陳雨露， 徐成勛， 劉士凱， 孔令鋒， 李 琪,2*

(1. 中國海洋大學(xué)，海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003；2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237)

長牡蠣(Crassostrea gigas)又稱太平洋牡蠣，因其繁殖力高、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、養(yǎng)殖周期短、營養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，已成為世界上最為重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類，其產(chǎn)量連續(xù)多年高居世界之首。作為我國商業(yè)化利用程度高的貝類養(yǎng)殖品種，2020年牡蠣全國海水養(yǎng)殖產(chǎn)量約為542萬t[1]。目前，我國長牡蠣養(yǎng)殖所用苗種主要來源于人工育苗，培育生產(chǎn)性能優(yōu)良、品質(zhì)與品相兼?zhèn)涞男缕贩N，對進(jìn)一步提升牡蠣的產(chǎn)值，促進(jìn)牡蠣產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展尤為重要。

殼色作為海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類的外觀性狀，影響著消費(fèi)者的喜好，在提升貝類附加值方面發(fā)揮著重要的作用。殼色性狀的選擇育種和遺傳學(xué)研究一直受到育種工作者的關(guān)注[2-4]，國內(nèi)已相繼培育出長牡蠣、櫛孔扇貝(Azumapecten farreri)、菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)和文蛤(Meretrix meretrix)等[5-8]殼色新品種，推動了我國貝類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的良種化。在長期的牡蠣育種實(shí)踐中，已獲得了長牡蠣橙色殼色突變體品系，通過品系間雜交和群體選育開發(fā)出長牡蠣殼橙快速生長優(yōu)良品系，為長牡蠣新品種培育提供了重要素材。

經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳參數(shù)評估是水產(chǎn)動物遺傳改良過程中的一項(xiàng)基礎(chǔ)工作。其中，狹義遺傳力是加性方差在表型方差中所占的比例，有助于判斷親本性狀遺傳給后代大小的程度，性狀間的遺傳相關(guān)性則是多性狀選育方案的制定依據(jù)[9]。在長牡蠣的育種中，與經(jīng)濟(jì)價值緊密相關(guān)的生長性狀、存活率、抗逆性、殼型、顏色等遺傳參數(shù)評估相繼報道，并以目標(biāo)性狀遺傳力和不同性狀間的關(guān)聯(lián)性為依據(jù)，制定了育種計劃[10-14]。同一性狀的遺傳參數(shù)因生長環(huán)境、品系而異，因此，在新品系的繼代選育過程，對特定性狀的遺傳參數(shù)進(jìn)行評估，探索其作為目標(biāo)性狀的選育潛力，是確保后續(xù)選育工作取得改良效果的重要前提。

本研究以長牡蠣殼橙快速生長品系為素材，通過巢式交配設(shè)計建立了48個全同胞混養(yǎng)家系，利用微衛(wèi)星親子鑒定技術(shù)獲取系譜信息，采用計算機(jī)視覺系統(tǒng)和Lab顏色模型獲取殼色數(shù)據(jù)，估算殼橙性狀遺傳力及其與生長性狀的關(guān)聯(lián)性，以期為長牡蠣殼橙快速生長品系選育提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計

實(shí)驗(yàn)所用的親本是經(jīng)過連續(xù)3代選育、生長性狀得到改良的橙殼色長牡蠣個體，即第1代長牡蠣殼橙快速生長品系(G1)。2020年4月從山東乳山海區(qū)養(yǎng)殖的第1代長牡蠣殼橙快速生長品系(G1)中選取生長性狀優(yōu)良個體作為親貝，轉(zhuǎn)移至室內(nèi)進(jìn)行人工促熟。2020年5月，長牡蠣親本性腺發(fā)育成熟，辨別雌雄后，利用平衡巢式設(shè)計法進(jìn)行人工授精，1雄配3雌，共建立48個全同胞家系、16個半同胞家系。獲取所有親本的閉殼肌，保存于70%酒精中。

1.2 孵化、苗種培育和養(yǎng)成

人工授精完成后，所有家系幼蟲在100 L聚乙烯桶內(nèi)進(jìn)行孵化，孵化過程中幼蟲密度需保持在20～40個/mL，水溫控制在24oC左右。孵化過程持續(xù)22 h，受精卵發(fā)育至D形幼蟲期時進(jìn)行選優(yōu)，從48個家系中分別取幼蟲密度為30～40個/mL的2 L養(yǎng)殖水體并轉(zhuǎn)移至2個500 L塑料桶中混合培育。苗種培育與養(yǎng)成參照王慶志等[15]的方法，幼蟲密度控制在8～10個/mL，至投放附著基時調(diào)整至2～3個/mL。每日換水1次，每次1/3換水量；每日投喂4次，根據(jù)不同生長階段調(diào)整等鞭金藻(Isochrysis galbana)和扁藻(Platymonassp.)的投喂比例及投喂量。兩個聚乙烯桶的管理操作基本保持一致。當(dāng)眼點(diǎn)幼蟲比例達(dá)30%左右時，投放扇貝殼附著基采苗，幼蟲完成附著和變態(tài)后，轉(zhuǎn)移至室外沉淀池暫養(yǎng)2周。待自然海區(qū)野生牡蠣減少時，將稚貝置于扇貝籠中轉(zhuǎn)移至山東榮成桑溝灣海區(qū)進(jìn)行養(yǎng)成。養(yǎng)成期間各籠內(nèi)的放養(yǎng)密度和所處水層均保持一致。2021年4月從長牡蠣家系混養(yǎng)群體中共收獲863個個體。本研究按照中國海洋大學(xué)《實(shí)驗(yàn)動物使用指南》的標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行。所有動物護(hù)理和使用程序均經(jīng)中國海洋大學(xué)動物機(jī)構(gòu)護(hù)理和使用委員會批準(zhǔn)。

1.3 指標(biāo)測定

生長性狀測定 對所有個體的殼高(SH)、殼長(SL)、殼寬(SW)、總重量(TW)等生長性狀指標(biāo)進(jìn)行測定。用電子游標(biāo)卡尺測量殼高、殼長和殼寬(精確度0.01 mm)，總重量用電子天平測量(精確度為0.01 g)。

殼色性狀測量 采用計算機(jī)視覺系統(tǒng)(CVS, computer vision system)和均勻顏色空間L*a*b*采集、量化殼色數(shù)據(jù)。CVS系統(tǒng)包括標(biāo)準(zhǔn)光源、數(shù)碼相機(jī)和圖像處理軟件。殼色圖像采集過程、相機(jī)參數(shù)設(shè)置以及顏色參數(shù)L、a、b值的讀取參照Wan等[16]的方法。L*、a*、b*和ΔE通過以下公式計算[17-18]：

式中，L*表示明度，a*為紅綠軸色品指數(shù)，b*為黃藍(lán)軸色品指數(shù)，L、a、b分別為所測牡蠣殼的顏色參數(shù)，L*1、a*1、和b*1是子代中某一標(biāo)準(zhǔn)殼橙個體的顏色指標(biāo)，ΔE為色差值。

1.4 家系鑒定

所有雌雄親本以及子代的閉殼肌使用苯酚-氯仿法[19]提取DNA。利用4組多重PCR共12個微衛(wèi)星位點(diǎn)對所有樣品的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，多重PCR擴(kuò)增的組合、引物序列和PCR擴(kuò)增條件見表1。所得的擴(kuò)增產(chǎn)物用ABI3730xl (Applied Biosystems)測序儀進(jìn)行基因分型。經(jīng)GeneMapper v4.0軟件處理得到相應(yīng)位點(diǎn)的片段大小，使用CERVUS 3.0軟件[20]，基于最大似然法，結(jié)合巢式設(shè)計的原則和12個微衛(wèi)星位點(diǎn)提供的信息，鑒定親緣關(guān)系。

表1 長牡蠣微衛(wèi)星多重PCR引物組合及特征Tab. 1 Multiplexes of microsatellite markers for C. gigas

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 18.0和Excel軟件對長牡蠣子代生長性狀和殼色性狀的表型參數(shù)進(jìn)行初步處理，檢測正態(tài)性和方差齊性。采用ASREML 3.0程序包中約束極大似然法(REML)進(jìn)行遺傳參數(shù)評估，建立個體動物模型：

式中，i、j、k依次為父本編號、母本編號、家系中第k個體的編號，Yijk為個體性狀觀測值，μ為總體平均值，αijk為加性遺傳效應(yīng)，Iij為家系遺傳效應(yīng)，eijk為隨機(jī)殘差。

殼色指標(biāo)和生長性狀的遺傳相關(guān)和表型相關(guān)的計算，使用ASREML 3.0軟件以及雙變量模型。

2 結(jié)果

2.1 系譜鑒定及描述性統(tǒng)計

12個微衛(wèi)星位點(diǎn)的平均等位基因數(shù)為10.6，平均觀測雜合度為0.62，平均期望雜合度為0.67，多態(tài)性信息含量(PIC)的平均值為0.62，表現(xiàn)出高多態(tài)性。進(jìn)行10 000次親本已知情況下的模擬測試，鑒定準(zhǔn)確率為99.98%。在95%的置信度標(biāo)準(zhǔn)下，863個個體中有851個個體鑒定到其父母本，實(shí)際親子鑒定成功率為98.61%。家系重建結(jié)果顯示，48個家系之間的子代個體數(shù)存在較大差異(表2)，介于6～48。親本貢獻(xiàn)率最高的是2號父本和4號母本，共繁育了48個子代。

表2 基于微衛(wèi)星分型的系譜鑒定結(jié)果Tab. 2 Number of progenies assigned to each of the 48 full-sib families based on microsatellite genotyping

家系重建后，統(tǒng)計了48個家系的殼色相關(guān)指標(biāo)L*、a*、b*和ΔE。由12號母本和4號父本繁育的全同胞家系b*值的平均數(shù)最大為?85.93，而由47號母本和16號父本產(chǎn)生的后代的ΔE值平均數(shù)最小，為4.21 (圖1)。描述性統(tǒng)計結(jié)果包括長牡蠣殼色參數(shù)和生長性狀的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)(表3)。在生長性狀參數(shù)中，總重量的變異系數(shù)最高，為39.62%，相比之下，殼高、殼長和殼寬的變異系數(shù)較低，為16.51%～21.10%，說明個體間總重量的差異更為明顯。在4個顏色參數(shù)中，L*和ΔE的變異系數(shù)較大，說明子代個體間顏色參數(shù)中L*和ΔE的差異更為明顯，L*的差異可能是個體間ΔE差異的來源；a*和b*的變異系數(shù)較小，為3.70%～5.70%。

圖1 長牡蠣殼色性狀表型值(a)～(d)依次為L*、ΔE、a*和b*的參數(shù)值；每個全同胞家系的表型值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并用其母本編號命名。Fig. 1 Shell color-related trait performance in terms of L＊, a＊, b＊, and ΔE of C. gigasParameter values of L*, ΔE, a* and b* are showed in figures (a)-(d), respectively; the shell color-related trait performances are represented by mean±SD.Each family is coded by its dam number.

表3 長牡蠣殼色性狀和生長性狀參數(shù)的描述性統(tǒng)計結(jié)果Tab. 3 Descriptive statistics of the orange shell color-related parameters (L＊, a＊, b＊ and ΔE) and the growth-related traits of C. gigas

2.2 長牡蠣殼橙性狀遺傳力和遺傳相關(guān)

基于家系重建后的系譜關(guān)系，利用動物模型和限制性最大似然法進(jìn)行遺傳力的估算。在4個顏色參數(shù)中，L*的遺傳力估計值最低，為0.17±0.07。a*、b*和ΔE的遺傳力估計值較高，依次為0.47±0.23、0.42±0.21和0.56±0.29 (表4)。殼色性狀顏色參數(shù)內(nèi)部之間相關(guān)性的差異既體現(xiàn)在相關(guān)性的正負(fù)上，也體現(xiàn)在相關(guān)性的大小上，L*和ΔE的遺傳相關(guān)和表型相關(guān)為正相關(guān)，遺傳相關(guān)和表型相關(guān)依次為0.51±0.30和0.08±0.04，表型相關(guān)值遠(yuǎn)小于遺傳相關(guān)值；b*與L*、a*、ΔE均具有較大的負(fù)遺傳相關(guān)，分別為?0.79±0.24、?0.64±0.31和?0.68±0.52。

表4 長牡蠣殼色參數(shù)L＊、a＊、b＊和ΔE的遺傳力(對角線)，遺傳相關(guān)(對角線上方)和表型相關(guān)(對角線下方)Tab. 4 Heritabilies (in the diagonal), genetic correlations(above the diagonal) and phenotypic correlation (below the diagonal) of shell color parameters of C. gigas

2.3 長牡蠣殼橙性狀與生長性狀的遺傳相關(guān)和表型相關(guān)

長牡蠣殼色性狀和生長性狀的表型和遺傳相關(guān)參數(shù)列于表5。ΔE和生長性狀的遺傳相關(guān)和表型相關(guān)均為負(fù)值。其中，與殼高、殼長的負(fù)遺傳相關(guān)程度高于其他顏色參數(shù)，為?0.29～?0.23。在L*和生長性狀、a*和生長性狀的遺傳相關(guān)中，除L*和總重量的相關(guān)性以外，其余均具較低的相關(guān)性。在遺傳相關(guān)方面，L*和總重量的負(fù)相關(guān)性最高為?0.33±0.25。在表型相關(guān)方面，a*與殼寬的相關(guān)估計值最高，為0.11±0.04；b*與總重量的相關(guān)估計值最低，為0.01±0.03。

表5 長牡蠣殼橙快速生長品系殼色與生長性狀的表型(rp)和遺傳相關(guān)(rg)Tab. 5 Phenotypic and genetic correlation between the shell color and growth traits of the improved orange shell line C. gigas

3 討論

3.1 長牡蠣系譜鑒定結(jié)果分析

遺傳力作為水產(chǎn)動物選擇育種中的重要遺傳參數(shù)，在育種值估計、選擇方法的比較、育種計劃的制定等方面具有重要作用，而使用正確的系譜信息是準(zhǔn)確評估遺傳參數(shù)的前提?；谖⑿l(wèi)星分型技術(shù)的家系重建方法，憑借其精確的鑒別力、檢測的高穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用到了尖吻鱸(Lates calcarifer)、鰱(Hypophthalmichthys molitrix)、鯉(Cyprinus carpio)等魚類[21-23]，以及長牡蠣[16]、耳鮑(Haliotis asinine)[24]等貝類混養(yǎng)家系的系譜關(guān)系鑒定中。這種將分屬于不同全同胞和半同胞家系的個體養(yǎng)殖在共同環(huán)境中的方式，不僅降低了育種和管理成本，還排除了傳統(tǒng)的家系分養(yǎng)過程引入的環(huán)境組分干擾，提升了遺傳參數(shù)估測的準(zhǔn)確性[25]。本研究運(yùn)用12對微衛(wèi)星位點(diǎn)鑒定了長牡蠣殼橙快速生長品系G1的子代，收獲的863個個體中有851個鑒定到其父母本，成功率達(dá)98.61%，高于時嘉賡等[26]在皺紋盤鮑(H. discus hannai)中使用8個微衛(wèi)星位點(diǎn)和邢德等[13]在長牡蠣中使用11個微衛(wèi)星位點(diǎn)所得的親子鑒定成功率，表明本研究選用的微衛(wèi)星位點(diǎn)，其數(shù)量和多態(tài)性信息含量可以實(shí)現(xiàn)對大樣本的家系重建。此外，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計上，巢式交配設(shè)計嚴(yán)格控制了每一個雄性個體只能與特定的3個雌性交配，這也是提高家系鑒定成功率的原因。值得注意的是，根據(jù)家系重建的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，混養(yǎng)群體中不同家系間的親本貢獻(xiàn)率差異較大，可能會導(dǎo)致選育群體有效種群大小的下降，進(jìn)而產(chǎn)生近交。因此，在選育過程中利用分子標(biāo)記監(jiān)測群體的系譜信息及遺傳變化，對于選育群體的種質(zhì)管理有重要意義。

3.2 長牡蠣殼橙性狀遺傳力分析

隨著長牡蠣活體、半殼等銷售狀態(tài)在消費(fèi)市場的興起，長牡蠣外殼的顏色、形狀等殼性狀開始影響消費(fèi)者的消費(fèi)偏好[27]。培育長牡蠣殼橙快速生長品系，不但可以滿足市場多樣化的需求，還可以為長牡蠣殼色性狀遺傳模式的研究提供材料。目前，關(guān)于長牡蠣橙殼色性狀的遺傳模式及相關(guān)QTL定位等研究已取得了一系列進(jìn)展[28-29]。本研究通過結(jié)合使用系譜鑒定技術(shù)和計算機(jī)視覺顏色量化系統(tǒng)估算了10月齡長牡蠣橙殼色性狀的遺傳力，顏色參數(shù)L*、a*、b*、ΔE的遺傳力分別為0.17、0.47、0.42和0.56。在以前的研究中，研究者將遺傳力(h2)＜0.15劃分為低遺傳力水平，0.15＜h2＜0.30劃分為中等遺傳力，h2＞0.30劃分為高遺傳力[30]。可見，與殼色明暗程度相關(guān)的L*為低遺傳力，該顏色參數(shù)可能受海區(qū)環(huán)境因素的影響較大。a*、b*、ΔE等顏色參數(shù)均為高遺傳力，這表明長牡蠣橙殼色性狀受遺傳因素控制程度較高，以橙殼色為目標(biāo)性狀的選育具有較大的潛力。此外，通過家系混養(yǎng)的方式排除了環(huán)境效應(yīng)，將非遺傳方差從表型總方差去除，也可能會導(dǎo)致加性遺傳方差增高。Xu等[14]和Evans等[4]對長牡蠣殼色遺傳參數(shù)的評估中也得到了較高的遺傳力。在其他貝類中，王照旗等[31]評估的三角帆蚌紫色選育系1齡階段內(nèi)殼色顏色參數(shù)L*、a*、b*、ΔE的遺傳力也是中高等水平，均證明了以殼色為選育目標(biāo)可以取得較好的選育效果。

3.3 長牡蠣殼橙性狀與生長性狀的關(guān)聯(lián)性分析

選擇育種是指通過挑選表型性狀優(yōu)良的個體繁育子代，并進(jìn)行多代反復(fù)地選擇與淘汰，從而選育出新品系或品種的方法。在水產(chǎn)動物選育過程中，需要量化表型性狀以篩選最佳親本，而有些性狀的量化過程會致使個體機(jī)械損傷，導(dǎo)致其喪失作為親本的有利條件，倘若容易測量的性狀與不易測量的性狀間具相關(guān)性，則可對后者進(jìn)行間接選育。因此，在連續(xù)多代選育的過程中，需要開展目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)分析以提高育種效率。表型相關(guān)主要分為遺傳相關(guān)和環(huán)境相關(guān)兩部分，其中，遺傳相關(guān)是由基因間連鎖不平衡性和基因多效性形成的[9]。通常，性狀間的正遺傳相關(guān)值與間接選育的效果成正比。

在海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類中，已有研究報道殼色性狀和生長性狀的相關(guān)程度因殼色而異。例如，邢德等[13]發(fā)現(xiàn)長牡蠣殼黑品系L*與生長參數(shù)遺傳相關(guān)值為0.49～0.91，兩性狀間可進(jìn)行互相選擇。而Wan等[16]估測殼金長牡蠣顏色參數(shù)與各生長性狀之間的遺傳相關(guān)范圍為?0.04～0.26，表型相關(guān)范圍為?0.10～0.13，無法利用生長性狀實(shí)現(xiàn)對殼金性狀的間接選育，在三角帆蚌內(nèi)殼色與生長性狀的關(guān)聯(lián)性分析中也得到了相同的結(jié)果[31]。本研究中，長牡蠣殼橙快速生長品系殼色性狀與生長性狀之間的遺傳相關(guān)和表型相關(guān)普遍較低，范圍介于?0.33～0.17，不同研究中長牡蠣殼色和生長性狀的遺傳相關(guān)存在較大的差異可能是生長環(huán)境和生長時期的不同所導(dǎo)致。不同養(yǎng)殖海區(qū)溫度、鹽度、海流和餌料組成不同，生物間資源分配存在差異。在不同的生長時期，母本效應(yīng)大小對遺傳參數(shù)的評估結(jié)果也有影響[32]。此外，不同殼色選育群體的殼色遺傳模式不同，這也可能是引起不同殼色品系顏色性狀的關(guān)聯(lián)分析出現(xiàn)差異的原因。橙殼色性狀與生長性狀間的關(guān)聯(lián)性結(jié)果說明，在長牡蠣殼橙快速生長品系的育種實(shí)踐中，可通過將殼色性狀和生長性狀作為目標(biāo)性狀協(xié)同選育的方法，取得遺傳進(jìn)展，提高育種效率。

4 結(jié)論

本研究分析了10月齡長牡蠣殼橙快速生長品系殼色性狀的表型變異、遺傳力及與生長性狀的關(guān)聯(lián)性，進(jìn)一步確定了在共同的養(yǎng)殖環(huán)境中以分子標(biāo)記系譜鑒定為基礎(chǔ)的家系重建方法的可行性。長牡蠣殼色性狀顏色參數(shù)多具中高遺傳力，以其作為選育的目標(biāo)性狀，有望達(dá)到良好的改良效果。長牡蠣殼色性狀與生長性狀沒有明顯的相關(guān)性，無法單一地通過殼色性狀的選育來實(shí)現(xiàn)對生長性狀的改良，將這兩種性狀視為目標(biāo)性狀協(xié)同選育是可行的措施。本研究結(jié)果為長牡蠣殼橙快速生長品系的選育提供了重要參考。

（作者聲明本文無實(shí)際或潛在的利益沖突）