá)失去極性，在細(xì)胞整個(gè)表面都顯著表達(dá)[11]。然而，CEA在肺癌、乳腺癌、胰腺癌等惡性腫瘤細(xì)胞中也可高表達(dá)，其組織特異性較差[12]。因此，CEA 被用作治療靶點(diǎn)時(shí)，其安全性需要廣泛的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

此外，還有EpCAM、人類表皮生長(zhǎng)因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2, HER-2）等治療靶點(diǎn)均因具有良好的特異性而被應(yīng)用于CAR-T 細(xì)胞免疫治療CRC[13-15]。

1.2 安全性和有效性

特異性篩選出治療靶點(diǎn)后，還應(yīng)進(jìn)一步綜合體外實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、臨床試驗(yàn)等結(jié)果評(píng)價(jià)其有效性和安全性。在不同實(shí)驗(yàn)階段，可能會(huì)得出與預(yù)期不符的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，影響治療靶點(diǎn)選擇的最終決策。良好的治療靶點(diǎn)，應(yīng)具有足夠的安全性以及可觀的有效性。

CEA 作為用于治療CRC 的主要治療靶點(diǎn)之一，在過(guò)去數(shù)十年間經(jīng)歷了相對(duì)完整的實(shí)驗(yàn)論證過(guò)程。Darcy 等[16]開(kāi)展的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)將通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的鼠嵌合scFv anti-CEA 受體T 細(xì)胞與人結(jié)腸癌LoVo 系細(xì)胞（效靶比=1∶1）混合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)CAR-T 細(xì)胞與癌細(xì)胞特異結(jié)合并釋放大量干擾素(interferon, INF)γ [（1 062±15） μg/L，對(duì)照組＜20 μg/L]，且在后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證scFv anti-CEA 受體可在小鼠中擴(kuò)增，并使CAR-T細(xì)胞對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞有效定位，之后通過(guò)穿孔素介導(dǎo)靶細(xì)胞裂解。Zhang 等[17]開(kāi)展的一項(xiàng)anti-CEA CAR-T 細(xì)胞治療轉(zhuǎn)移性CRC 的Ⅰ期臨床研究驗(yàn)證了CEA作為治療靶點(diǎn)的安全性。研究未觀察到與CAR-T細(xì)胞治療相關(guān)的嚴(yán)重不良事件發(fā)生。此外，在入組的10 例病人中，既往發(fā)生疾病進(jìn)展的7 例經(jīng)CAR-T 細(xì)胞治療后病情穩(wěn)定，2例通過(guò)PET/CT 與MRI 檢查提示病灶縮小，證明anti-CEA CAR-T細(xì)胞治療CRC具有可觀的有效性。

近年來(lái)，研究人員發(fā)現(xiàn)間皮素（mesothelin, MSLN）在間皮瘤、卵巢癌等腫瘤組織中高表達(dá)，而靶向MSLN 的CAR-T細(xì)胞免疫治療也在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段驗(yàn)證其有效性[18]。Zhang等[19]應(yīng)用癌細(xì)胞系異種移植法（卵巢癌、乳腺癌和CRC 細(xì)胞系）和癌癥病人細(xì)胞異種種植法（MSLN+CRC 和胃癌病人）分別造模癌癥小鼠，之后應(yīng)用anti-MSLN CAR-T細(xì)胞進(jìn)行治療。結(jié)果表明，anti-MSLN CAR-T 細(xì)胞免疫治療不僅抑制實(shí)驗(yàn)組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)，同時(shí)提高小鼠體內(nèi)T 細(xì)胞數(shù)目和抑癌細(xì)胞因子水平，體現(xiàn)了MSLN 作為新型細(xì)胞免疫治療靶點(diǎn)的應(yīng)用潛能。

盡管CEA 作為CAR-T 細(xì)胞免疫治療的經(jīng)典靶點(diǎn)經(jīng)歷了長(zhǎng)時(shí)間的驗(yàn)證，但其有效性與安全性仍需更多的高等級(jí)臨床證據(jù)深入論證，如更廣泛、多中心的臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)等。其他治療靶點(diǎn)如MSLN 等也需如此，在理論走入實(shí)踐、基礎(chǔ)走入臨床的各個(gè)環(huán)節(jié)反復(fù)驗(yàn)證其有效性及安全性。足夠的安全性是治療靶點(diǎn)得以廣泛應(yīng)用的必要條件，而治療效果則是衡量治療靶點(diǎn)臨床收益的重要指標(biāo)之一。

2 CAR-T細(xì)胞免疫治療CRC的制約因素

CAR-T 細(xì)胞免疫在血液腫瘤治療中取得了顯著成效，然而，CRC 等實(shí)體腫瘤具有與血液腫瘤差異較大的抗原表達(dá)及腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment, TME）。這些差異會(huì)導(dǎo)致CAR-T 細(xì)胞免疫治療CRC 的應(yīng)用過(guò)程中產(chǎn)生不良反應(yīng)，也會(huì)降低治療的有效性，成為制約CAR-T細(xì)胞免疫治療CRC發(fā)展的因素。

2.1 制約治療的不良反應(yīng)

細(xì)胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome, CRS）是常發(fā)生于CAR-T細(xì)胞免疫治療血液腫瘤的不良反應(yīng)之一（on-target/on-tumor toxicity）[20]。其發(fā)生的主要原因是T細(xì)胞激活后介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，使巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞或上皮細(xì)胞釋放出大量細(xì)胞因子[21]。然而，CRS 在CART細(xì)胞免疫治療實(shí)體腫瘤時(shí)并不多見(jiàn)。Zhang等[17]的研究著重監(jiān)測(cè)了CRS 的敏感標(biāo)志物——C 反應(yīng)蛋白與白介素(interleukin, IL)-6。結(jié)果表明，在回輸CAR-T 細(xì)胞后呈單峰樣拋物線變化趨勢(shì)，并未高位維持，因此病人無(wú)嚴(yán)重的CRS發(fā)生。相同的結(jié)果還體現(xiàn)于Ahmed等[22]應(yīng)用CAR-T細(xì)胞免疫治療肉瘤的研究中，在對(duì)病人的細(xì)胞因子進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測(cè)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)僅IL-8 在回輸CAR-T 細(xì)胞后的第1、2、4 周有顯著增高，其余細(xì)胞因子無(wú)明顯增多，也未觀察到嚴(yán)重的CRS發(fā)生。

在應(yīng)用CAR-T 細(xì)胞免疫治療實(shí)體腫瘤的過(guò)程中，更明顯的不良反應(yīng)是CAR-T細(xì)胞非特異性靶向而造成的機(jī)體損傷（on-target/off-tumor toxicity）。這是因?yàn)橹委熑鏑RC 等實(shí)體腫瘤選取的治療靶點(diǎn)為T(mén)AA，CAR-T 細(xì)胞回輸后可能會(huì)對(duì)表達(dá)靶抗原的非腫瘤組織造成損傷。Morgan 等[23]報(bào)道，1例結(jié)腸癌術(shù)后淋巴及肝轉(zhuǎn)移的病人在輸注抗HER-2 CAR-T細(xì)胞后15 min內(nèi)出現(xiàn)呼吸窘迫，并在5 d后死亡。分析認(rèn)為CAR-T 細(xì)胞在回輸后立即定位并攻擊有ERBB2 低表達(dá)的肺上皮細(xì)胞，從而引發(fā)嚴(yán)重的CRS，并最終導(dǎo)致病人死亡。Parkhurst等[24]報(bào)道3例轉(zhuǎn)移性CRC病人回輸anti-CEA CART細(xì)胞后的治療情況，3例病人CEA均有顯著下降，1例肺轉(zhuǎn)移灶及肝轉(zhuǎn)移灶出現(xiàn)客觀退縮，其余2 例腫瘤病灶無(wú)明顯變化。此外，該治療誘發(fā)了3 例嚴(yán)重短暫性炎性結(jié)腸炎，分析原因，認(rèn)為是CAR-T 細(xì)胞識(shí)別了正常腸上皮細(xì)胞少量表達(dá)的CEA。

雖然CAR-T 細(xì)胞治療靶點(diǎn)在臨床試驗(yàn)之前嚴(yán)格篩選，也經(jīng)過(guò)體外實(shí)驗(yàn)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，但免疫細(xì)胞回輸后對(duì)病人產(chǎn)生的不良反應(yīng)仍需大量的臨床試驗(yàn)來(lái)深入研究，以便更安全、廣泛地應(yīng)用CAR-T細(xì)胞免疫治療CRC。

2.2 制約治療的腫瘤環(huán)境

腫瘤細(xì)胞的生活環(huán)境較復(fù)雜，包括有成血管細(xì)胞（內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等）、免疫細(xì)胞（淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等）、成纖維細(xì)胞，以及細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）、擴(kuò)散性生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子等[25]。這樣的環(huán)境可使血管加速生成、成纖維細(xì)胞增殖，以及炎癥細(xì)胞聚集等，形成的物理屏障及TME會(huì)制約CAR-T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞[26]。

實(shí)體腫瘤的物理屏障限制了CAR-T 細(xì)胞的穿透能力。與血液腫瘤不同的是，CRC等實(shí)體腫瘤細(xì)胞呈團(tuán)塊樣生長(zhǎng)，阻礙了免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。此外，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancerassociated fibroblast, CAF）產(chǎn)生的腫瘤ECM 構(gòu)成了另一重要的物理屏障[27]。ECM 由糖蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白等其他大分子物質(zhì)組成，在腫瘤細(xì)胞外無(wú)序排列，這使得CAR-T細(xì)胞難以與腫瘤細(xì)胞靶向結(jié)合[28]。

實(shí)體腫瘤還具有免疫抑制效應(yīng)的TME，由Treg細(xì)胞、骨髓源性抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cell, MDSC）、間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell, MSC）等參與構(gòu)建，降低CAR-T 細(xì)胞的殺傷能力[29-31]。其中，Treg 細(xì)胞發(fā)揮的免疫抑制效應(yīng)更明顯，其抑制效應(yīng)主要體現(xiàn)如下：通過(guò)抑制性受體[T 淋巴細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白(T cell immunoglobulin domain and mucin domain,TIM)-3、T 細(xì)胞免疫球蛋白和ITIM 結(jié)構(gòu)域蛋白(T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domain,TIGIT)、程序性死亡受體(programmed death, PD)-1 和淋巴細(xì)胞活化基因(lymphocyte activation gene,LAG)-3]、抑制性細(xì)胞因子[轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor, TGF)-β、IL-10和IL-35)、調(diào)節(jié)樹(shù)突狀細(xì)胞釋放吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO)[通過(guò)Treg 細(xì)胞的細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白 (cytotoxic T lymphocyte-associated antigen,CTLA)-4 與樹(shù)突狀細(xì)胞的抗原分化簇(cluster of differentiation,CD)80 結(jié)合]和中斷腺苷代謝(通過(guò)Treg 細(xì)胞CD39 和CD73)來(lái)抑制抗腫瘤T 細(xì)胞反應(yīng)；通過(guò)TGF-β 誘導(dǎo)CAF 增殖，增加ECM的產(chǎn)生與沉積，發(fā)揮物理屏障作用，限制CART細(xì)胞的浸潤(rùn)[32]。

實(shí)體腫瘤異于血液腫瘤的環(huán)境使得CAR-T細(xì)胞產(chǎn)生效應(yīng)面臨重重阻礙，這表明仍需探索合理的治療策略，以克服實(shí)體腫瘤環(huán)境對(duì)CAR-T細(xì)胞免疫治療的制約[33]。

3 CAR-T細(xì)胞免疫治療CRC的展望

CAR-T細(xì)胞免疫治療CRC療效與其他實(shí)體腫瘤相比仍有一定差距，其制約因素主要為CRC的TAA，甚至TSA表達(dá)有限。Golubovskaya 等[34]探究anti-CD47 CAR-T 細(xì)胞抗腫瘤效能的體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞系整體CD47表達(dá)顯著高于正常細(xì)胞，但在CRC細(xì)胞系中表達(dá)卻偏低，因此在動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中觀察到CAR-T 細(xì)胞對(duì)卵巢癌、胰腺癌及宮頸癌良好的抗腫瘤效能，但對(duì)CRC 的治療效果不佳。同時(shí)，CRC 具有更復(fù)雜的免疫微環(huán)境，也是CAR-T 細(xì)胞治療CRC 效果與治療其他實(shí)體腫瘤療效產(chǎn)生差異的主要原因。另一可能影響治療效果的因素是腫瘤的病理分期，然而目前CAR-T 細(xì)胞在實(shí)體腫瘤治療中多用于較晚期的病人，缺少早期病人進(jìn)行療效比較。這一因素的探究依賴于產(chǎn)品成熟度的提升與較早期病人的應(yīng)用。

目前，已有針對(duì)提高CAR-T 細(xì)胞免疫治療靶點(diǎn)特異性以及突破TME 制約等問(wèn)題的相關(guān)研究正在進(jìn)行。如對(duì)CAR 結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，采用雙重CAR 結(jié)構(gòu)或串聯(lián)CAR 結(jié)構(gòu)，使CAR-T多靶點(diǎn)靶向結(jié)合腫瘤抗原后產(chǎn)生殺傷作用[35]。

此外，更多的治療策略被提出，以期減輕TME對(duì)CAR-T細(xì)胞的影響。如對(duì)CAR-T 細(xì)胞進(jìn)行改造，使其可以表達(dá)肝素酶，以降解腫瘤ECM，使CAR-T 細(xì)胞更有效地進(jìn)入腫瘤組織[36]。還有研究將CAR-T 的靶細(xì)胞確定為CAF，通過(guò)特異性結(jié)合CAF 表面高度表達(dá)的成纖維細(xì)胞活化蛋白（fibroblast activation protein, FAP）對(duì)其造成殺傷[37-38]。

同時(shí)，創(chuàng)新給藥途徑也能提高CAR-T 細(xì)胞免疫治療的有效性，如向肝內(nèi)局部輸注CAR-T 細(xì)胞，以增加局部濃度[39]。作為治療腫瘤的方法之一，細(xì)胞免疫治療還可與其他治療方法聯(lián)合應(yīng)用，如將實(shí)體腫瘤手術(shù)切除后再行細(xì)胞免疫治療，將治療效果聯(lián)合放大。但是，各種創(chuàng)新方案都需大量的臨床試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，而這也是目前CAR-T 細(xì)胞免疫治療的不足之一，期待未來(lái)開(kāi)展更多的臨床試驗(yàn)，獲得更多積極的結(jié)果。

細(xì)胞免疫治療作為對(duì)抗腫瘤的新一代治療方法，對(duì)實(shí)體腫瘤的治療極具應(yīng)用潛力。因此，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心于2020 年8 月組織起草了《人源性干細(xì)胞及其衍生細(xì)胞治療產(chǎn)品臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則（征求意見(jiàn)稿）》，進(jìn)一步為開(kāi)展細(xì)胞免疫治療臨床試驗(yàn)的研究者提供了針對(duì)性的指南。上海市政府更將細(xì)胞治療列入上海市科技“十四五”及中長(zhǎng)期規(guī)劃的重點(diǎn)任務(wù)，上海市有多款CART 細(xì)胞治療產(chǎn)品進(jìn)入上市申報(bào)階段。上海市斯丹賽生物開(kāi)發(fā)的治療CRC 等實(shí)體腫瘤anti-GCC CAR-T 細(xì)胞產(chǎn)品也于2022 年4 月被美國(guó)食品和藥物管理局（Food and Drug Administration, FDA）授予快速通道資格。然而，實(shí)體腫瘤具有缺乏特異性抗原以及特殊的腫瘤環(huán)境等特點(diǎn)，產(chǎn)生一系列亟待解決的臨床問(wèn)題。在未來(lái)，需要對(duì)已掌握的技術(shù)進(jìn)行廣泛的驗(yàn)證，探索解決臨床問(wèn)題的全新途徑。