在體全眼微血流超聲超分辨成像

張昌露 雷 爽 劉佳妹 商東慶 馬 騰*

1（中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院 深圳 518055）2（中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049）

1 引 言

研究發(fā)現(xiàn)，多類眼科疾病都伴隨有血管形態(tài)學(xué)改變[1]，如視網(wǎng)膜脫落、眼睛腫瘤[2]、青光眼[3]、糖尿病視網(wǎng)膜病變[4]和新生兒視網(wǎng)膜疾病[5]等。此外，眼底血管系統(tǒng)的相互作用在維持視神經(jīng)的健康方面起著重要作用。目前，眼科疾病診斷常用的臨床技術(shù)主要有光學(xué)相干斷層掃描成像[6]、光學(xué)相干斷層血管造影[7]、光聲成像[8-9]、眼底鏡、超聲 B 模式成像、超聲多普勒成像等。光學(xué)相干斷層掃描成像、光學(xué)相干斷層血管造影雖然是眼科常用的診斷技術(shù)，但是其成像深度較淺，若出現(xiàn)玻璃體混濁等其他影響屈光的情形，則光學(xué)成像可能無法準確探查眼底血管。除了眼睛微血流形態(tài)對維持眼睛功能至關(guān)重要外，眼睛血流動力學(xué)參數(shù)對眼部疾病的診斷也具有重要臨床意義。例如：急性閉角型青光眼患者在不同眼壓狀態(tài)下，眼動脈、視網(wǎng)膜中央動脈和睫狀后動脈的血流速度不同，可以根據(jù)血流速度對疾病進行分期分型。血流方向有助于了解血管網(wǎng)動靜脈分布，可以指導(dǎo)眼科外科手術(shù)方案，以有效防止術(shù)中血管破裂，如眼部腫瘤及視網(wǎng)膜脫落手術(shù)評估等，因此，血流動力學(xué)檢測對眼科疾病的診治十分重要。受超聲波衍射極限的制約，傳統(tǒng)超聲成像的成像分辨率較低，無法直接對眼底血管變化進行成像。超聲多普勒成像雖然是目前常用的血管成像技術(shù)，但是其只能粗略顯示血管系統(tǒng)，無法準確可視化微血管系統(tǒng)。因此，一種無創(chuàng)精確的眼睛微血管成像技術(shù)對眼科疾病的早期診斷和治療評估具有重要意義。

超聲成像雖然具有無輻射和性價比高等優(yōu)勢，但是傳統(tǒng)超聲聚集成像受成像分辨率和成像幀率的制約。超聲平面波復(fù)合成像的提出打破了這一限制，將成像幀率提高至數(shù)千赫茲[10]。平面波復(fù)合成像方法的提出使得依賴于快速采集的超聲功能成像成為可能。超分辨微血流成像是一種新的超聲成像技術(shù)，它打破了超聲波的衍射極限，在保證成像深度的同時可以可視化微米級血管[11]。與隨機光學(xué)重建顯微鏡[12]和熒光激活定位顯微鏡[13]類似，超聲超分辨成像主要對血管內(nèi)孤立微泡進行識別、定位和追蹤，形成微血管軌跡圖，并估計血流速度和方向。在過去幾年，國內(nèi)外眾多學(xué)者對超聲超分辨成像算法和相關(guān)應(yīng)用進行了研究，進一步推動了其臨床應(yīng)用進展。總的來說，主要通過改進微泡信號提取算法[14]、圖像濾波算法[15-17]、微泡中心定位算法[18-20]和基于深度學(xué)習(xí)加速重建過程[21-22]。目前，超分辨微血流成像已經(jīng)實現(xiàn)了多種器官組織的微血流標定，包括腫瘤[23]、淋巴[24]、腦[25-26]和眼底等重要組織，對于進一步研究組織器官的生理和病理血流變化具有重要意義。

臨床眼科學(xué)一般采用頻率為 10～20 MHz 的超聲換能器，在這個頻率范圍內(nèi)，穿透深度和成像分辨率均可達到眼底成像的要求，但傳統(tǒng)的超聲多普勒成像則無法觀察到毛細血管[27]。以往研究表明，超聲超分辨成像可在保持原有穿透深度的情況下，將空間分辨率提高約 10 倍[28]。因此，超聲超分辨成像技術(shù)將為全眼微血管系統(tǒng)的可視化提供一個有力的工具[29-30]。一方面，利用二維超聲超分辨成像對眼底微血流進行成像，雖然在不同的生物體組織中取得了較好的成像結(jié)果，但是二維超聲超分辨成像具有高度的成像平面依賴性，若不能選取合適剖面，則可能會在臨床應(yīng)用中出現(xiàn)漏診事故。另一方面，二維超聲超分辨成像不能實現(xiàn)換能器陣元仰角方向的微泡追蹤，會丟失仰角方向的血流信息。因此，若能進行三維空間內(nèi)的微血管可視化，則對疾病的診斷和治療評估具有重要意義。

目前，三維超聲成像主要有以下方法：一是利用二維超聲陣列實現(xiàn)三維超聲成像[31-33]，這種成像方式的缺點是采集時間和幀率不足，且時間成本非常大；二是利用行列尋址進行超分辨成像[34]的信噪比較低；三是利用一維陣列通過機械掃描進行三維組織成像，通過調(diào)整合適的電機步長，實現(xiàn)對整個組織的三維成像[35]。

基于以上討論，本文利用中心頻率為 10 MHz的線陣超聲換能器，基于機械掃描實現(xiàn)三維空間內(nèi)全眼微血流成像，以可視化整個眼睛的微血管系統(tǒng)。與傳統(tǒng)的超聲圖像相比，超聲超分辨成像微血管圖像的分辨率有了極大的提高，且可以實現(xiàn)全眼三維微血流成像。最終的三維超聲超分辨成像結(jié)果證明本文所述方法能夠可視化整個眼睛的微血管網(wǎng)絡(luò)。

2 方法與材料

2.1 成像系統(tǒng)參數(shù)

在數(shù)據(jù)采集之前，需要對超聲成像系統(tǒng)的點擴散函數(shù)（point spread function，PSF）進行標定，將直徑 20 μm 的鎢絲水平固定在水箱中，模擬點散射體，調(diào)整線陣換能器位置，確保成像平面垂直于導(dǎo)線。分別在 5 mm、10 mm 和 15 mm 深度下測試 PSF 隨成像深度的變化。計算 150 幀圖像的橫向和軸向的平均半高寬，并將其用于微泡中心點定位。

2.2 實驗裝置

本研究的動物實驗方案經(jīng)中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院機構(gòu)動物護理與使用發(fā)員會（IACUC）批準（SIAT-IRB-180213-YYS-MT-A0458）。所用的動物為健康新西蘭白兔（約 2.5 kg），實驗開始前用體積分數(shù)為 3% 異氟醚吸氧麻醉新西蘭白兔，深度麻醉后將其置于暖墊上，維持體溫37 ℃，然后將超聲耦合劑凝膠均勻涂于換能器表面，使換能器與右眼表面充分耦合。在數(shù)據(jù)采集之前，每 1.5 min 耳靜脈注射 0.3 mL SonoVue（Bracco Imaging SpA，意大利）微泡懸浮液，然后注射 1 mL 生理鹽水沖洗?？删幊坛暢上衿脚_ Verasonics Vantage 256（Kirkland，美國）和線性陣列換能器 L14-6（上海愛聲生物醫(yī)療科技有限公司，中國）用于超聲數(shù)據(jù)采集。超聲換能器的中心頻率為 10 MHz，帶寬為 80%，每次傳輸一個信號周期，機械指數(shù)設(shè)置為 0.1。采用超快復(fù)合平面波成像，平面波偏轉(zhuǎn)角度為－6°～6°等分的 5 個角度，有效脈沖重復(fù)頻率（PRF）為 800 Hz。將線陣換能器沿著掃描方向安裝在三軸位移平臺 M8-400R（北京卓立漢光儀器有限公司，中國）上，步長為 150 μm，生成三維體圖像。每個剖面共采集了 2 400 幀超聲圖像序列，共采集 50 個剖面，以重建三維體圖像。在數(shù)據(jù)采集后，采用 delay and sum （DAS）波束合成方法將原始射頻數(shù)據(jù)波束合成 IQ 數(shù)據(jù)，波束合成數(shù)據(jù)網(wǎng)格的大小設(shè)置為半波長。最后利用MATLAB 2019a（MathWorks，美國）保存 IQ 數(shù)據(jù)，進行后處理。

2.3 微泡信號提取

對于每個剖面的射頻數(shù)據(jù)序列來說，首先應(yīng)用波束合成后的 IQ 數(shù)據(jù)生成原始 B 模式超聲圖像，然后利用二維運動矯正算法去除因呼吸運動或者其他生理運動引起的偽影[36]。本研究采用分塊時空奇異值分解（singular value decomposition，SVD）濾波器，從組織信號中提取微泡信號[16]，如圖1 所示。連續(xù)采集的 IQ 序列是三維時空矩陣，空間維度（圖像像素大?。镹x和Nz，時間維度為Nt。在本研究中，每個剖面采集了2 400 幀 B 模式圖像，以用于重建超分辨血流圖像，每張圖的大小為Nx＝316，Nz＝250。將整個數(shù)據(jù)集分割為若干個維度為Nx，Nz，Nt的子塊，其中，nx≤Nx，nz≤Nz，nt≤Nt，且子塊在橫向和軸向方向重疊。對每個子塊的 IQ 數(shù)據(jù)進行二維Casorati 矩陣重構(gòu)，第一個維度表示空間，另一個維度表示時間。采用以下公式對該矩陣進行SVD：

圖1 分塊 SVD 濾波示意圖Fig.1 Diagram of the block-wise SVD filter

其中，Sn為第n個子塊的二維 Casorati 矩陣；U為Sn的空間的奇異值向量所張成的矩陣；V為Sn的時間的奇異值向量所張成的矩陣； 是奇異值矩陣，*代表矩陣的共軛轉(zhuǎn)置。為了去除背景組織信號和抑制噪聲，選擇了兩個閾值，其中，奇異值能量曲線二階導(dǎo)數(shù)最大的點為低階閾值，高階閾值則由曲線斜率的平坦度決定。每個像素微泡信號 為：

其中，N為包含目標像素 的重疊子塊的總數(shù)；Snb為第n個子塊的流動微泡信號； 為剩余奇異值對應(yīng)的微泡信號；Low-order 代表最小的奇異值截斷閾值；High-order 代表最大的奇異值截斷閾值。為了在深度上提高信噪比，減少計算時間，設(shè)定三維子塊大小為 316×100×2 400，即nx＝316，nz＝100，nt＝2 400，此處，nt的選擇是根據(jù)經(jīng)驗設(shè)定的，以分別提取眼前節(jié)和眼底微血管。其中，沿Z方向的相鄰子塊之間的距離（步長）為定值，如果像素網(wǎng)格尺寸為波長，則步長設(shè)定為 3；如果像素網(wǎng)格尺寸為半波長，則步長設(shè)定為 5。

2.4 微泡中心定位

在進行時空濾波后得到了微泡信號，采用三維時空塊匹配去噪濾波器[15]，這樣可以在保持微泡圖像特征的同時抑制噪聲，然后對每個像素的歸一化強度應(yīng)用硬閾值，去除信噪比低的微泡信號。采用二維樣條插值方法對每幀流動微氣泡進行上采樣，像素尺寸為 8 μm×8 μm，而單個微泡的半徑范圍為 1～3 μm，遠小于超聲波半波長，因此可以認為是一個散射點。對于微泡定位，首先將校準后的平均 PSF 擬合為二維高斯核模型，然后與插值后的微泡信號進行二維歸一化互相關(guān)，具體數(shù)學(xué)表達如式（3）所示，然后將相關(guān)系數(shù)低于 0.6 的像素點置為零，以識別潛在的微氣泡區(qū)域，最后計算互相關(guān)稀疏的局部極大值，即可看作為微氣泡中心點。

2.5 微泡追蹤

在 2.4 小節(jié)中，完成了對微泡信號的定位。為了生成血流的速度和方向圖，需要對每一幀的微泡進行追蹤，本文利用庫恩-曼克爾斯分配算法實現(xiàn)微泡的多幀追蹤[37]。首先，計算所有微泡在連續(xù)兩幀之間的距離，然后，根據(jù)總距離最小化的原則對連續(xù)兩幀的微氣泡進行配對，并剔除總長度小于 5 幀的軌跡，進一步抑制噪聲的影響。血流速度計算是將平均距離除以配對微泡之間的時間間隔，然后將各幀中成對微泡的位置連接起來，生成血流速度幅值和方向圖。

3 實驗結(jié)果

3.1 成像系統(tǒng)參數(shù)測量

按照 2.1 小節(jié)中的方法對成像系統(tǒng)的點擴散函數(shù)進行測量，測量結(jié)果如圖2 所示。圖2（a）舉例說明了深度為 5 mm、10 mm、15 mm 處的鎢絲導(dǎo)線橫截面的 B 模式超聲圖像，各個散射點的PSF 的橫向和軸向強度分布如圖2（b）～（c）所示。平均橫向分辨率和軸向分辨率分別為 251 μm 和155 μm，理論計算的超分辨成像的定位精度約為8 μm[11]，可用于后續(xù)微泡中心點定位處理。

圖2 超聲成像系統(tǒng)的校準——配備 L14-6 探頭的 Verasonics 256 研究平臺Fig.2 Calibration of ultrasound imaging system—Verasonics 256 research platform equipped with an L14-6 probe

3.2 二維超聲超分辨微血流成像結(jié)果

按照 2.2 小節(jié)所述的數(shù)據(jù)采集方式，圖3 展示了在瞳孔正中間位置采集的超聲成像平面超分辨血流圖像。圖3（a）是超聲成像平面的示意圖，成像深度約為 22 mm。在圖3（b）的 B 型圖像中，可以清楚地看到眼前段的角膜、晶狀體和虹膜。如圖3（c）所示，應(yīng)用 SVD 濾波將靜止組織和背景噪聲信號進行濾除，經(jīng)過多幀疊加后得到超聲多普勒血管圖像。圖3（d）為重建后的超分辨微血管圖像，成像剖面中眼眶和虹膜的微血管清晰可見。圖3（e）表示微泡流在血管中的灌注情況，不同的顏色編碼分別表示不同的血流速度。在圖3（f）中，不同的顏色編碼分別表示不同的血流方向。

圖3 第一個成像剖面Fig.3 An image section of the rabbit eye

圖4 為兔眼的另一成像剖面，在這個剖面內(nèi)，可見鞏膜和球后微血管，眼前血管沿鞏膜呈圓形分布，并且可以觀察到，視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜有密集的脈管系統(tǒng)，血管的數(shù)量和密度沿視網(wǎng)膜到脈絡(luò)膜的深度增多。血流速度和血流方向如圖4（e）～（f）所示，從圖4（e）中可以看出，超分辨成像可以檢測到低至 4.1 mm/s 的微血流。

圖4 另一成像剖面Fig.4 Image of another section of the rabbit eye

圖5（a）為圖4（c）中白色框內(nèi)的放大視圖，圖5（b）為圖4（d）中白色框內(nèi)的放大視圖。從圖5（a）～（b）中可以看出，微血管的細小分支不能通過功率多普勒超聲顯示，但超聲超分辨成像卻可以可視化微血管。局部放大超分辨圖像標記位置的截面輪廓如圖5（c）所示，可以看出，超分辨成像可以清楚地區(qū)分兩個相距 61 μm 的微血管，并且可以可視化直徑小于 50 μm 的單個微血管。

圖5 多普勒與超分辨成像分辨率對比分析Fig.5 The contrast of Doppler and super-resolution imaging

3.3 二維超聲超分辨微血流成像結(jié)果

3.2 小節(jié)展示了兩只眼睛剖面的超分辨圖像，利用機械掃描方法一共采集了 50 個剖面，本小節(jié)將 50 個剖面重建為三維微血流圖像。圖6（a）為三維功率多普勒圖像，圖6（c）為超分辨成像微血管圖像。圖6（b）為與原 B 模式圖像融合后的多普勒血圖，圖6（d）為與原 B 模式圖像融合后的微血管圖像。由圖6（a）～（d）可知，眼底有致密的微血管，且視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜的血管包裹眼球，這與已知眼睛的解剖結(jié)構(gòu)是一致的。

圖6 兔全眼機械掃描三維微血流圖像Fig.6 The 3D volume images of the whole eye of the rabbit

4 討 論

本文應(yīng)用超聲超分辨微血流成像技術(shù)對全眼微血管進行了在體研究。實驗結(jié)果表明，距離為 61 μm 的兩個微血管可以被清晰區(qū)分，成像算法可以可視化直徑小于 50 μm 的單個微血管，其中，理論分辨率極限約為 96 μm[11]?？偟膩碚f，在超過 15 mm 的成像深度下，三維超聲超分辨成像成功地實現(xiàn)了對眼睛后部微血管的檢測，分辨率約為 50 μm。

眼睛血液微循環(huán)的改變是各種眼部疾病的早期征兆，如青光眼、黃斑變性、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變和糖尿病視網(wǎng)膜病變等。光學(xué)相干斷層血管造影、眼底鏡等光學(xué)成像技術(shù)是臨床眼科診斷中常用的高分辨率眼血管可視化技術(shù)[7-8]。然而，由于其穿透深度較淺，不能有效穿透不透明組織，因此，這些光學(xué)成像方式很難可視化球后血管[9]。超聲成像具有無創(chuàng)、不受屈光介質(zhì)的影響等優(yōu)點，已成為眼科檢查不可缺少的工具。然而，由于衍射的限制，傳統(tǒng)的超聲多普勒成像的分辨率被限制在半波長以下，很難檢測到幾十微米或更小的微血管[28]。因此，本研究采用基于超快復(fù)合平面波成像技術(shù)的超分辨成像對全眼微血管進行可視化，對眼科疾病的診斷具有重要價值。與已有超聲超分辨眼底微血流成像相比[29-30]，本文所提出的方法可以對全眼微血流系統(tǒng)進行成像，并且可以通過機械掃描對整個眼部區(qū)域的微血流進行三維成像，可以進一步提高眼科疾病的早期診斷效率。

然而，本研究存在一定的局限性。

第一個局限性是成像技術(shù)采用線陣換能器，無法直接在三維空間中定位微氣泡，因此，在陣元仰角方向上的分辨率受到了限制。此外，由于換能器通過機械掃描重建三維超聲圖像，因此無法消除機械掃描方向上的運動偽影。這是使用一維線性陣列換能器進行三維超分辨成像所存在的一個缺點。在未來的研究中，使用二維矩形陣列換能器或其他方法可能會解決這個問題[38]。

第二個局限性是超分辨成像所需要的采集時間比較長，特別是對于血流速度較低的小血管而言，超分辨率微血管圖的重建需要多幀微泡中心點的累積。在本研究中，每個掃描平面在 800 Hz的幀率下獲得 2 400 幀。因此，每個切片的成像大約需要 8 s（數(shù)據(jù)采集 3 s，數(shù)據(jù)保存 5 s），在機械掃描步長為 150 μm 的情況下，對整個眼睛進行完整的 3D 掃描大約需要 7 min 的成像時間。然而，由于眼睛的高敏感性，在臨床眼科診斷應(yīng)用中，獲得大量數(shù)據(jù)具有挑戰(zhàn)性。為了減少采集時間，可以在未來的工作中使用基于深度學(xué)習(xí)的定位方法[21-22]來定位高密度的微氣泡。

第三個局限性是微泡檢測方法。本文利用預(yù)先測定的平均 PSF 與提取的微泡信號進行二維歸一化互相關(guān)。然而，不同半徑、形狀的流動微泡的 PSF 可能不同，如果使用高互相關(guān)閾值，則可能會將微泡信號濾除，不利于超分辨圖像重建。如果使用低閾值，則可能將其余噪聲信號當作微泡信號，從而引入誤差信息。由于無法準確估計微氣泡的 PSF，因此很難在微氣泡對應(yīng)的信號水平和噪聲信號水平之間設(shè)定一個精確的折衷。在后面的研究中，需要設(shè)計更加精確、快速的微泡定位算法，以重建超分辨圖像。

5 結(jié) 論

綜上所述，本研究成功利用三維超聲超分辨成像顯示了整個眼睛的三維微血管系統(tǒng)。與傳統(tǒng)的光學(xué)成像和超聲多普勒圖像相比，超聲超分辨成像可以區(qū)分兩個直徑小于 50 μm 且距離為61 μm 的血管，成像分辨率遠高于傳統(tǒng)多普勒成像，且成像深度也遠高于光學(xué)成像，除了可以精確提供血管的形態(tài)學(xué)參數(shù)外，還可以得到血管的動力學(xué)參數(shù)。體內(nèi)實驗結(jié)果表明，三維超聲超分辨成像在眼部疾病的早期診斷方面具有臨床應(yīng)用潛力。