范菁,唐昊翔,王銀輝,范煒斌,謝姣,林彬

(1.浙江省長興縣人民醫(yī)院藥學部,長興 313100;2.湖州市智能藥學與個體化治療重點實驗室,長興 313100;3.浙江省長興縣疾病預防控制中心,長興 313100;4.西安交通大學附屬第二醫(yī)院藥學部,西安 710004)

2021年奈瑪特韋片/利托那韋片組合包裝上市,根據(jù)公司發(fā)布的臨床數(shù)據(jù)表明,其可大大降低輕度或中度新型冠狀病毒感染(簡稱新冠)患者的住院或死亡風險,為新冠患者治療帶來曙光,引起業(yè)內的高度關注[1]。2022年12月奈瑪特韋片/利托那韋片組合包裝作為新型抗新冠病毒藥物被寫入《新型冠狀病毒感染診療方案(試行第十版)》,用于新冠患者的治療[2-3]。其中奈瑪特韋是新型冠狀病毒SARS-CoV-2主要蛋白酶抑制劑,它能夠通過阻斷病毒多蛋白前體的加工,從而阻止病毒復制。利托那韋作為CYP3A的抑制劑,與奈瑪特韋聯(lián)合應用時,可防止奈瑪特韋過早的代謝失活,從而提高奈瑪特韋在患者體內的藥物濃度[4-5]。當奈瑪特韋/利托那韋與通過該途徑代謝的藥物聯(lián)合使用時,會影響其療效或增加不良反應的發(fā)生風險。為了避免藥物之間的相互作用,明確奈瑪特韋、利托那韋在患者體內的血藥濃度十分重要[6]。因此,使用奈瑪特韋/利托那韋治療的患者,建議進行藥物濃度監(jiān)測,對提高臨床療效和降低不良反應具有重要意義。

截至2023年5月,超高效液相色譜-串聯(lián)質譜(ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spec-tormetry,UPLC-MS/MS)法用于患者體內奈瑪特韋/利托那韋血藥濃度檢測方法學的報道有2篇,但測定方法存在樣本處理復雜、樣本分析時間過長等,無法滿足臨床大樣本檢測[7-8]。本文建立UPLC-MS/MS檢測奈瑪特韋/利托那韋的血藥濃度,為新冠患者的治療藥物監(jiān)測以及藥動學相關研究提供方法學基礎。

1 材料與方法

1.1儀器 質譜儀(型號:Xevo TQ-S cronos,美國沃特世公司);超高效液相色譜儀(型號:H-Class Plus,美國沃特世公司);臺式高速冷凍離心機(型號:5424R,德國艾本德公司),旋渦混勻器(型號:VORTEX-3,德國艾卡公司),電子分析天平(型號:BSA-124S,德國賽多利斯公司,感量:0.1 mg)。

1.2藥品與試劑 奈瑪特韋對照品(上海源葉生物科技有限公司,批號:N17HS201609,含量≥98%);利托那韋對照品(中檢院標準物質有限公司,批號:F1503111,含量≥99%);奈瑪特韋-D9內標[島津(上海)有限公司,批號:DD023-221A1,含量≥98%];13C,2H3-利托那韋內標[島津(上海)有限公司,批號:155216-67-5,含量≥98%],甲酸、乙腈、甲醇溶液(色譜級,美國西格瑪公司)。

1.3液相色譜條件 色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm×50 mm,1.7μm);流動相:A相為100%乙腈,B相為0.1%甲酸,流速:0.3mL·min-1;色譜柱溫:45 ℃;進樣量:2 μL,梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.4質譜條件 離子源電噴霧離子(ESI+)模式;毛細管電壓:3 000 V;去溶劑化溫度:350 ℃;氮氣(nitrogen,N2)流速600 L·h-1;掃描方式為MRM模式,奈瑪特韋、利托那韋及相應內標的其他質譜檢測數(shù)據(jù)見表2。

表2 奈瑪特韋和利托那韋及內標的質譜檢測參數(shù)

1.5儲備液及工作液的配制 精密稱取奈瑪特韋及利托那韋對照品適量,奈瑪特韋及其內標物奈瑪特韋-D9以乙腈溶解,利托那韋及其內標13C,2H3-利托那韋以乙腈：水(50：50)溶解,將奈瑪特韋及利托那韋分別制備成1.00mg·mL-1的對照品儲備液。將奈瑪特韋-D9及13C,2H3-利托那韋各自溶解后混合,以含有0.1%甲酸的乙腈：甲醇(3：1)稀釋,得到奈瑪特韋-D9及13C,2H3-利托那韋濃度分別為1.00和0.50μg·mL-1的混合內標物工作液,-20 ℃避光保存。

取奈瑪特韋及利托那韋對照品儲備液適量,以含有0.1%甲酸的乙腈：水(3：1)逐級稀釋得到系列混合對照品工作液(奈瑪特韋:100、80、50、20、10、5、1 μg·mL-1;利托那韋:50、40、20、10、5、1、0.5 μg·mL-1),質控低濃度(奈瑪特韋:5 μg·mL-1;利托那韋:1 μg·mL-1)、中(奈瑪特韋:10 μg·mL-1;利托那韋:10 μg·mL-1)、高(奈瑪特韋:80 μg·mL-1;利托那韋:40 μg·mL-1)。

1.6標準曲線及質控品的制備 空白人血漿90 μL中加入奈瑪特韋及利托那韋混合對照品工作液10 μL,配制標準曲線和質控品,標準曲線范圍為奈瑪特韋:10、8、5、2、1、0.5、0.1 μg·mL-1;利托那韋:5、4、2、1、0.5、0.1、0.05 μg·mL-1;質控低濃度(奈瑪特韋:0.5 μg·mL-1;利托那韋:0.1 μg·mL-1)、中(奈瑪特韋:1 μg·mL-1;利托那韋:1 μg·mL-1)、高(奈瑪特韋:8 μg·mL-1;利托那韋:4 μg·mL-1),定量下限(奈瑪特韋:0.1 μg·mL-1;利托那韋:0.05 μg·mL-1)。

1.7血漿樣品處理 精密吸取血漿樣品100 μL,加入混合內標工作液300 μL,渦旋混合均勻,12 000 r·min-1離心5 min,取上清液2 μL進樣分析。

1.8臨床應用

1.8.1患者納入與排除標準 納入標準:①>18歲新冠病毒核酸檢測或抗原檢測結果陽性;②本人或家屬簽署知情同意書。排除標準:①擅自中斷或更改藥物劑量;② 1周內服用細胞色素P450酶或P-糖蛋白抑制劑或誘導劑。

1.8.2用藥方法與結果檢測 收集長興縣人民醫(yī)院2023年1月服用奈瑪特韋片/利托那韋片治療的新冠患者血液標本共計30例。該研究已通過長興縣人民醫(yī)院倫理委員會審批[(2023)倫審藥/械/研第(046號)]。30例患者均接受奈瑪特韋/利托那韋口服治療,其中奈瑪特韋300 mg、利托那韋100 mg,bid。根據(jù)奈瑪特韋以及利托那韋的半衰期計算,連續(xù)給藥在2 d后血藥濃度達穩(wěn)態(tài)。于第3天給藥前半小時采血,血樣收集于血漿分離膠采血管中,離心,取上清液進行血漿預處理后分析檢測。

2 結果

2.1方法學專屬性考察 選取6份不同的空白血漿、已加入定量下限的血漿樣品、來自服用奈瑪特韋片/利托那韋的患者穩(wěn)態(tài)谷濃度血漿樣品,按血漿樣本處理流程處理后進行分析檢測,色譜圖見圖1。奈瑪特韋及其內標奈瑪特韋-D9的保留時間均為2.07 min,利托那韋及其內標13C,2H3-利托那韋的保留時間均為2.28 min。人血漿中內源性物質在保留時間內的響應值明顯低于定量下限的20%,且不干擾目標峰的分析。

A.空白血漿;B.定量下限的血漿樣品;C服用奈瑪特韋/利托那韋患者的穩(wěn)態(tài)谷濃度血漿樣品。

2.2標準曲線與線性范圍 以奈瑪特韋或利托那韋的濃度為橫坐標(X),血漿樣品測得的峰面積與各自內標物奈瑪特韋-D9或13C,2H3-利托那韋峰面積比(Y)進行線性回歸并繪制標準曲線,得到奈瑪特韋標準曲線方程為:Y=4.553 82X+0.223 37,r2=0.997 2,線性范圍為0.1～10 μg·mL-1。利托那韋標準曲線方程為:Y=1.080 27X+0.024 901 3,r2=0.995 2,線性范圍為0.05～5 μg·mL-1。奈瑪特韋定量下限為0.1 μg·mL-1,利托那韋定量下限為0.05 μg·mL-1。

2.3精密度與準確度 按照血漿樣品處理流程操作,分別配制定量下限、低、中、高質控4個濃度的血漿樣本,每一濃度重復配制6次,分別檢測。連續(xù)3 d。結果見表3。結果顯示奈瑪特韋與利托那韋在各質控濃度及定量下限濃度的準確度均在±10%內。奈瑪特韋批內精密度范圍為4.26%～9.28%,利托那韋批內精密度2.91%～6.01%,奈瑪特韋批間精密度范圍為4.96%～8.31%,利托那韋批間精密度4.40%～9.31%,精密度和準確度符合《中華人民共和國藥典》的相關技術要求。

表3 奈瑪特韋與利托那韋測定方法的準確度與精密度

2.4提取回收率 在3個質控濃度(低、中、高)下,評價奈瑪特韋以及利托那韋的提取回收率。將各質控濃度的血漿樣本處理后進樣分析得到峰面積A。另取空白血漿按血漿處理流程,將混合內標工作液替換成等體積的含有0.1%甲酸的乙腈：甲醇(3：1),加入對應濃度的奈瑪特韋、利托那韋及內標,進樣分析,得到峰面積B,提取回收率(%)為峰面積A與峰面積B的比值×100%。結果見表4。奈瑪特韋和利托那韋的提取回收率均>94%。

表4 奈瑪特韋與利托那韋提取回收率與基質效應

2.5基質效應 考察6份不同來源的空白血漿對奈瑪特韋與利托那韋各質控濃度(低、中、高)的影響,空白血漿進行血漿樣本處理后添加相應濃度的奈瑪特韋、利托那韋與內標溶液,進行分析得到峰面積(C)。相應濃度的奈瑪特韋、利托那韋與內標純溶液,進樣分析得到峰面積(D)?；|效應(MF)=C/D×100%,結果見表4,奈瑪特韋的基質效應為92.4%～97.7%,利托那韋的基質效應為94.2%～97.6%。

2.6殘留效應 取定量上限血漿樣本(奈瑪特韋:10 μg·mL-1;利托那韋:5 μg·mL-1)進樣,每次進樣后進空白血漿,平行6次,殘留效應=進樣定量上限后的殘留峰面積/定量下限峰面積。結果顯示,定量上限濃度點后的空白血漿在奈瑪特韋、利托那韋和內標對應的保留時間處未見明顯的信號峰,奈瑪特韋的殘留韋0.10%,利托那韋的殘留韋0.15%,表明殘留物對血漿樣品的后續(xù)檢測無影響。

2.7稀釋可靠性 取奈瑪特韋及利托那韋儲備液,加入空白血漿,配制含奈瑪特韋及利托那韋濃度分別為20、10 μg·mL-1的混合血漿樣本,平行 15 份樣。用空白血漿對以上混合血漿樣本進行 2、4 和 10 倍稀釋。最終得到含奈瑪特韋/利托那韋濃度10/5、5/2.5、2/1 μg·mL-1混合血漿樣本各5份。處理后進樣分析。測定結果顯示稀釋2、4 和 10 倍的樣品奈瑪特韋/利托那韋測定結果與標示量的偏差分別為-3.5%/-4.2%、-5.2%/-2.1%、-4.9%/-6.6%。

2.8穩(wěn)定性 配制各質控濃度(低、中、高)血漿樣品,每個濃度平行配制3份,分別考察質控品在長期穩(wěn)定性(-20 ℃,30 d);反復凍融穩(wěn)定性(-20 ℃→室溫,3次);短期穩(wěn)定性(室溫,24 h);以及處理后自動進樣器穩(wěn)定性(10 ℃,48 h),結果見表5。結果表明奈瑪特韋及利托那韋在以上條件下濃度沒有明顯變化,RSD在±10%。

表5 奈瑪特韋與利托那韋穩(wěn)定性試驗結果

2.9臨床結果 30例患者中,男17例,女13例,年齡(63.9±17.6)歲。患者平均體質量(70.3±10.1) kg,肌酐清除率平均值為(98.2±19.9) mL·min-1。其中伴高血壓8例,糖尿病3例,腫瘤2例。

奈瑪特韋谷濃度為0.38～2.05μg·mL-1,平均藥物濃度為(1.00±0.43)μg·mL-1。利托那韋谷濃度為0.07～0.89μg·mL-1,平均藥物濃度為(0.35±0.22)μg·mL-1。提示奈瑪特韋和利托那韋在不同患者間的藥物濃度差異較大。所有結果均在定量分析線性范圍內。本試驗建立的UPLC-MS/MS法能滿足臨床對奈瑪特韋/利托那韋血藥濃度檢測的需求。結果見圖2。

圖2 新冠患者體內奈瑪特韋和利托那韋血藥濃度的散點圖

3 討論

目前,有2篇關于奈瑪特韋/利托那韋定量檢測方法的報道,LIU等[7]報道一種基于液相色譜質譜聯(lián)用測定健康志愿者體內奈瑪特韋和利托那韋的含量的方法,該液相方法檢測時間共7 min,檢測效率低;另外,該檢測方法僅應用于健康志愿者進行濃度監(jiān)測,新冠患者病理生理情況復雜,不一定適用。MARTENS-LOBENHOFFER等[8]報道一種基于液相色譜質譜聯(lián)用測定新冠患者體內奈瑪特韋和利托那韋的含量的方法,該方法梯度長達13 min,同樣存在檢測時間長、效率低的問題,不適用于臨床大量樣本檢測。此外,這2種方法樣本預處理方法復雜,檢測前需要進行繁瑣的準備過程,影響工作效率。本研究根據(jù)藥品說明書中藥動學數(shù)據(jù),設置合理的濃度范圍,采用UPLC-MS/MS法同時檢測人血漿中奈瑪特韋和利托那韋濃度。其中奈瑪特韋檢測濃度范圍為0.10～10.00μg·mL-1,利托那韋檢測濃度范圍為0.05～5.00μg·mL-1。該方法檢測時間3 min,其中奈瑪特韋及其內標奈瑪特韋-D9的出峰時間均為2.07min,利托那韋及其內標13C,2H3-利托那韋的出峰時間均為2.28min。

考慮到分析物以及內標化合物的物理化學性質,本研究檢測離子源選擇了電噴霧正離子模式,并對以下質譜參數(shù)進行了優(yōu)化:毛細管電壓、N2流速、去溶劑化溫度、四級桿碰撞能量等。血漿前處理采用了蛋白沉淀法,以含內標的乙腈：甲醇(3：1)作為沉淀劑,相比于其他檢測方法沉淀蛋白時先加內標混勻后再加沉淀劑費時繁瑣[9-11],筆者在本方法中提前將內標與沉淀劑制備成混合內標工作液,僅需一步即可采用高速離心的方法除蛋白,方法簡單?？紤]到基質效應等因素,本方法使用結構相似的同位素作為內標物質,其中奈瑪特韋-D9作為奈瑪特韋的內標,13C,2H3-利托那韋作為利托那韋的內標。試驗結果說明當奈瑪特韋-D9及13C,2H3-利托那韋作為內標時,基質效應可忽略不計。

試驗中發(fā)現(xiàn),奈瑪特韋和利托那韋在色譜中保留時間越長,峰形越差。通過優(yōu)化洗脫程序,將奈瑪特韋和利托那韋的出峰時間控制在3 min內,以此獲得優(yōu)越的峰形。此外,柱溫對奈瑪特韋的峰形有顯著的影響,對利托那韋無明顯影響,通過比較不同的柱溫,發(fā)現(xiàn)柱溫為45 ℃時峰形最佳。為了提高電離效果,本研究在水相中加入0.1%甲酸。

考慮到奈瑪特韋和利托那韋在患者體內的藥物濃度較低[12],筆者在本研究中選擇靈敏度較高的UPLC-MS/MS法,該方法操作簡便,靈敏度和檢測效率高,適用于奈瑪特韋和利托那韋的血藥濃度監(jiān)測。

MARTENS-LOBENHODDER等[8]針對新冠患者的研究表明,患者接受奈瑪特韋/利托那韋口服治療后(其中奈瑪特韋300 mg、利托那韋100 mg,bid),患者體內奈瑪特韋谷濃度范圍為0.33～4.73 μg·mL-1,利托那韋谷濃度范圍為0.05～0.64 μg·mL-1,與本研究中新冠患者體內奈瑪特韋/利托那韋藥物濃度范圍相近。結果顯示,奈瑪特韋和利托那韋在不同患者間的藥物濃度差異較大,結合部分患者的臨床療效也發(fā)現(xiàn)谷濃度較高的患者更易發(fā)生不良反應,另外谷濃度過低可能影響患者的好轉,但是需要擴大樣本量進一步深入研究。

筆者在本研究中建立同時測定人血漿中奈瑪特韋和利托那韋藥物濃度檢測方法,并進行方法學驗證。該方法簡便、快速、靈敏度高,檢測范圍合理,為今后奈瑪特韋和利托那韋的臨床研究以及藥物安全性研究提供方法學支撐。