余水法，周小衛(wèi)，張國娣

(1.溧陽市農(nóng)業(yè)綜合技術(shù)推廣中心，江蘇 溧陽 213300；2.溧陽市昆侖街道辦事處農(nóng)業(yè)農(nóng)村工作辦公室，江蘇 溧陽 213300)

目前，針對(duì)越冬綜合征的誘發(fā)因素主要從養(yǎng)殖管理等方面進(jìn)行分析，如養(yǎng)殖密度太大、餌料質(zhì)量有問題、秋冬水質(zhì)管理不佳等，而病原學(xué)的研究尚沒有統(tǒng)一的結(jié)論。2023年4月，溧陽市某漁場(chǎng)異育銀鯽養(yǎng)殖暴發(fā)越冬綜合征，死亡率較高。本研究對(duì)發(fā)病塘口進(jìn)行采樣，開展細(xì)菌性病原的研究，為做好江蘇省越冬綜合征的防控奠定基礎(chǔ)。根據(jù)研究結(jié)果采取了系列防治措施，最終使病情得到有效控制。

一、材料與方法

1.樣品采集和細(xì)菌分離

2023年4月，溧陽市某漁場(chǎng)異育銀鯽發(fā)病，病魚體表出血嚴(yán)重、大面積鱗片脫落，眼球突出明顯，吃食率下降，每天病魚死亡20～30 尾，持續(xù)1周左右，初步診斷為越冬綜合征。

無菌采取魚的病灶和臟器，劃線接種于LB 固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24 小時(shí)；挑取單個(gè)菌落，再次劃線接種于LB 固體培養(yǎng)基進(jìn)一步純化。經(jīng)兩次分離純化后的菌落，進(jìn)行基因擴(kuò)增。

2.氣單胞菌管家基因擴(kuò)增測(cè)序

按照試劑盒說明書提取細(xì)菌基因組，基于氣單胞菌管家基因DNA 促旋酶B亞單位(gyrB)進(jìn)行PCR檢測(cè)。gyrB上下游引物與擴(kuò)增片段大小如表1 所示。PCR 反應(yīng)總體積為30 微升，其中含有2 微升基因組模板、1.3 微升上游引物和1.3 微升下游引物、15 微升PCR Mix 液以及10.4微升超純水。取7微升PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，當(dāng)出現(xiàn)預(yù)期條帶后回收PCR 產(chǎn)物，PCR 產(chǎn)物回收后進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果通過BLAST 分析，與NCBI 數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有的核酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，確定菌株種屬。

表1 PCR引物信息

3.氣單胞菌特性分析

(1)斑馬魚致病性試驗(yàn)。挑取氣單胞菌單菌落接種于BHI 培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)24 小時(shí)。接下來用無菌PBS 進(jìn)行10 倍比例稀釋，把濃度分別調(diào)整至5.0×102～5.0×109CFU/毫升。然后以0.02 毫升/尾的劑量對(duì)每組斑馬魚進(jìn)行腹腔注射，確保每組的細(xì)菌量分別為10～108CFU。陰性對(duì)照組斑馬魚僅注射0.02毫升PBS。每天定時(shí)觀察記錄斑馬魚的存活情況，持續(xù)一周，并使用Bliss算法計(jì)算斑馬魚半數(shù)致死量(LD50)。

(2)細(xì)菌胞外產(chǎn)物活性測(cè)定。細(xì)菌溶血性測(cè)定：蘸取試驗(yàn)菌株，分別劃線接種于5%綿羊血營(yíng)養(yǎng)平板上，28℃培養(yǎng)24小時(shí)，觀察有無溶血活性。

(3)細(xì)菌最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定。先將試驗(yàn)菌株接種于BHI 液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)18 小時(shí)，并校正菌液濃度為1.5×108CFU/毫升，然后以1∶1000濃度的生理鹽水將其稀釋。將藥物以表2濃度梯度稀釋，并依次加樣加入96孔板中。將氣單胞菌菌液稀釋液加入96 孔板的各個(gè)孔中，加樣完畢后將微孔板密封膜貼于孔板上，在37℃條件下孵育18～24 小時(shí)。通過觀察，確定無細(xì)菌生長(zhǎng)的孔位位置，該位置對(duì)應(yīng)的梯度稀釋濃度即為該抗生素的最小有效抑制濃度。

表2 藥物敏感試驗(yàn)各供試藥物濃度 微克/毫升

二、結(jié)果與分析

1.細(xì)菌鑒定

從發(fā)病鯽魚的眼球、體表和肝臟中均分離到一株優(yōu)勢(shì)菌，菌落形狀大小均如圖1 所示，為圓形、隆起型、乳白色菌落，與氣單胞菌菌落特點(diǎn)相似。gyrB 管家基因的PCR 擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果與NCBI基因庫中現(xiàn)有的核酸序列進(jìn)行BLAST分析和同源性比對(duì)，鑒定結(jié)果為溫和氣單胞菌，命名為L(zhǎng)Y2023001。

2.LD50測(cè)定

斑馬魚致病性試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，計(jì)算株菌的LD50值。根據(jù)濮俊逸等對(duì)細(xì)菌致病力的分類，LY2023001 的LD50值為1.64×104CFU/尾，判定為強(qiáng)致病力菌株。

表3 動(dòng)物回歸感染試驗(yàn)及LD50值計(jì)算結(jié)果

3.細(xì)菌胞外產(chǎn)物活性測(cè)定

通過劃線血平板，發(fā)現(xiàn)LY2023001具有溶血性(表4)。進(jìn)一步的溶血活性試驗(yàn)結(jié)果顯示，LY2023001的溶血性強(qiáng)于標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7966，溶血價(jià)為1∶8。

表4 胞外產(chǎn)物活性測(cè)定結(jié)果

蛋白酶活性試驗(yàn)結(jié)果顯示LY2023001具有較強(qiáng)的胞外蛋白酶活性，其胞外蛋白酶活性為0.334，遠(yuǎn)高于對(duì)照菌株ATCC7966的0.177。

4.藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果

由表5 可知，LY2023001 對(duì)恩諾沙星、硫酸新霉素、氟甲喹和磺胺甲噁唑/甲氧芐啶敏感，而對(duì)其他4 種抗菌素耐藥，其中對(duì)恩諾沙星最敏感，MIC 僅為0.125 微克/毫升，可以考慮作為首選藥物。

表5 氣單胞菌對(duì)不同抗菌藥物的MIC值 微克/毫升

三、討論

自從越冬綜合征發(fā)病以來，全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站多次組織專家學(xué)者對(duì)發(fā)病塘口進(jìn)行采樣，開展病原學(xué)研究。對(duì)來自多個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)病魚內(nèi)臟進(jìn)行不同培養(yǎng)基的細(xì)菌分離，也未見大量細(xì)菌生長(zhǎng)，分離獲得的細(xì)菌主要為維氏氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌和類志賀鄰單胞菌。珠江水產(chǎn)研究所團(tuán)隊(duì)認(rèn)為柱狀黃桿菌是越冬綜合征的主要病原；長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所團(tuán)隊(duì)認(rèn)為當(dāng)前黃顙魚所患疾病以鮰愛德華氏菌感染引起的腸道敗血癥為主；浙江淡水水產(chǎn)研究所團(tuán)隊(duì)從患病黃顙魚中分離到新的小RNA病毒。本研究中從發(fā)病的異育銀鯽病灶處分離到一株優(yōu)勢(shì)菌，鑒定為溫和氣單胞菌，命名為L(zhǎng)Y2023001。

近年來由溫和氣單胞菌引起的草魚、美洲鰣、黃顙魚等魚發(fā)病的情況也時(shí)有發(fā)生，具有一定的致病性。本研究中分離的LY2023001是一株強(qiáng)致病力菌株，LD50為1.64×104CFU/尾，具有較高的溶血活性和胞外蛋白酶活性。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌對(duì)恩諾沙星、硫酸新霉素、氟甲喹和磺胺甲噁唑、甲氧芐啶敏感，可以選用恩諾沙星作為治療此次越冬綜合征的首選藥物。

根據(jù)藥敏結(jié)果制定治療方案。外用選擇優(yōu)質(zhì)碘制劑潑灑2～3 次，施藥間隔1 天。內(nèi)服可以在飼料中添加恩諾沙星進(jìn)行治療，疾病治愈后停掉抗生素，改為保肝藥、維生素及乳酸菌繼續(xù)投喂7～10 日天。治療1 周后，病魚出現(xiàn)充血、表皮潰爛的數(shù)量減少，死亡數(shù)明顯減少。兩周后魚群基本恢復(fù)健康，采食量恢復(fù)至正常水平，魚群未出現(xiàn)疑似越冬綜合征的癥狀。