張濟(jì)民，王 浩，賈文杰，孫 亮，張小平，王有國(guó)

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 花卉研究所，云南 昆明 650205；3.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，浙江 金華 321016)

XTHs基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段均有表達(dá)，其作用受到廣泛關(guān)注。AtXTH31基因在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中參與調(diào)控根的生長(zhǎng)和伸長(zhǎng)生長(zhǎng)[9]；AtXTH基因家族的其他基因如AtXTH15、16、17、19則是通過(guò)影響細(xì)胞壁伸長(zhǎng)生長(zhǎng)來(lái)調(diào)控?cái)M南芥葉柄的長(zhǎng)度[10]；CaXTH1基因在鷹嘴豆(Cicer arietinumLinn.)上胚軸中特異性表達(dá)，且其表達(dá)量與聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)影響上胚軸發(fā)育呈正相關(guān)，因此CaXTH1基因可能對(duì)種子萌發(fā)過(guò)程中上胚軸的伸長(zhǎng)具有重要作用[11]；GmXTH38基因通過(guò)調(diào)控脯氨酸與超氧化物歧化酶含量在大豆(Glycine max)抗干旱脅迫中起到重要作用[12]；OsXTH基因家族在水稻(Oryza sativa)抗干旱脅迫中起到關(guān)鍵作用[13]；而在擬南芥中超表達(dá)XTH家族基因可以明顯檢測(cè)出XEH 酶活性增強(qiáng)以及細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，且超表達(dá)植株葉形顯著區(qū)別于野生型植株[14-15]。此外，PAN 等[16]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)：XTHs基因在天麻種子休眠解除中呈差異性表達(dá)，可能在這一過(guò)程中起到重要作用；MA 等[17]研究發(fā)現(xiàn)：在龍眼種子發(fā)育的早期，XTHs 類(lèi)基因扮演著關(guān)鍵角色?？梢?jiàn)，XTHs基因在植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及植物響應(yīng)逆境脅迫方面具有重要作用，但對(duì)于XTHs 類(lèi)基因在休眠中如何起作用，尤其是在百合種球休眠中的作用尚不清楚。

百合(Liiumspp.)是百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)多年生草本球根植物，其花色豐富、氣味芳香而深受消費(fèi)者喜愛(ài)，是世界上主要的鮮切花之一。由于百合鱗莖的休眠特性，即休眠解除過(guò)度或解除不徹底，將會(huì)影響百合成花質(zhì)量，導(dǎo)致其鮮切花品質(zhì)和產(chǎn)量雙重下降，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此，百合在生產(chǎn)上一直受限于種球休眠解除不整齊等因素，無(wú)法周年供應(yīng)[18]，限制了其產(chǎn)業(yè)發(fā)展。因此，探究百合種球的休眠機(jī)制具有重要意義。課題組前期的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)LoXTH23基因與百合鱗莖的休眠解除密切相關(guān)，本試驗(yàn)使用RT-PCR 克隆西伯利亞百合LoXTH23基因，利用生物信息學(xué)軟件對(duì)該基因進(jìn)行序列分析，以期為研究LoXTH23基因?qū)Π俸削[莖解除休眠的作用機(jī)制提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料、試劑和設(shè)備

供試材料：西伯利亞百合小鱗莖，繁殖于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地。選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、大小一致、鮮質(zhì)量小于0.4 g 的百合小鱗莖平均分成2 組，每組30 個(gè)(含3 次重復(fù))，其中一組用蒸餾水浸泡2 h 處理(CK)，另一組用100 μmol/L 乙烯溶液浸泡2 h 處理(預(yù)試驗(yàn)顯示該濃度乙烯處理的百合小鱗莖先于對(duì)照組萌發(fā))。處理完畢后用吸水紙吸干，將小鱗莖接種到瓊脂作為基質(zhì)的玻璃瓶中，每瓶接種5 個(gè)小鱗莖；然后將其置入28 ℃恒溫箱中黑暗培養(yǎng)30 d，取出材料后保存于—80 ℃冰箱備用。

主要試劑：植物總RNA 快速提取試劑盒購(gòu)自北京華越洋生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA 提取試劑盒和DL 2000 DNA Marker 購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；TaqPCR Mix 預(yù)混液和克隆載體PESIT 購(gòu)自翌圣生物科技(上海)股份有限公司；大腸桿菌感受態(tài)DH5α 由昆明碩擎生物技術(shù)有限公司提供；核酸染料Green 和限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；其他試驗(yàn)藥品均為國(guó)標(biāo)分析純或生物純，購(gòu)自源葉生物(上海)股份有限公司。

主要設(shè)備儀器：HC-3018R 高速冷凍離心機(jī)；Nanodrop2000 超微量分光光度計(jì)；Bio-Rad PCR儀；GSP-9160MBE 恒溫培養(yǎng)箱；DYY-7C 電泳儀；TU-1810 暗箱式紫外透射儀；THZ-C 恒溫振蕩器。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1百合小鱗莖總RNA 提取及cDNA 第1 鏈的合成

使用總RNA 快速提取試劑盒提取百合小鱗莖總RNA；使用cDNA 第1 鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用Nanodrop2000 超微量分光光度計(jì)檢測(cè)樣品濃度，檢測(cè)合格的cDNA 于—20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

為了解決學(xué)生這些疑問(wèn)，任課老師收集大量資料之后，制定了以“晏子為何使楚”為主題的微課。在微課中，老師模仿大師單田芳說(shuō)評(píng)書(shū)的風(fēng)格，將晏子使楚的必要性用故事化的形狀告訴學(xué)生。

1.2.2LoXTH23基因克隆

依據(jù)課題組前期轉(zhuǎn)錄組篩選的LoXTH23基因序列，使用Primer Premier 5 軟件以及NCBI 引物設(shè)計(jì)工具設(shè)計(jì)RT-PCR 引物和qRT-PCR 引物，以Actin基因作為內(nèi)參基因(表1)[19]。引物由昆明碩擎生物技術(shù)有限公司合成。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

以cDNA 第1 鏈為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系為50 μL，包括cDNA 模版1 μL，正、反向引物各1 μL，TaqPCR Mix 預(yù)混液25 μL，去離子水22 μL。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸10 min，共30 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。將PCR 純化產(chǎn)物連接至pESI-T 載體上，將10 μL 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，37 ℃培養(yǎng)12 h，經(jīng)由藍(lán)白斑篩選、菌液PCR 及雙酶切驗(yàn)證篩選陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性質(zhì)粒送至昆明碩擎生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR

以對(duì)照組和處理組百合小鱗莖各個(gè)時(shí)期以及不同組織的cDNA 為模板進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40 次循環(huán)；溶解曲線(xiàn)制作：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。采用2—ΔΔCt相對(duì)定量分析法計(jì)算LoXTH23基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4生物信息學(xué)分析

采用生物信息學(xué)軟件對(duì)LoXTH23基因結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)等進(jìn)行分析?；蜷_(kāi)放閱讀框采用ORF finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測(cè)；在BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)進(jìn)行序列比對(duì)和同源序列搜索；蛋白質(zhì)的物理和化學(xué)性質(zhì)采用ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)；蛋白質(zhì)的親水性和疏水性采用ProtScale (http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl)預(yù)測(cè)；蛋白跨膜區(qū)域采用TMHMM Server v.2.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)預(yù)測(cè)；蛋白質(zhì)信號(hào)肽采用SignalP 3.0 Server (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-3.0)預(yù)測(cè)；蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位采用WoLF PSORT (https://wolfpsort.hgc.jp/)預(yù)測(cè)；蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域采用NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析；蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)采用Expasy (htps://www.expasy.org/) 預(yù)測(cè)；蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)采用SWISS-MODEL (https://www.swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)；采用Net Phos (https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/)預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)；采用MEGA 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 LoXTH23 基因克隆及測(cè)序結(jié)果

成功克隆并獲得LoXTH23基因全長(zhǎng)序列的目的條帶，經(jīng)電泳檢測(cè)，擴(kuò)增片段1 104 bp，與目標(biāo)條帶一致(圖1)；測(cè)序序列通過(guò)NCBI ORF Finder 預(yù)測(cè)顯示：開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)858 bp，編碼285個(gè)氨基酸(圖2)。

圖1 LoXTH23 的PCR 產(chǎn)物Fig.1 PCR product of LoXTH23

2.2 LoXTH23 基因所編碼蛋白的理化性質(zhì)

LoXTH23基因編碼的氨基酸殘基序列中存在1 個(gè)典型的保守GH16 結(jié)構(gòu)域，證實(shí) LoXTH23蛋白屬于XTH 家族成員蛋白(圖3)。

圖3 LoXTH23 基因編碼蛋白質(zhì)的保守域Fig.3 Conserved domain of LoXTH23 gene encoded protein

LoXTH23 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量約為3.19 ku，理論等電點(diǎn)為6.19，分子式為C1436H2155N377O430S10，總原子數(shù)為4 408。由20 種氨基酸組成，其中亮氨酸和絲氨酸含量最豐富；甲硫氨酸和谷氨酸含量最低。帶正電荷的殘基(Arg+Lys)總數(shù)為21，帶負(fù)電荷的殘基(Asp+Glu)總數(shù)為23，該蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為40.29；脂肪系數(shù)為70.53，總平均親水性為—0.378。

2.3 LoXTH23 蛋白的疏水性

LoXTH23基因編碼的氨基酸中存在較多區(qū)段處于0 刻度線(xiàn)以下(圖4)，表明該序列中親水性氨基酸殘基的數(shù)量多于疏水性氨基酸殘基，為不穩(wěn)定的親水蛋白。

圖4 LoXTH23 蛋白的疏水性預(yù)測(cè)Fig.4 Hydrophobic prediction of LoXTH23 protein

2.4 LoXTH23 蛋白的跨膜區(qū)及亞細(xì)胞定位

LoXTH23 蛋白序列的跨膜螺旋數(shù)量為0，預(yù)測(cè)跨膜螺旋的氨基酸殘基數(shù)量為0.150 640；該蛋白質(zhì)的前60 個(gè)氨基酸殘基中預(yù)測(cè)的跨膜螺旋氨基酸殘基數(shù)量為0.149 520，N-端位于細(xì)胞質(zhì)側(cè)膜的總概率為0.008 960，接近于0。預(yù)測(cè)整個(gè)蛋白質(zhì)為膜外蛋白的概率超過(guò)1，而為膜內(nèi)蛋白和跨膜蛋白的概率為0 (圖5)。預(yù)測(cè)LoXTH23 蛋白定位于細(xì)胞外基質(zhì)和液泡的分值分別為7 和4，表明 LoXTH23 蛋白可能定位于細(xì)胞外基質(zhì)。

圖5 LoXTH23 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Prediction of the tansmembrance structure of LoXTH23 protein

2.5 LoXTH23 蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)

LoXTH23 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果(圖6)顯示：該蛋白包含有4 種二級(jí)結(jié)構(gòu)，包括44 個(gè)氨基酸形成的α-螺旋(占15.44%)、88 條延伸鏈(占30.88%)、16 個(gè)氨基酸形成的β-轉(zhuǎn)角(占5.61%)和137 條隨機(jī)卷曲(占40.87%)，因此，該蛋白的主要結(jié)構(gòu)為隨機(jī)卷曲；其三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果(圖7)顯示：該蛋白三維模型主要以無(wú)規(guī)則卷曲為主，符合二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果。

圖6 LoXTH23 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.6 Prediction for the secondary structure of LoXTH23 protein

圖7 LoXTH23 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.7 Prediction for the tertiary structure of LoXTH23 protein

由圖8 可知：LoXTH23基因編碼蛋白的氨基酸殘基原始剪切位點(diǎn)的最大值為0.663，信號(hào)肽最大值為0.684，綜合剪切位點(diǎn)最大值為0.997，平均信號(hào)肽分值為0.840。

圖8 LoXTH23 蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.8 Signal peptide prediction of LoXTH23

2.6 LoXTH23 蛋白磷酸化位點(diǎn)

預(yù)測(cè)LoXTH23 蛋白磷酸化位點(diǎn)為30 個(gè)，其中絲氨酸位點(diǎn)最多(20 個(gè))，表明該蛋白磷酸化位點(diǎn)以絲氨酸為主(圖9)。

圖9 LoXTH23 蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.9 Phosphorylation site prediction of LoXTH23 protein

2.7 LoXTH23 基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

由圖10 可知：百合的LoXTH23與油棕(Elaeis guineensis)聚為一類(lèi)，在進(jìn)化上有一定的同源性，二者親緣關(guān)系較近；與銀白楊(Populus alba)和擬南芥(Arabidopsis thaliana)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖10 LoXTH23 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.10 Phylogenetic tree of LoXTH23

2.8 LoXTH23 基因在小鱗莖不同休眠時(shí)期和不同組織的表達(dá)量

由圖11 可知：試驗(yàn)0 d 時(shí)，LoXTH23基因在百合小鱗莖中的相對(duì)表達(dá)量開(kāi)始升高，并在10 d 時(shí)相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高；該基因在根和小鱗莖中的表達(dá)量高于其他組織，在莖中的表達(dá)量最低。

圖11 LoXTH23 基因在小鱗莖不同休眠時(shí)期(a)和不同組織中(b)的表達(dá)量Fig.11 Expression levels of LoXTH23 gene in different dormant periods of small bulbs (a) and different tissues (b)

3 討論

隨著生活水平和質(zhì)量的提高，人們對(duì)觀(guān)賞植物的需求也在上升。百合作為重要的觀(guān)賞植物，生產(chǎn)受到其休眠期的影響。XTH基因廣泛存在于植物中，通過(guò)調(diào)節(jié)半纖維素的合成影響細(xì)胞壁剛性，進(jìn)而影響細(xì)胞行使功能及植物對(duì)逆境和生長(zhǎng)發(fā)育的響應(yīng)[20-23]，是植物形態(tài)建成的重要參與者之一。相關(guān)研究表明：XTH基因家族也在種子休眠中起到重要作用，如：XTH23基因在龍眼的胚胎早期發(fā)育過(guò)程中起重要作用[17]；天麻的休眠解除與XTHs基因家族密切相關(guān)[16]。因此，分析XTH家族相關(guān)基因在百合鱗莖休眠中的作用及其作用機(jī)理，對(duì)深入了解百合鱗莖休眠機(jī)制和培育百合新品種具有重要意義。

本研究從百合小鱗莖中克隆得到1 個(gè)與休眠解除相關(guān)的基因LoXTH23，其開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)858 bp，編碼285 個(gè)氨基酸，含有1 個(gè)典型的保守GH16 結(jié)構(gòu)域；LoXTH23 蛋白帶負(fù)電荷殘基數(shù)量大于帶正電荷殘基數(shù)量，其亞細(xì)胞主要定位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)外，是1 個(gè)存在信號(hào)肽、能引導(dǎo)蛋白質(zhì)跨膜運(yùn)輸?shù)姆置谛偷鞍?；該蛋白與油棕的同源蛋白聚成一簇，表明這2 個(gè)蛋白之間具有較強(qiáng)的親緣關(guān)系。大豆同源基因GmXTH23亞細(xì)胞定位在細(xì)胞膜上，這可能是不同物種之間的差異所造成的[24]；也有研究表明：細(xì)胞外基質(zhì)存在大量信號(hào)分子，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育及增殖具有重要作用[25]，推測(cè)百合LoXTH23也存在類(lèi)似功能。該結(jié)果為進(jìn)一步研究LoXTH23基因在百合種球休眠中的功能奠定了基礎(chǔ)。

課題組通過(guò)前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析百合種球響應(yīng)外界乙烯信號(hào)誘導(dǎo)解除休眠的過(guò)程，并發(fā)現(xiàn)LoXTH23基因呈差異性表達(dá)；本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)：經(jīng)乙烯溶液處理后，LoXTH23基因在鱗莖開(kāi)始萌發(fā)時(shí)的表達(dá)量顯著上調(diào)，表明該基因在百合種球打破休眠時(shí)起重要作用；第10 天時(shí)LoXTH23基因的表達(dá)量最高，推測(cè)該基因可能是響應(yīng)乙烯調(diào)控，通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞壁伸長(zhǎng)而促進(jìn)根系生長(zhǎng)，從而在小鱗莖萌發(fā)前期起作用。??KIL 等[26]研究證實(shí)：外界脅迫下，擬南芥XTH家族基因，特別是AtXTH23促進(jìn)了擬南芥根系的生長(zhǎng)，這與本研究結(jié)果相似，但該基因如何參與調(diào)控百合鱗莖細(xì)胞壁的生理活動(dòng)、在休眠信號(hào)通路上起到何種作用等具體功能還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

LoXTH23基因可能在西伯利亞百合小鱗莖休眠解除調(diào)控進(jìn)程與萌發(fā)中起重要作用。