盛小紅 王利明 趙鑫 辛向陽(yáng)

內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院眼科,包頭 014010

葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma,UM)是成人常見的原發(fā)性眼內(nèi)腫瘤,起源于脈絡(luò)膜、睫狀體或虹膜內(nèi)的黑色素細(xì)胞[1]。目前,針對(duì)該腫瘤的臨床一線治療方法包括手術(shù)切除、放射治療和眼球摘除;然而,高達(dá)50%的UM會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移,1年生存率僅為15%[2-3]。因此,積極探索UM潛在轉(zhuǎn)移機(jī)制并開發(fā)有效方法對(duì)于提高患者生存率至關(guān)重要。Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)通路是調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育和細(xì)胞干性的關(guān)鍵級(jí)聯(lián)反應(yīng)之一[4];其在腫瘤增生和發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用,在結(jié)腸癌、乳腺癌等多種癌癥中均已證實(shí)被激活[5-6]。對(duì)不同病理類型的UM進(jìn)行微小RNA差異表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn),差異微小RNA靶基因廣泛參與Wnt通路,且該通路參與了腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移[7]。阻斷Wnt/β-catenin通路可抑制UM細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲等惡性表型[8]。以上研究結(jié)果提示,Wnt/β-catenin通路可能是干預(yù)UM轉(zhuǎn)移及發(fā)展的有效分子機(jī)制靶點(diǎn)。姜黃素是一種從姜黃的根莖中提取的天然活性酚類化合物。研究發(fā)現(xiàn),其可抑制黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移[9],還可通過線粒體途徑誘導(dǎo)人UM細(xì)胞死亡[10],提示姜黃素對(duì)UM可能具有一定治療潛力。M23細(xì)胞是實(shí)驗(yàn)研究中常用的人UM細(xì)胞系、細(xì)胞株之一,本研究擬探討姜黃素對(duì)體外培養(yǎng)M23細(xì)胞增生、凋亡、遷移及侵襲等生物學(xué)行為的作用及Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,以期為UM的預(yù)防轉(zhuǎn)移、治療及預(yù)后提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞系及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 人UM細(xì)胞系M23購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)(美國(guó)菌種保藏中心)。6周齡SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠20只,體質(zhì)量(16±2)g,購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司[許可證號(hào):SCXK(魯)2019-0003]。所有小鼠于相同環(huán)境恒溫(22±2)℃、恒濕(55±5)%下普通飼養(yǎng),自由進(jìn)食飲水,12 h光-暗交替,適應(yīng)性培養(yǎng)1周。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程遵循動(dòng)物福利3R原則,經(jīng)內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批文號(hào):2021MER-023)。

1.1.2主要試劑及儀器 姜黃素(純度≥98%)(458-37-7,四川維克奇生物科技有限公司);Matrigel基質(zhì)膠(356234,美國(guó)BD公司);細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(cell counting kit-8,CCK8)(sck0105,上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司);AnnexinV-FITC/PI流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(KGA106,南京凱基生物科技公司);BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(PC0020,北京索萊寶科技有限公司);兔抗β-catenin(ab223075)、兔抗軸抑制蛋白2(axis inhibition protein 2,Axin2)(ab109307)、兔抗細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)(ab16663)、兔抗Survivin(ab76424)、兔抗c-Myc(ab32072)單克隆抗體,兔抗基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallo proteinase 9,MMP-9)(ab38898)多克隆抗體,辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(ab150077,美國(guó)Abcam公司);兔抗糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)單克隆抗體(YT782,北京百奧萊德科技有限公司);兔抗磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)多克隆抗體(PL0303230,加拿大PL Laboratories公司)。IX70型倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司);Allegra 64R低溫高速離心機(jī)(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司);ABI 7300型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(美國(guó)ABI公司);Gel Doc XR+凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)及培養(yǎng)液配制 用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液復(fù)蘇M23細(xì)胞,于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),傳代2～3次。采用848.32 ml含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液溶解20 mg姜黃素以制備原始濃度為80 μmol/L姜黃素的條件培養(yǎng)液,后取適量80 μmol/L姜黃素的條件培養(yǎng)液進(jìn)行倍比稀釋以制備含20、40 μmol/L姜黃素的條件培養(yǎng)液。

1.2.2CCK8法檢測(cè)細(xì)胞存活率 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期M23細(xì)胞,分別采用含0、20、40及80 μmol/L姜黃素培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為2×104個(gè)/ml。細(xì)胞以每孔2×103個(gè)密度接種于96孔板中,每個(gè)濃度各設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后,各孔加入10 μl CCK8溶液,37 ℃下孵育2 h,采用酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)定吸光度(absorbance,A)值,細(xì)胞存活率(%)=各濃度姜黃素組A值/0 μmol/L姜黃素組A值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞集落數(shù) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期M23細(xì)胞,采用含0、20、40和80 μmol/L姜黃素的DMEM完全培養(yǎng)液重懸,以每孔1×103個(gè)細(xì)胞密度接種至6孔板內(nèi),每3天更換1次培養(yǎng)液;培養(yǎng)2周后,PBS洗滌2次,4%多聚甲醛溶液室溫固定15 min,0.1%結(jié)晶紫溶液染色20 min,PBS洗滌2次,晾干,觀察集落形成情況并計(jì)數(shù)。光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)細(xì)胞克隆形成的集落數(shù)目,超過50個(gè)細(xì)胞的集落被認(rèn)為1個(gè)集落形成。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期M23細(xì)胞,采用含0、20、40和80 μmol/L姜黃素的DMEM完全培養(yǎng)液重懸,以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種至6孔板內(nèi)并連續(xù)培養(yǎng)48 h。胰蛋白酶消化,PBS洗滌2次,1 000 r/min(離心半徑10 cm)離心5 min,收集細(xì)胞,加入結(jié)合緩沖液重懸并調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml,連續(xù)加入5 μl Annexin V-FITC溶液、5 μl PI溶液,室溫避光染色15 min,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移率 收集對(duì)數(shù)期M23細(xì)胞,以每孔5×105個(gè)接種至24孔板內(nèi)培養(yǎng),直至細(xì)胞融合,利用無(wú)菌10 μl移液槍頭尖端劃線,PBS洗滌,更換不含胎牛血清的含0、20、40和80 μmol/L姜黃素的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h;在劃痕后0 h和48 h拍照,采用ImageJ軟件測(cè)量劃痕寬度。計(jì)算細(xì)胞遷移率,細(xì)胞遷移率(%)=(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲數(shù) 采用Matrigel基質(zhì)膠涂布Transwell上室,4 ℃下干燥,將不同濃度姜黃素處理48 h后的各組細(xì)胞用胰蛋白酶消化,采用不含胎牛血清的對(duì)應(yīng)培養(yǎng)液重懸;調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)/ml,以100 μl/孔接種至Transwell 24孔板上室,下室加入500 μl含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,48 h后用95%乙醇固定Transwell下側(cè)侵入的細(xì)胞30 min,0.1%結(jié)晶紫染色15 min,400倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行觀察并拍照,統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)目,重復(fù)計(jì)數(shù)3次,取平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)Wnt/β-catenin通路相關(guān)基因表達(dá) 采用含0、20、40、80 μmol/L姜黃素的DMEM完全培養(yǎng)液重懸對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期M23細(xì)胞,以1×105個(gè)/孔接種至6孔板內(nèi)并連續(xù)培養(yǎng)48 h。采用Trizol試劑提取各組細(xì)胞總RNA,紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度及濃度后,通過瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)RNA完整性,利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。c-Myc基因引物序列:正向?yàn)?'-GGCAAAAGG TCAGAGTCTGG-3',反向?yàn)?'-GTGCATTTTCGGTTGTT GC-3';CyclinD1基因引物序列:正向?yàn)?'-CCGCCTC ACACGCTFCCTCTC-3',反向?yàn)?'-TCCTCCTCGGCGG CCTTGGGG-3';Survivin基因引物序列:正向?yàn)?'-TGGACAAACAAAGAGCCAAGAA-3',反向?yàn)?'-TAGA GCAAAGCCACAAAACCAA-3';MMP-9基因引物序列:正向?yàn)?'-TTGACAGCGACAAGAAGTGG-3',反向?yàn)?'-GCCATTCACGTCGTCCTTAT-3';GAPDH基因引物序列:正向?yàn)?'-ATTTGGTCGTATTGGG CG-3',反向?yàn)?'-TGGAAGATGGGTGATGGGATT-3'。各基因引物由上海生工生物工程有限公司合成。以cDNA為模板,對(duì)各基因引物于ABI7300系統(tǒng)上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析,反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性5 s,58 ℃退火及延伸1 min,共39個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算各目的基因相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8Western blot法檢測(cè)Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平 采用含0、20、40、80 μmol/L姜黃素的DMEM完全培養(yǎng)液重懸對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期M23細(xì)胞,以1×105個(gè)孔密度接種至6孔板內(nèi)并連續(xù)培養(yǎng)48 h。1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞,PBS清洗3次,RIPA裂解緩沖液提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA法測(cè)定總蛋白濃度,上樣20 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離,濕法轉(zhuǎn)印至PVDF膜;取PVDF膜于含0.05 g/ml脫脂奶粉的三乙醇胺緩沖鹽水溶液(tris buffered saline,TBS)中室溫封閉1 h,置于相應(yīng)一抗(均1∶1 000稀釋)中4 ℃孵育過夜,TBS洗膜3次;辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(1∶10 000稀釋)室溫孵育1 h,TBS洗膜3次;ECL發(fā)光液顯色,全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)拍照。采用ImageJ軟件分析條帶灰度值,以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.9UM荷瘤小鼠模型的建立及分組處理 于20只小鼠左后腹皮下脂肪墊注射M23細(xì)胞懸浮液100 μl(1×107個(gè)細(xì)胞),接種5 d后接種部位可觸摸到結(jié)節(jié)為造模成功。將造模成功小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組、姜黃素低、中和高劑量組,每組各5只,分別于腹腔內(nèi)注射含0、10、20和40 mg/kg姜黃素的生理鹽水溶液,每日注射1次,連續(xù)注射30 d。

1.2.10腫瘤質(zhì)量檢測(cè) 各組小鼠末次給藥后禁食24 h,頸椎脫臼法處死后,剝離小鼠左后腹皮下瘤體并稱取腫瘤質(zhì)量,比較各組小鼠腫瘤質(zhì)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞形態(tài)及存活率比較

倒置顯微鏡下觀察可見,M23細(xì)胞相互連接緊密,呈融合狀紡錘形;經(jīng)不同濃度姜黃素作用后細(xì)胞逐漸變得扁平、狹長(zhǎng),假足狀突起逐漸增多,細(xì)胞密度逐漸減小(圖1)。不同濃度姜黃素組間M23細(xì)胞存活率總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=125.321,P<0.001);M23細(xì)胞存活率隨姜黃素濃度升高而降低,組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表1)。

圖1 光學(xué)顯微鏡下不同濃度姜黃素組M23細(xì)胞形態(tài)圖(×100,標(biāo)尺=200 μm) 隨著姜黃素濃度的增加,細(xì)胞密度逐漸降低,其中0 μmol/L姜黃素組細(xì)胞呈融合狀紡錘形,不同濃度姜黃素組處理后細(xì)胞逐漸變得扁平、狹長(zhǎng)

2.2 不同濃度姜黃素組細(xì)胞集落形成數(shù)比較

隨著姜黃素作用濃度增大,細(xì)胞集落數(shù)逐漸減少(圖2)。不同濃度姜黃素組M23細(xì)胞集落形成數(shù)總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=97.941,P<0.001);M23細(xì)胞集落形成數(shù)隨姜黃素濃度增大而減少,組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表2)。

表1 不同濃度姜黃素組M23細(xì)胞存活率比較(x±s,%)Table 1 Comparison of survival rate of M23 cells among different concentrations of curcumin groups (x±s,%)組別樣本量細(xì)胞存活率0 μmol/L姜黃素組3100.00±0.0020 μmol/L姜黃素組383.78±4.59a40 μmol/L姜黃素組366.09±3.92ab80 μmol/L姜黃素組347.16±3.63abcF值125.321P值<0.001 注:與0 μmol/L姜黃素組比較,aP<0.05;與20 μmol/L姜黃素組比較,bP<0.05;與40 μmol/L姜黃素組比較,cP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) Note:Compared with 0 μmol/L curcumin group,aP<0.05;compared with 20 μmol/L curcumin group,bP<0.05;compared with 40 μmol/L curcumin group,cP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test)

圖2 各濃度姜黃素組M23細(xì)胞集落形成情況 細(xì)胞集落數(shù)隨著姜黃素濃度的增加而逐漸減少

2.3 不同濃度姜黃素組細(xì)胞凋亡率比較

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,隨姜黃素濃度增大,早期凋亡及晚期凋亡細(xì)胞逐漸增多(圖3)。不同濃度姜黃素組細(xì)胞凋亡率總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=72.516,P<0.001);M23細(xì)胞凋亡率隨姜黃素作用濃度增加而逐漸升高,組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表3)。

表2 不同濃度姜黃素組細(xì)胞集落形成數(shù)量比較(x±s,個(gè))Table 2 Comparison of colony formation number of M23 cells among different concentrations of curcumin groups (x±s,pcs)組別樣本量集落形成數(shù)0 μmol/L姜黃素組3128.7±9.220 μmol/L姜黃素組3100.3±8.7a40 μmol/L姜黃素組358.7±6.6ab80 μmol/L姜黃素組331.7±4.9abcF值97.941P值<0.001 注:與0 μmol/L姜黃素組比較,aP<0.05;與20 μmol/L姜黃素組比較,bP<0.05;與40 μmol/L姜黃素組比較,cP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) Note:Compared with 0 μmol/L curcumin group,aP<0.05;compared with 20 μmol/L curcumin group,bP<0.05;compared with 40 μmol/L curcumin group,cP<0.05(One-way ANOVA,LSD-t test)

圖3 不同濃度姜黃素組細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞圖 細(xì)胞早期及晚期凋亡率隨著姜黃素濃度的增加而逐漸升高

2.4 不同濃度姜黃素組細(xì)胞遷移率比較

隨著姜黃素作用濃度增加,細(xì)胞生長(zhǎng)遷移速度減慢(圖4)。不同濃度姜黃素組M23細(xì)胞遷移率總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=277.097,P<0.001);其中M23細(xì)胞遷移率隨姜黃素作用濃度增加而降低,組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表4)。

圖4 不同濃度姜黃素組細(xì)胞遷移情況 細(xì)胞遷移速度隨著姜黃素濃度的增加逐漸減慢

2.5 不同濃度姜黃素組細(xì)胞侵襲數(shù)目比較

隨著姜黃素濃度增加,侵襲細(xì)胞密度逐漸減小(圖5)。不同濃度姜黃素組M23侵襲細(xì)胞數(shù)總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=139.006,P<0.001);M23侵襲細(xì)胞數(shù)隨姜黃素作用濃度增加而減少,各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表5)。

表3 不同濃度姜黃素組細(xì)胞凋亡率比較(x±s,%)Table 3 Comparison of apoptosis rates of M23 cells among different concentrations of curcumin groups (x±s,%)組別樣本量細(xì)胞凋亡率0 μmol/L姜黃素組31.33±0.2920 μmol/L姜黃素組314.53±2.04a40 μmol/L姜黃素組327.23±3.56ab80 μmol/L姜黃素組344.73±4.36abcF值72.516P值<0.001 注:與0 μmol/L姜黃素組比較,aP<0.05;與20 μmol/L姜黃素組比較,bP<0.05;與40 μmol/L姜黃素組比較,cP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) Note:Compared with 0 μmol/L curcumin group,aP<0.05;compared with 20 μmol/L curcumin group,bP<0.05;compared with 40 μmol/L curcumin group,cP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test)

圖5 各濃度姜黃素組細(xì)胞侵襲情況(結(jié)晶紫 ×400,標(biāo)尺=50 μm) 侵襲細(xì)胞密度隨著姜黃素濃度的增加逐漸降低

2.6 不同濃度姜黃素組Wnt/β-catenin通路相關(guān)基因表達(dá)水平比較

不同濃度姜黃素組M23細(xì)胞c-Myc、CyclinD1、Survivin及MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)水平總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=241.558、269.804、179.680、284.000,均P<0.001);其中M23細(xì)胞c-Myc、Cyclin D1、Survivin及MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)水平均隨姜黃素作用濃度增加而降低,組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表6)。

表4 不同濃度姜黃素組細(xì)胞遷移率比較(x±s,%)Table 4 Comparison of M23 cell migration rate among different concentrations of curcumin groups (x±s,%)組別樣本量細(xì)胞遷移率0 μmol/L姜黃素組389.76±4.5720 μmol/L姜黃素組365.43±3.70a40 μmol/L姜黃素組334.83±2.19ab80 μmol/L姜黃素組318.82±1.99abcF值277.097P值<0.001 注:與0 μmol/L姜黃素組比較,aP<0.05;與20 μmol/L姜黃素組比較,bP<0.05;與40 μmol/L姜黃素組比較,cP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) Note:Compared with 0 μmol/L curcumin group,aP<0.05;compared with 20 μmol/L curcumin group,bP<0.05;compared with 40 μmol/L curcumin group,cP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test)

2.7 不同濃度姜黃素組Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

與0 μmol/L姜黃素組比較,20 μmol/L、40 μmol/L及80 μmol/L姜黃素組細(xì)胞β-catenin、p-GSK-3β、c-Myc、Cyclin D1、Survivin及MMP-9蛋白電泳條帶灰度值逐漸減弱,Axin2蛋白表達(dá)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)(圖6)。不同濃度姜黃素組GSK-3β蛋白相對(duì)表達(dá)水平總體比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.494,P>0.05),β-catenin、p-GSK-3β、c-Myc、Cyclin D1、Survivin、MMP-9和Axin2蛋白相對(duì)表達(dá)水平總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=182.877、183.026、55.200、150.128、136.000、139.611、92.211,均P<0.001);隨姜黃素濃度增大,β-catenin、p-GSK-3β、c-Myc、Cyclin D1、Survivin及MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯降低,Axin2蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯升高,組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表7)。

表6 不同濃度姜黃素組Wnt/β-catenin通路相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較(x±s)Table 6 Comparison of mRNA expression levels of genes related to Wnt/β-catenin pathway among different concentrations of curcumin groups (x±s)組別樣本量c-MycCyclin D1SurvivinMMP-90 μmol/L姜黃素組51.01±0.011.00±0.011.01±0.011.00±0.0120 μmol/L姜黃素組50.86±0.05a0.91±0.05a0.92±0.06a0.83±0.05a40 μmol/L姜黃素組50.58±0.04ab0.52±0.04ab0.61±0.03ab0.51±0.04ab80 μmol/L姜黃素組50.27±0.03abc0.32±0.02abc0.42±0.02abc0.26±0.02abcF值241.558269.804179.680284.000P值<0.001<0.001<0.001<0.001 注:與0 μmol/L姜黃素組比較,aP<0.05;與20 μmol/L姜黃素組比較,bP<0.05;與40 μmol/L姜黃素組比較,cP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) Cyclin D1:細(xì)胞周期蛋白D1;MMP-9:基質(zhì)金屬蛋白酶9 Note:Compared with 0 μmol/L curcumin group,aP<0.05;compared with 20 μmol/L curcumin group,bP<0.05;com-pared with 40 μmol/L curcumin group,cP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) Cyclin D1:cyclic protein D1;MMP-9:matrix metalloproteinase 9

表7 不同濃度姜黃素組Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較(x±s)Table 7 Comparison of relative expression levels of proteins related to Wnt/β-catenin pathway among different concentrations of curcumin groups (x±s)組別樣本量β-cateninGSK-3βp-GSK-3βAxin2c-MycCyclin D1SurvivinMMP-90 μmol/L姜黃素組30.82±0.060.79±0.030.75±0.020.22±0.020.41±0.040.76±0.050.84±0.060.73±0.0520 μmol/L姜黃素組30.57±0.04a0.80±0.030.42±0.03a0.34±0.03a0.32±0.03a0.68±0.03a0.61±0.04a0.42±0.04a40 μmol/L姜黃素組30.29±0.02ab0.82±0.040.31±0.02ab0.46±0.04ab0.26±0.02ab0.46±0.03ab0.43±0.03ab0.27±0.03ab80 μmol/L姜黃素組30.16±0.01abc0.83±0.050.19±0.02abc0.62±0.03abc0.13±0.01abc0.22±0.02abc0.20±0.02abc0.15±0.02abcF值182.8770.494183.02692.21155.200150.128136.000139.611P值<0.0010.696<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001 注:與0 μmol/L姜黃素組比較,aP<0.05;與20 μmol/L姜黃素組比較,bP<0.05;與40 μmol/L姜黃素組比較,cP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) GSK-3β:糖原合成酶激酶3β;Axin2:軸抑制蛋白2;Cyclin D1:細(xì)胞周期蛋白D1;MMP-9:基質(zhì)金屬蛋白酶9 Note:Compared with 0 μmol/L curcumin group,aP<0.05;compared with 20 μmol/L curcumin group,bP<0.05;compared with 40 μmol/L curcumin group,cP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) GSK-3β:glycogen synthase kinase 3β;Axin2:axis inhibition protein 2;Cyclin D1:cyclic protein D1;MMP-9:matrix metalloproteinase 9

表5 不同濃度姜黃素組侵襲細(xì)胞數(shù)比較(x±s,個(gè))Table 5 Comparison of the number of M23 invaded cells among different concentrations of curcumin groups (x±s,pcs)組別樣本量侵襲細(xì)胞數(shù)0 μmol/L姜黃素組3148.33±8.1820 μmol/L姜黃素組3125.33±7.41a40 μmol/L姜黃素組373.67±6.34ab80 μmol/L姜黃素組345.67±5.31abcF值139.006P值<0.001 注:與0 μmol/L姜黃素組比較,aP<0.05;與20 μmol/L姜黃素組比較,bP<0.05;與40 μmol/L姜黃素組比較,cP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) Note:Compared with 0 μmol/L curcumin group,aP<0.05;compared with 20 μmol/L curcumin group,bP<0.05;compared with 40 μmol/L curcumin group,cP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test)

圖6 各濃度姜黃素組Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白Western blot電泳圖 1:0 μmol/L姜黃素組;2:20 μmol/L姜黃素組;3:40 μmol/L姜黃素組;4:80 μmol/L姜黃素組 Axin2:軸抑制蛋白2;GSK-3β:糖原合成酶激酶3β;GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶;MMP-9:基質(zhì)金屬蛋白酶9;Cyclin D1:細(xì)胞周期蛋白D1

2.8 各組小鼠腫瘤質(zhì)量比較

隨著姜黃素作用濃度增加,小鼠荷瘤組織整體變小(圖7)。各組小鼠荷瘤組織質(zhì)量總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=58.026,P<0.001);其中小鼠荷瘤組織質(zhì)量隨姜黃素作用劑量增加而降低,組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表8)。

表8 各組小鼠荷瘤組織質(zhì)量比較(x±s,g)Table 8 Comparison of tumor tissue weight among different groups (x±s,g)組別樣本量荷瘤質(zhì)量模型組50.43±0.04姜黃素低劑量組50.37±0.03a姜黃素中劑量組50.28±0.03ab姜黃素高劑量組50.19±0.02abcF值58.026P值<0.001 注:與模型組比較,aP<0.05;與姜黃素低劑量組比較,bP<0.05;與姜黃素中劑量組比較,cP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) Note:Compared with model group,aP<0.05;compared with low-dose cur-cumin group,bP<0.05;compared with medium-dose curcumin group,cP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test)

圖7 各組小鼠荷瘤組織觀察 隨姜黃素作用濃度增大,荷瘤組織整體變小

3 討論

UM轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的重要原因,積極尋找能夠減少UM細(xì)胞增生、遷移及侵襲的潛在化合物是建立新的有效治療UM策略的重要一步。據(jù)報(bào)道,姜黃素作為一種有效的抗癌候選藥物,可參與多種癌癥的發(fā)展,并影響腫瘤相關(guān)信號(hào)通路和分子靶點(diǎn),抑制癌細(xì)胞存活、遷移和侵襲[11]。Xie等[12]研究發(fā)現(xiàn),含姜黃素納米顆粒/原位水凝膠復(fù)合物可實(shí)現(xiàn)對(duì)人UM細(xì)胞增生的長(zhǎng)效抑制作用,對(duì)改善預(yù)后、抑制UM進(jìn)展和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要,但體內(nèi)外條件下姜黃素對(duì)UM是否具有積極干預(yù)作用仍待探究。本研究中,M23細(xì)胞于體外條件下經(jīng)不同濃度姜黃素作用后,細(xì)胞增生、集落形成、遷移及侵襲能力減弱,細(xì)胞凋亡率升高;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,姜黃素作用可顯著抑制異種移植腫瘤生長(zhǎng),且作用效果呈劑量依賴性,說(shuō)明姜黃素對(duì)UM細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為具有抑制作用,在機(jī)體內(nèi)可發(fā)揮抗UM效果,對(duì)于UM后期轉(zhuǎn)移性進(jìn)展可能具有一定的干預(yù)作用。

c-Myc是一種促存活蛋白,通常在腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá),參與調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、化學(xué)抗性和腫瘤發(fā)生等多種生理過程,已被證明與腫瘤轉(zhuǎn)移和不良臨床結(jié)果有關(guān)[13-14];其表達(dá)上調(diào)可導(dǎo)致癌細(xì)胞的干細(xì)胞特征和侵襲性[15]。Cyclin D1是細(xì)胞周期G1～S期過渡進(jìn)程的重要調(diào)節(jié)劑,在包括細(xì)胞增生、線粒體活性調(diào)節(jié)、DNA修復(fù)和細(xì)胞遷移控制等細(xì)胞生物學(xué)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16]。Survivin與細(xì)胞凋亡抑制相關(guān),其在多種惡性腫瘤,如結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌和黑色素瘤中的表達(dá)水平顯著升高,可促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)和干性過程[17]。EMT是癌癥發(fā)展和轉(zhuǎn)移第一階段的關(guān)鍵機(jī)制,通過改變細(xì)胞間黏附和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)重塑,有利于惡性腫瘤ECM內(nèi)的侵入性遷移[18]。MMP-9為旁分泌癌細(xì)胞分泌的明膠酶,可參與ECM組織重塑和降解過程,其表達(dá)被視為腫瘤侵襲的主要先決條件[19]。c-Myc、Cyclin D1、Survivin和MMP-9均為Wnt/β-catenin通路的關(guān)鍵下游因子[20]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)姜黃素作用后,M23細(xì)胞中的c-Myc、Cyclin D1、Survivin及MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)水平均降低,提示姜黃素對(duì)UM細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的抗性效果可能是通過干擾其存活蛋白表達(dá),介導(dǎo)增生周期紊亂,促進(jìn)其凋亡并降低其對(duì)基底膜屏障的降解作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

Wnt/β-catenin通路與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和耐藥性密切相關(guān),已成為抗腫瘤治療的有效靶標(biāo)[21]。當(dāng)Wnt通路未被激活時(shí),β-catenin被包含結(jié)腸腺瘤息肉蛋白、酪蛋白激酶1、GSK-3β和Axin1或Axin2的多蛋白復(fù)合物磷酸化,隨后經(jīng)歷泛素依賴性蛋白水解;但當(dāng)該通路被激活時(shí),復(fù)合物被滅活,導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核,與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合并激活下游調(diào)節(jié)細(xì)胞增生、細(xì)胞周期及細(xì)胞間黏附靶基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá),Axin2負(fù)反饋調(diào)控Wnt/β-catenin通路活性[22-23]。研究發(fā)現(xiàn),抑制Wnt/β-catenin通路可下調(diào)p-GSK-3β和β-catenin表達(dá),且能減弱癌細(xì)胞增生、遷移及侵襲能力[24]。姜黃素已被證實(shí)參與多種癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin通路的下調(diào)[25-27]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)姜黃素作用后,M23細(xì)胞中β-catenin及p-GSK-3β蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著下調(diào),Axin2蛋白相對(duì)表達(dá)水平有所提高,提示姜黃素可能通過抑制Wnt/β-catenin通路激活,進(jìn)而減少下游靶基因c-Myc、CyclinD1、Survivin和MMP-9等的轉(zhuǎn)錄。

綜上所述,姜黃素可抑制UM細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為,其作用機(jī)制可能與阻斷Wnt/β-catenin通路激活有關(guān)。該研究結(jié)果對(duì)UM臨床藥物治療靶點(diǎn)及用藥選擇提供了一定參考,對(duì)干預(yù)UM惡性進(jìn)展及改善預(yù)后具有一定的積極意義。但本研究?jī)H選擇了UM單一細(xì)胞株進(jìn)行探究,未來(lái)尚需擴(kuò)大細(xì)胞類型進(jìn)一步驗(yàn)證。

利益沖突所有作者均聲明不存在任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明盛小紅:研究實(shí)施、數(shù)據(jù)分析及文章撰寫;王利明、趙鑫:研究實(shí)施、數(shù)據(jù)采集及分析;辛向陽(yáng):醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、文章審閱及定稿