李亞男， 陸霖青， 張 鵬， 張 博， 林 蠡*， 秦真東*

(1. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，廣東省水環(huán)境與水產(chǎn)品安全工程技術(shù)研究中心，廣州市水產(chǎn)病害與水禽養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510225；2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 510300)

羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda)軟甲綱(Malacostraca)沼蝦屬(Macrobrachium)，原產(chǎn)于東南亞，自20世紀(jì)60年代從日本引進(jìn)中國(guó)，現(xiàn)已成功實(shí)現(xiàn)人工繁育，目前在國(guó)內(nèi)多省市均有養(yǎng)殖。羅氏沼蝦因其生長(zhǎng)快、肉質(zhì)鮮美，經(jīng)濟(jì)效益明顯，已成為我國(guó)重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)蝦類之一[1]。然而近年來(lái)，隨著養(yǎng)殖密度的加大，細(xì)菌性疾病、真菌性疾病、病毒性疾病和寄生蟲病等不斷暴發(fā)，嚴(yán)重危害沼蝦養(yǎng)殖業(yè)，給該行業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。

羅氏沼蝦缺乏比較完善的獲得性免疫系統(tǒng)，主要依靠凝血、凝集、吞噬、酚氧化酶原激活系統(tǒng)、抗菌肽以及呼吸爆發(fā)產(chǎn)生活性氧分子(ROS)等先天性免疫方式抵御病原入侵[4-6]。其中，持續(xù)高水平的ROS在發(fā)揮殺菌功能的同時(shí)，會(huì)增加機(jī)體氧化應(yīng)激水平，引發(fā)氧化損傷，細(xì)胞凋亡等，降低機(jī)體防御能力[7-10]，因此，合理的ROS水平對(duì)于維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)、提高抵抗力至關(guān)重要。研究表明，超氧化物歧化酶(SODs)是消除生物體內(nèi)過(guò)量ROS的第一道防線，可特異性地將超氧陰離子自由基(O2?·)歧化為過(guò)氧化氫(H2O2)，進(jìn)一步由過(guò)氧化氫酶(CAT)轉(zhuǎn)化為無(wú)毒的水分子[11]，蛋白質(zhì)[8-10]是無(wú)脊椎動(dòng)物先天性免疫非常重要的組成部分[12-13]。但是，SODs在水產(chǎn)甲殼動(dòng)物中的研究還處于初級(jí)階段，詳細(xì)了解其分子生物學(xué)特性和免疫功能對(duì)于良種培育和病害防控都有積極的意義。因此，本研究克隆了羅氏沼蝦胞質(zhì)MnSOD基因(MrcMnSOD)，制備了多克隆抗體，對(duì)其在不同組織中的表達(dá)模式進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平的分析，此外，初步探討了該蛋白質(zhì)的免疫功能，旨在為深入研究羅氏沼蝦SOD的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用羅氏沼蝦購(gòu)自廣東金洋水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，平均體長(zhǎng)(10±2) cm，暫養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室28 °C充氣循環(huán)水中，適應(yīng)1周后開始實(shí)驗(yàn)，經(jīng)麻醉后取樣，樣品置于?80 °C冰箱用于后續(xù)提取RNA。實(shí)驗(yàn)所用嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)，使用前先于37 °C無(wú)抗LB培養(yǎng)基中過(guò)夜活化，后用無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗菌體3次，使用無(wú)菌PBS重懸菌液至濃度為1×106CFU/mL[14]時(shí)進(jìn)行腹部注射。本研究獲得了仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中操作人員嚴(yán)格遵守相關(guān)規(guī)范，并按照倫理委員會(huì)制定的規(guī)章制度執(zhí)行實(shí)驗(yàn)操作。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

TRIzol Reagent、PCR Mix、大腸桿菌(Escherichia coli) DH5α、大腸桿菌 BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞、EcoRⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、His標(biāo)簽特異性層析柱購(gòu)于寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司(TaKaRa)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒GoldenstarTMRT6 cDNA Synthesis Kit購(gòu)自北京擎科生物科技有限公司。一步克隆試劑盒(ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit)、凝膠回收試劑盒購(gòu)于南京諾唯贊生物科技股份有限公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)采用quantinova-SYBR-Green PCR試劑盒。Bradford蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。小鼠(Mus musculus)抗His-tag抗體，HRP標(biāo)記山羊抗小鼠Ig G購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。引物以及其他無(wú)特殊說(shuō)明的試劑均購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 總RNA提取和基因克隆

使用TRIzol法進(jìn)行總RNA提取后，使用超微量分光光度計(jì)NP80 (IMPLEN，德國(guó))檢測(cè)RNA的純度，當(dāng)A260/A280達(dá)到1.8～2.0后進(jìn)行下一步操作。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明，逆轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA。根據(jù)GenBank中MrcMnSOD開放閱讀框序列(ABU55005.1，編碼286個(gè)氨基酸)，設(shè)計(jì)該基因一步克隆引物MrcMnSOD-32a S和MrcMnSOD-32a A(表1)，以cDNA為擴(kuò)增模板，擴(kuò)增MrcMnSOD序列，擴(kuò)增得到的基因序列需經(jīng)膠回收純化。

表1 引物序列Tab. 1 Primers used in this study

1.4 重組蛋白質(zhì)表達(dá)與純化

根據(jù)一步克隆試劑盒操作說(shuō)明，將純化后的基因擴(kuò)增產(chǎn)物與線性化的PET-32a載體進(jìn)行同源重組反應(yīng)，構(gòu)建重組質(zhì)粒PET-32a-MrcMnSOD。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行陽(yáng)性克隆子篩選。陽(yáng)性克隆子經(jīng)測(cè)序檢驗(yàn)正確后，進(jìn)一步提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 (DE3)表達(dá)菌株進(jìn)行重組蛋白質(zhì)表達(dá)。37 °C、200 r/min的條件下，表達(dá)菌在含有氨芐的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6后，添加0.1 mmol/L 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷在37 °C下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)5～6 h，誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)大量表達(dá)。離心收集菌體，PBS清洗菌體3次后，重懸菌體并在低溫下進(jìn)行超聲波破碎，使用12%的變性聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白質(zhì)檢測(cè)融合蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。使用寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司His標(biāo)簽特異性層析柱對(duì)上清蛋白質(zhì)進(jìn)行純化回收，操作詳見使用手冊(cè)。

1.5 抗體制備與檢測(cè)

收集純化后的重組蛋白質(zhì)送至武漢福因德公司免疫新西蘭大白兔(Oryctolagus cuniculus)，獲得兔源性MrcMnSOD多克隆抗體?？贵w制備完成后，采用酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法(ELISA)檢測(cè)抗體效價(jià)。為檢測(cè)抗體特異性，采集羅氏沼蝦新鮮組織樣品0.5 mg制備組織蛋白質(zhì)樣品：加入1 mL RIPA裂解液，冰上研磨至組織充分裂解，4 °C下12 000 r/min 離心5 min，取上清液與蛋白質(zhì)上樣緩沖液混合煮沸10 min進(jìn)行12% SDS-PAGE凝膠電泳。電泳后進(jìn)行半干轉(zhuǎn)膜，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST清洗3次，每次5 min。5%脫脂奶粉稀釋小鼠抗His-tag抗體至1∶1 000 (體積比)，4 °C過(guò)夜孵育，TBST清洗3次，每次5 min。再用HRP標(biāo)記山羊抗小鼠二抗Ig G (1∶10 000)孵育1 h后，TBST緩沖液洗滌3次，每次5 min。其中，脫脂奶粉溶于TBST中。最后ECL顯色1 min，使用化學(xué)發(fā)光及熒光成像系統(tǒng)Chemi Scope 6 000拍照。

1.6 組織表達(dá)模式分析

將羅氏沼蝦隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組每尾蝦腹肌注射活化后的100 μL 1×106CFU/mL嗜水氣單胞菌，對(duì)照組每尾注射等量無(wú)菌PBS。注射后0、3、6、12和24 h，采集肝胰腺和腸組織進(jìn)行總RNA提取、cDNA逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR，以18SrRNA為內(nèi)參基因(表1)，分析基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)模式。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3尾蝦進(jìn)行混樣，平均取3次。20 μL qRT-PCR反應(yīng)體系：2×SYBR Green PCR Master Mix QN 10 μL，RNase-free water 7 μL，cDNA模板(5倍稀釋) 2 μL，引物MrcMnSOD S1/MrcMnSOD A1各0.5 μL。反應(yīng)條件：95 °C 2 min；95 °C 5 s，60 °C 30 s，72 °C 40 s，40個(gè)循環(huán)。采用2?ΔΔCt法計(jì)算mRNA水平相對(duì)表達(dá)量。蛋白質(zhì)水平表達(dá)模式分析取攻毒后12和24 h的肝胰腺、腸組織保存于4%的多聚甲醛中，后送至武漢賽維爾生物科技有限公司進(jìn)行組織蠟片制備和組織免疫熒光分析。

1.7 抑菌實(shí)驗(yàn)

抑菌實(shí)驗(yàn)參照Z(yǔ)heng等[15]的方法進(jìn)行，略作修改。選取3種革蘭氏陰性菌[嗜水氣單胞菌、大腸桿菌、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)]以及2種革蘭氏陽(yáng)性菌[無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)]，與MrcMnSOD進(jìn)行共培養(yǎng)，檢測(cè)重組蛋白質(zhì)的抑菌效果。實(shí)驗(yàn)開始前，先將菌株過(guò)夜活化，使用無(wú)菌PBS清洗菌體3次后，重懸菌液調(diào)整濃度至2×107CFU/mL。培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)在37°C下、96孔酶標(biāo)板中進(jìn)行，蛋白質(zhì)終濃度分別設(shè)置為50和100 μg/mL，PBS作為空白對(duì)照，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每小時(shí)用酶標(biāo)儀讀取A630值。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 21.0軟件中單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，分析差異性。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD) (n=3)表示。P＜0.05和P＜0.01分別被認(rèn)為有顯著差異和極顯著差異。使用Graphpad prism 7.0軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白質(zhì)表達(dá)與純化

經(jīng)0.1 mmol/L IPTG 37 °C誘導(dǎo)5～6 h后，重組蛋白質(zhì)可在上清液中大量表達(dá)(圖1)。MrcMnSOD蛋白質(zhì)開放閱讀框由286個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量約為31 ku，PET-32a載體標(biāo)簽蛋白質(zhì)約為18 ku，因此推測(cè)表達(dá)的融合蛋白質(zhì)約為49 ku，與SDSPAGE檢測(cè)結(jié)果一致。純化后的上清液重組蛋白質(zhì)純度可達(dá)95 %以上，濃度達(dá)到1 mg/mL，滿足后續(xù)抗體制備送樣要求。用制備的MrcMnSOD多克隆抗體作為一抗進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)羅氏沼蝦組織樣品中的MrcMnSOD (圖1，第1泳道)，在約31 ku 處檢測(cè)到1條特異性蛋白質(zhì)條帶，大小和預(yù)測(cè)的MrcMnSOD蛋白質(zhì)一致，說(shuō)明制備的多克隆抗體特異性好。

圖1 MrcMnSOD的SDS-PAGE檢測(cè)圖M. 蛋白質(zhì)marker，1. MrcMnSOD多克隆抗體鑒定，2. IPTG誘導(dǎo)前菌體總蛋白質(zhì)，3. IPTG誘導(dǎo)后菌體總蛋白質(zhì)，4. 誘導(dǎo)后上清液總蛋白質(zhì)，5. 純化后的重組蛋白質(zhì)。Fig. 1 SDS-PAGE detection of MrcMnSODM. protein marker, 1. detection of polyclonal antibody of MrcMnSOD,2. total protein from E. coli BL21 (DE3) before IPTG induction, 3. total protein from E. coli BL21 (DE3) after IPTG induction, 4. total supernatant protein, 5. the purified recombinant protein.

2.2 抗體效價(jià)檢測(cè)

ELISA效價(jià)檢測(cè)結(jié)果顯示，制備的MrcMnSOD多克隆抗體效價(jià)可達(dá)6 250 000倍(圖2)。

2.3 轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)模式分析

為了評(píng)估MrcMnSOD是否參與羅氏沼蝦對(duì)嗜水氣單胞菌的免疫反應(yīng)，采用qRT-PCR分析了嗜水氣單胞菌感染羅氏沼蝦后肝胰腺和腸組織中的基因表達(dá)變化。結(jié)果顯示，MrcMnSOD在肝胰腺中的表達(dá)量在感染后3 h達(dá)到峰值，隨后逐漸恢復(fù)(圖3-a)。腸組織中，MrcMnSOD表達(dá)量隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增大，感染后6 h達(dá)到峰值，之后表達(dá)量雖有所降低，但依然顯著高于對(duì)照組(圖3-b)。該結(jié)果表明，嗜水氣單胞菌感染可顯著激活MrcMnSOD的基因表達(dá)水平。

圖3 嗜水氣單胞菌感染后MrcMnSOD表達(dá)變化(a) 肝胰腺；(b) 腸。*. P＜0.05，**. P＜0.01。Fig. 3 Expression of MrcMnSOD after A. hydrophila infection(a) hepatopancreas；(b) intestine. *. P＜0.05, **. P＜0.01.

2.4 蛋白質(zhì)水平表達(dá)模式分析

嗜水氣單胞菌感染后，采用組織免疫熒光法檢測(cè)羅氏沼蝦肝胰腺和腸組織中MrcMnSOD表達(dá)變化。結(jié)果顯示，肝胰腺中MrcMnSOD隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)水平持續(xù)增高，感染后24 h達(dá)到峰值(圖版Ⅰ)。腸中MrcMnSOD表達(dá)水平在感染后12 h達(dá)到峰值，之后表達(dá)水平下降(圖版Ⅱ)。結(jié)果表明，嗜水氣單胞菌感染可顯著激活MrcMnSOD的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

2.5 抑菌實(shí)驗(yàn)

為了初步探究MrcMnSOD參與免疫反應(yīng)的機(jī)制，本研究選取5種常見細(xì)菌與重組蛋白質(zhì)進(jìn)行共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，MrcMnSOD可顯著抑制3種革蘭氏陰性菌和2種革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)。對(duì)于嗜水氣單胞菌而言，100 μg/mL重組蛋白質(zhì)的抑菌效果高于50 μg/mL，而在其他幾種細(xì)菌的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，MrcMnSOD抑菌效果與蛋白質(zhì)濃度的依賴關(guān)系不顯著(圖4)。

圖4 MrcMnSOD抑菌效果檢測(cè)(a) 嗜水氣單胞菌；(b) 副溶血性弧菌；(c) 大腸桿菌；(d) 無(wú)乳鏈球菌；(e) 金黃色葡萄球菌。Fig. 4 Antibacterial effect detection of MrcMnSOD(a) A. hydrophila; (b) V. parahemolyticus; (c) E. coli; (d) S. agalactiae; (e) S. aureus.

3 討論

羅氏沼蝦口味鮮美，富含豐富的微量元素和氨基酸，受到消費(fèi)者的喜愛。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年中國(guó)羅氏沼蝦的養(yǎng)殖產(chǎn)量接近14萬(wàn)t[16-17]，是中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物之一。但是，近年來(lái)隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大以及集約型養(yǎng)殖模式的推廣，羅氏沼蝦養(yǎng)殖業(yè)病害頻發(fā)，嚴(yán)重危害該產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[18-19]。嗜水氣單胞菌是養(yǎng)殖水體中一類重要的條件致病菌，可感染羅氏沼蝦肝胰腺，引起孵化期和生長(zhǎng)期的較高死亡率[20-21]。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)蝦黑斑壞死病與嗜水氣單胞菌屬和其他病原菌，如弧菌和假單胞菌的聯(lián)合感染有關(guān)。因此，嗜水氣單胞菌侵染過(guò)程中的免疫機(jī)制近年來(lái)也備受關(guān)注[14]。

SODs是無(wú)脊椎動(dòng)物先天性免疫的重要組成部分[7,22]。在哺乳動(dòng)物中，MnSOD被認(rèn)為是一種應(yīng)激因子，其表達(dá)水平可能受環(huán)境和生物刺激的影響[23]。本研究中，嗜水氣單胞菌感染期間，羅氏沼蝦MrcMnSOD在基因表達(dá)水平和蛋白質(zhì)表達(dá)水平都被顯著激活，表明該基因參與了細(xì)菌感染期間機(jī)體氧化還原穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)與抗菌免疫，這與前人的研究報(bào)道相一致。如Lin等[24]克隆了日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeus japonicus)的cMnSOD，并發(fā)現(xiàn)在溶藻弧菌(V. alginolyticus)的刺激下，該基因能在血淋巴中異常高表達(dá)。有學(xué)者報(bào)導(dǎo)cMnSOD可在凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei) 感染白斑綜合征病毒免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用[25]。Cheng等[26]雖克隆了MrcMnSOD，證實(shí)該基因參與格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)的免疫應(yīng)答，但并未對(duì)其免疫機(jī)制做進(jìn)一步解釋，硬骨魚類、甲殼類和軟體動(dòng)物中也報(bào)道了類似的發(fā)現(xiàn)[7,27-30]。然而，以上研究主要集中在病原體入侵后該基因表達(dá)水平的變化，少有研究其蛋白水平的表達(dá)變化，對(duì)其抗菌免疫機(jī)制也未做進(jìn)一步研究。

本研究通過(guò)抑菌實(shí)驗(yàn)，初步探究了MrcMnSOD參與免疫反應(yīng)的可能機(jī)制。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組添加MrcMnSOD后，5種細(xì)菌生長(zhǎng)明顯受到抑制，提示MrcMnSOD可能作為一種免疫相關(guān)因子參與免疫應(yīng)答。但對(duì)于不同細(xì)菌而言，抑菌效果不盡相同，如嗜水氣單胞菌抑菌實(shí)驗(yàn)中，抑菌效果隨著蛋白質(zhì)濃度的增大而增強(qiáng)，這種現(xiàn)象在其他幾種細(xì)菌中并不顯著，推測(cè)這可能與不同細(xì)菌表面組成差異相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，鮻 (Liza haematocheila)的MnSOD可顯著抑制格氏乳球菌、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)和大腸桿菌的生長(zhǎng)[31]。Zheng等[15]對(duì)魁蚶(Scapharca broughtonii) MnSOD抗菌功能研究表明，魁蚶MnSOD可抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌的生長(zhǎng)，且抑制作用與蛋白質(zhì)濃度關(guān)系不顯著，與當(dāng)前實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。另有報(bào)道稱，羅氏沼蝦CuZnSOD可通過(guò)凝集效應(yīng)發(fā)揮抑菌效果[32]，但MrcMnSOD是否具有和CuZnSOD同樣的抑菌機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究證實(shí)?？傊?，本研究闡釋了MrcMnSOD可能作為免疫相關(guān)分子參與抗菌應(yīng)答的依據(jù)，為今后羅氏沼蝦病害防控相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

（作者聲明本文無(wú)實(shí)際或潛在的利益沖突）