宗亞倩，全 偉，李建平，何承剛，姜 華

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省農(nóng)村科技服務(wù)中心，云南 昆明 650021)

紫花苜蓿(Medicago SativaL.)是豆科(Leguminosae)多年生草本植物，其分布廣泛、營養(yǎng)豐富、適口性好、適應(yīng)性強(qiáng)，而且還具有固氮、提高土壤肥力、提高土壤有機(jī)質(zhì)含量和改善土壤理化性質(zhì)的作用，既是優(yōu)良的牧草，又是優(yōu)良的綠肥作物資源，被譽(yù)為“牧草之王”[1-3]。此外，紫花苜蓿還具有較好的生態(tài)價(jià)值，是生態(tài)修復(fù)研究的重要植物[4]。課題組發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿存在紅莖和綠莖個(gè)體，且兩者僅莖色存在差異。植物莖色變化通常是多種因素協(xié)同作用的結(jié)果，其中最重要的影響因素是色素的種類及含量[5]。探明紅莖紫花苜蓿莖中的色素種類和含量，可以為紫花苜蓿新品種的培育提供理論依據(jù)。

植物呈色主要受葉綠素、類胡蘿卜素、甜菜紅素和類黃酮化合物等色素群在植物體內(nèi)的種類、含量和比例調(diào)控[6-8]。葉綠素和類胡蘿卜素作為光合色素在植物光合作用中起重要作用，是使植物呈綠色和橙黃色的主要色素[9]。當(dāng)葉綠素含量高于類胡蘿卜素含量時(shí)，葉片呈綠色，反之葉片表現(xiàn)為黃色[10]。胡永紅等[11]研究表明：秋色葉的葉色變化主要是由于光合產(chǎn)物發(fā)生改變，引起植物葉片內(nèi)各種色素的比例發(fā)生變化，致使葉片呈現(xiàn)不同色彩。甜菜紅素是使植物呈現(xiàn)黃色、紅色和紫色的色素，多存在于石竹目(Caryophyllales)的大部分科中，通常與花青素相互排斥[12]。花青素屬于黃酮類化合物，多存在于花、果實(shí)、莖、葉和儲(chǔ)藏器官中，常通過糖苷鍵與糖基結(jié)合形成結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定的花青素苷[13]，是使植物呈紅橙色到藍(lán)紫色的物質(zhì)基礎(chǔ)[14]。不同色系的菊花(Dendranthema morifolium)正是由于花青苷含量的差異而表現(xiàn)出不同的花色，其花青素苷含量越高花色越深[15]。安欣等[16]通過分光光度法測定色素含量與彩色樹種紫葉稠李(Prunus wilsonii)、春雪海棠(Malus‘Spring snow’)、王族海棠(Malus‘Royalty’)、火焰衛(wèi)矛(Euonymus alatus‘Compacta’)和銀白械(Acer saccharinum)葉片顏色的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)花青素在紫(紅)色系彩葉植物葉片的呈色中占主導(dǎo)作用。此外，花青素苷與葉綠素含量的比值越大，葉片顏色越紅[17]。LUO 等[18]發(fā)現(xiàn)：花青素含量增加、葉綠素和類胡蘿卜素含量降低是牡丹(Paeonia suffruticosaAndrews)新葉呈紅色的原因?？s合單寧(原花青素)大部分由兒茶素和表兒茶素構(gòu)成，一般呈紅棕色[19]，廣泛地分布于植物的不同器官和組織中[20]。劉玉皎[21]研究發(fā)現(xiàn)：蠶豆(Vicia fabaL.)種皮顏色與縮合單寧的含量呈正相關(guān)。縮合單寧和花青素在生物合成過程前期受到相同基因控制，由此推測縮合單寧可能是使紫花苜蓿莖稈顏色產(chǎn)生差異的原因之一。

目前對于植物外在顏色差異的探究主要集中在鮮花[14]、彩葉植物[22-24]和部分深色水果中[25]，對于紫花苜蓿莖呈紅色的機(jī)制未見報(bào)道。因此，本研究通過測定2 種莖色紫花苜蓿莖和葉中的色素種類以及色素和縮合單寧的含量，分析其與紅莖紫花苜蓿形成的相關(guān)性，旨在揭示紅莖紫花苜蓿呈色的生理基礎(chǔ)，以期為闡明其呈色機(jī)理提供初步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以云南農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)實(shí)踐教學(xué)基地(N25°8′，E102°45′)的3 年生WL525 紫花苜蓿為研究材料，采用小區(qū)種植，小區(qū)面積10 m2，等距離條播，行距10 cm，田間管理一致。于2022年3 月3 日分別選取長勢一致、無病蟲害的開花初期紅莖和綠莖WL525 紫花苜蓿各5 株，單株為1 個(gè)重復(fù)，裝入自封袋密封帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1色素定性分析

取新鮮莖和葉各0.1 g，液氮研磨后分別加入各裝有5 mL 石油醚、26～28%氨水和10%鹽酸的試管中，過濾后對其濾液顏色進(jìn)行觀察并記錄，每份材料重復(fù)3 次。根據(jù)顏色判斷是否含有類胡蘿卜素、花青素苷和類黃酮等成分。

1.2.2葉綠素和類胡蘿卜素含量的測定

采用丙酮浸提法[26]提取。稱取莖和葉約0.1 g，放入裝有丙酮—乙醇(體積比為1∶2)提取液10 mL 的試管中，避光浸提，直到紫花苜蓿組織完全變白后再測定吸光度。葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量采用ARNON[27]的方法計(jì)算。

1.2.3花青素苷含量的測定

采用鹽酸乙醇浸提法提取花青素苷。分別稱取新鮮紫花苜蓿的莖和葉0.1 g，在液氮中研磨成粉狀，放入裝有鹽酸—乙醇(體積比為15∶85)提取液10 mL 的試管中，在黑暗、4 ℃下萃取24 h，然后在12 000 r/min 下離心10 min，取上清液，測定530、620 和650 nm 處的吸光度。根據(jù)公式(OD530—OD620)—0.1×(OD650—OD620)計(jì)算花青素苷的吸光度，按照0.1 個(gè)吸光度為1 個(gè)花青素苷單位，計(jì)算出紫花苜蓿莖和葉中的花青素苷含量[28]。

1.2.4縮合單寧含量的測定

采用香草醛—鹽酸法提取縮合單寧，利用蘇州格銳思生物科技有限公司原花青素含量試劑盒測定其含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

各指標(biāo)重復(fù)測定3 次。采用Excel 2013 整理數(shù)據(jù)和繪制圖表；采用SPSS 20 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及顯著性檢驗(yàn)；莖間、葉間以及同一植株不同部位之間的差異采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅莖與綠莖紫花苜蓿的色素類型

由表1 可知：從類胡蘿卜素特征顯色反應(yīng)來看，紅莖與綠莖紫花苜蓿的莖均顯示為無色，葉分別顯示為淺黃色和黃色，說明這2 種材料莖中無類胡蘿卜素，葉中可能含有或少量含有類胡蘿卜素；從類黃酮特征顯色反應(yīng)來看，紅莖紫花苜蓿的莖和葉以及綠莖紫花苜蓿的葉顯示為黃色，說明其中含有類黃酮成分，而綠莖紫花苜蓿的莖顯示為淺黃色，說明它含有極少量類黃酮；從花青素苷特征顯色反應(yīng)來看，紅莖紫花苜蓿的莖顯示為紫紅色，說明其莖中應(yīng)該含有大量花青素苷，而綠莖紫花苜蓿的莖和葉顯示為無色和淺黃色，表明它們不含和含有極少量花青素苷?？梢姡? 種莖色紫花苜蓿所含有的類黃酮和花青素苷種類或含量可能不同。

表1 紅莖與綠莖紫花苜蓿莖和葉類胡蘿卜素、類黃酮和花青素苷顯色反應(yīng)Tab.1 Color reaction of carotenoid,flavonoid and anthocyanin glycosides in stems and leaves of red-stem and green-stem alfalfa

2.2 紅莖與綠莖紫花苜蓿的葉綠素含量

由表2 可知：2 種莖色紫花苜蓿葉綠素a 含量范圍為0.09～0.89 mg/g，其中莖中葉綠素a 含量范圍為0.09～0.11 mg/g，而葉中葉綠素a 含量范圍為0.86～0.89 mg/g；紅莖和綠莖紫花苜蓿葉中葉綠素a 含量均顯著高于莖中的含量(P＜0.05)，2 種莖色的紫花苜蓿莖間、葉間葉綠素a 含量的差異均不顯著(P＞0.05)。2 種莖色紫花苜蓿葉綠素b 含量的變化范圍為0.03～0.15 mg/g，其中莖中葉綠素b 含量范圍為0.03～0.04 mg/g，而葉中葉綠素b 含量為0.15 mg/g；紅莖和綠莖紫花苜蓿葉中葉綠素b 的含量均顯著高于莖中的含量(P＜0.05)，2 種莖色的紫花苜蓿莖間、葉間葉綠素b 含量的差異均不顯著(P＞0.05)。2 種莖色紫花苜?？?cè)~綠素含量的范圍為0.12～1.15 mg/g，其中莖中總?cè)~綠素含量范圍為0.12～0.15 mg/g，而葉中總?cè)~綠素含量范圍為1.12～1.15 mg/g；紅莖和綠莖紫花苜蓿葉中總?cè)~綠素的含量均顯著高于莖中含量(P＜0.05)，2 種莖色的紫花苜蓿莖間、葉間總?cè)~綠素含量的差異均不顯著(P＞0.05)。

表2 紅莖與綠莖紫花苜蓿莖和葉的葉綠素含量Tab.2 Chlorophyll contents in stems and leaves of red-stem and green-stem alfalfa mg/g

2.3 紅莖與綠莖紫花苜蓿的類胡蘿卜素含量

由圖1 可知：紅莖和綠莖紫花苜蓿葉中的類胡蘿卜素含量顯著高于莖中的含量(P＜0.05)，其葉中的類胡蘿卜素含量分別為0.22 和0.21 mg/g，分別是同株紫花苜蓿莖中類胡蘿卜素含量的9.48 倍和9.41 倍；2 種莖色的紫花苜蓿莖間、葉間類胡蘿卜素含量的差異均不顯著(P＞0.05)。

圖1 紅莖與綠莖紫花苜蓿莖和葉的類胡蘿卜素含量Fig.1 Carotenoid contents in stems and leaves of red-stem and green-stem alfalfa

2.4 紅莖與綠莖紫花苜蓿的花青素苷含量

由圖2 可知：2 種莖色紫花苜蓿莖中的花青素苷含量均顯著高于葉中(P＜0.05)，且紅莖紫花苜蓿莖中的花青素苷含量顯著高于綠莖紫花苜蓿的莖 (P＜0.05)，且是綠莖的8.80 倍；紅莖與綠莖葉片之間花青素苷含量無顯著差異 (P＞0.05)；

圖2 紅莖與綠莖紫花苜蓿莖和葉花青素苷含量Fig.2 Anthocyanin glycosides contents in stems and leaves of red-stem and green-stem alfalfa

2.5 紅莖與綠莖紫花苜蓿的縮合單寧含量

由圖3 可知：紅莖紫花苜蓿莖中的縮合單寧含量是綠莖紫花苜蓿莖中含量的5.05 倍(P＜0.05)，但兩者葉片的縮合單寧含量無顯著差異(P＞0.05)；紅莖紫花苜蓿莖中的縮合單寧含量顯著高于葉中(P＜0.05)，而綠莖紫花苜蓿莖與葉間則呈相反現(xiàn)象(P＜0.05)。

圖3 紅莖與綠莖紫花苜蓿莖和葉縮合單寧含量Fig.3 Condensed tannins contents in stems and leaves of red-stem and green-stem alfalfa

2.6 紅莖與綠莖紫花苜蓿不同部位花青素苷與總?cè)~綠素的比值

由圖4 可知：2 種莖色紫花苜蓿葉中花青素苷與總?cè)~綠素的比值較小，說明葉中花青素苷含量相對較低，葉綠素含量相對較高，葉片表現(xiàn)為綠色；就同一植物的莖和葉而言，2 種莖色紫花苜蓿莖中花青素占比均顯著高于其葉中(P＜0.05)，尤其是紅莖最為明顯，這與2 種紫花苜蓿中花青素苷含量的差異規(guī)律一致。

圖4 不同部位花青素苷與總?cè)~綠素比值Fig.4 Ratio of anthocyanin glycosides to total chlorophyll of different parts

3 討論

植物顏色形成機(jī)制復(fù)雜，涉及葉綠素、類胡蘿卜素、花青素等諸多色素物質(zhì)[5]。有研究表明：植物黃綠程度與類黃酮、類胡蘿卜素和葉綠素的含量顯著正相關(guān)，紅色程度則與花青素苷含量顯著相關(guān)[29-31]。本研究中，2 種莖色的WL525紫花苜蓿葉中的葉綠素和類胡蘿卜素含量均顯著高于莖中的含量，這是因?yàn)槿~綠素和類胡蘿卜素是進(jìn)行光合作用的主要色素，兩者在葉片中的含量占絕對優(yōu)勢，使得葉片呈綠色，這與大多數(shù)植物的顯色規(guī)律一致[9]。

本研究發(fā)現(xiàn)：紅莖紫花苜蓿莖中的花青素苷和縮合單寧含量均顯著高于綠莖。已有研究表明：一些黃酮和單寧類等物質(zhì)可能作為花青素苷的共色素，有助于增強(qiáng)其穩(wěn)定性[32]，共同影響植物顏色。徐展宏等[33]和GONG 等[34]在對紅葉青錢柳(Cyclocarya paliurus)柳葉泛紅和熱帶地區(qū)幼葉短暫變紅的研究中發(fā)現(xiàn)：葉片呈現(xiàn)紅色的主要原因與花青素和縮合單寧含量增加有關(guān)。廖金花等[19]的研究也表明：顏色越深的植物，單寧含量越高。雖然紅莖紫花苜蓿莖中的花青素苷含量較高，但是植物呈色是多種色素綜合作用的結(jié)果。因此，將植物不同部位的花青素苷與總?cè)~綠素的比值進(jìn)行比較，其比值越大，顏色越紅。紅莖中花青素苷與葉綠素的比值最大，說明紅莖中花青素的絕對含量最高，這一結(jié)果與孫宜等[35]的觀點(diǎn)一致，即比值越大，顏色越紅。

花青素和縮合單寧含量受遺傳性狀和外界環(huán)境的雙重影響。兩者在生物合成過程的前期受到相同基因控制[36]，若在合成過程中基因作用的方式發(fā)生改變，可能會(huì)導(dǎo)致紅莖紫花苜蓿莖中調(diào)控花青素的合成與分解的某個(gè)基因發(fā)生改變；另外，植物花青素和縮合單寧的積累與其生長過程的外界環(huán)境密切相關(guān)[37-38]。低溫、全日照、干旱均可促進(jìn)植物器官花青素苷的積累和顏色加深[39]。紫葉小檗(Berberis thunbergii)葉在全光照下為深紅色，隨光強(qiáng)降低、花青素含量減少而逐漸變淺[40]。曹晶等[41]研究發(fā)現(xiàn)：植物體內(nèi)水分降低到一定范圍時(shí)會(huì)加快花青素的合成，使其含量增加。本研究的材料來自同一個(gè)品種，且栽培條件相同，因此，紅莖紫花苜蓿莖中的花青素苷和縮合單寧含量顯著高于綠莖，這可能是基因變異所致，還需要從紅莖紫花苜蓿花青素生物合成的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究。

4 結(jié)論

紅莖和綠莖紫花苜蓿葉中的葉綠素和類胡蘿卜素含量較高，花青素苷和縮合單寧含量增加是出現(xiàn)紅莖紫花苜蓿的主要原因。