郭妍婷,周建民,王 晶,齊廣海

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量安全飼料源性因子風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(北京) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,北京 100081)

蛋殼是禽類進(jìn)化過程中為保護(hù)繁衍而形成的一種特殊結(jié)構(gòu),是蛋內(nèi)物質(zhì)與外界環(huán)境的交流通道,能夠?yàn)榕咛グl(fā)育提供物理保護(hù),并防止微生物入侵。雞蛋蛋殼由大約95%的碳酸鈣(CaCO3)、3.5%的有機(jī)基質(zhì)和1.5%的水組成[1]。鈣是蛋殼礦化過程中最為關(guān)鍵的礦物元素,直接影響蛋殼品質(zhì)[2],蛋殼中的鈣主要來自飼糧和骨骼。飼料是蛋殼礦化中Ca2+的主要來源,經(jīng)過消化道吸收進(jìn)入體液,再由體循環(huán)運(yùn)送到子宮部參與蛋殼礦化。在蛋殼礦化形成時(shí),髓質(zhì)骨破骨作用加劇,向子宮部提供了部分Ca2+。無機(jī)礦化離子[主要為Ca2+和碳酸氫根離子(HCO3-)]和有機(jī)基質(zhì)蛋白相互作用并運(yùn)輸至子宮部礦化位點(diǎn)是蛋殼礦化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3]。礦化離子在子宮部的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)主要有主動(dòng)運(yùn)輸和被動(dòng)運(yùn)輸。被動(dòng)運(yùn)輸主要是靠膜兩側(cè)的離子濃度差,是無需耗能的擴(kuò)散過程。Ca2+的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)包括跨細(xì)胞途徑(主動(dòng)運(yùn)輸)和旁細(xì)胞途徑(被動(dòng)運(yùn)輸),這一直以來是子宮部鈣吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)研究的重點(diǎn)。近年來隨著對(duì)胞外囊泡研究的深入,其對(duì)子宮部Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)和蛋殼礦化的作用成為新的研究熱點(diǎn)[4]。此外,轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)的成熟應(yīng)用正鑒定出越來越多參與了蛋殼礦化的Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因和蛋白,為理解Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)在蛋殼礦化發(fā)生和調(diào)節(jié)中的作用提供了新視角[1,5-6]。因此,以蛋殼礦化期的Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)為靶點(diǎn),通過營養(yǎng)干預(yù)的方式改善生產(chǎn)中蛋殼品質(zhì)下降的問題具備可行性。本文綜述了蛋殼礦化期子宮部Ca2+的來源和轉(zhuǎn)運(yùn)途徑,Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)蛋殼礦化和蛋殼品質(zhì)的影響及其營養(yǎng)調(diào)控措施,旨在為生產(chǎn)中雞蛋蛋殼品質(zhì)的改善提供科學(xué)依據(jù)。

1 蛋殼的礦化

蛋殼的形成是一個(gè)周期性、時(shí)序性的動(dòng)態(tài)過程,大約需要24 h。蛋殼的礦化主要發(fā)生在蛋雞輸卵管子宮部,是在子宮部分泌的有機(jī)基質(zhì)的精密調(diào)控下,由多種離子參與交換和沉積,形成以CaCO3為主要組成的生物礦化物[7]。蛋殼超微結(jié)構(gòu)中乳突層的形成是礦化初始階段,一般發(fā)生在排卵后5～10 h,礦化速度相對(duì)較慢。排卵后10～22 h,卵到達(dá)子宮部中部,在子宮液充足、持續(xù)的離子供應(yīng)下,蛋殼的礦化進(jìn)入快速沉積期,形成超微結(jié)構(gòu)中最厚的一層——柵欄層。排卵后22～24 h,進(jìn)入礦化末期,形成垂直晶體層、膠護(hù)膜等,礦化停止[8-9]。

2 蛋雞子宮部鈣離子的轉(zhuǎn)運(yùn)

蛋殼礦化形成所需的大量Ca2+和HCO3-,并不在子宮部貯存,而是由血液持續(xù)供應(yīng)[10]。因此子宮部Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)是指血液中的Ca2+跨過子宮上皮細(xì)胞,到達(dá)子宮液中蛋殼(或殼膜)礦化位點(diǎn)的過程。目前報(bào)道的子宮部Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)方式有三種:跨細(xì)胞途徑、細(xì)胞旁途徑和細(xì)胞外囊泡途徑[3-4]。

2.1 鈣離子的跨細(xì)胞和細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)途徑

跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)是蛋雞子宮上皮細(xì)胞Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)的經(jīng)典途徑。Ca2+從血液進(jìn)入到子宮上皮細(xì)胞需依賴瞬時(shí)受體電位陽離子通道蛋白(TRPV6),在細(xì)胞內(nèi)與鈣結(jié)合蛋白d28k(CaBP-d28k)結(jié)合,完成貯存或運(yùn)輸。除CaBP-d28k外,子宮上皮細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)Ca2+穩(wěn)態(tài)也具有調(diào)控作用[11]。細(xì)胞內(nèi)Ca2+過量時(shí),通過肌漿網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶(ATP13A5、ATP2A2/3)運(yùn)輸至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲(chǔ)存;當(dāng)胞內(nèi)Ca2+濃度不足時(shí),又通過Ca2+儲(chǔ)存庫——肌醇1,4,5-三磷酸受體(ITPR1/2/3)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放補(bǔ)充[12]。Ca2+從子宮上皮細(xì)胞排出到子宮液的過程則需質(zhì)膜Ca2+-ATP酶(plasma membrane calcium ATPase,PMCA)和Ca2+/Na+交換器的參與[13]。因此,子宮上皮細(xì)胞Ca2+的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)主要有3步:Ca2+首先通過Ca2+通道或Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入子宮上皮細(xì)胞一側(cè)的頂膜;其次,Ca2+進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)與Ca2+結(jié)合蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)到基底側(cè)膜;最后,Ca2+由子宮上皮細(xì)胞進(jìn)入子宮液。為維持子宮上皮細(xì)胞內(nèi)的離子平衡,Ca2+在子宮部轉(zhuǎn)運(yùn)的同時(shí)也伴隨Na+、K+、Mg2+、H+和Cl-的轉(zhuǎn)運(yùn)[6](圖1),因此涉及多種離子轉(zhuǎn)運(yùn)體的參與(表1),包括Na+通道(SCNN1α/2β/3γ)、Na+/K+交換器(ATP1A1、ATP1B2、NKA1N4)、K+內(nèi)流通道(KCNJ2/15/16、KCNMA1、KCNH1)、Cl-通道(CLCN2/5)、H+泵(ATP6V1B2、ATP6V1C2、ATP6V1G3、ATP6V0D2)和Mg2+通道(SLC41A2/3、NIPAL1)(表1),且Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因參與蛋殼的形成,表達(dá)隨蛋殼鈣化階段而發(fā)生變化[6,14]。此外,血液Ca2+也可直接通過上皮細(xì)胞之間的緊密連接蛋白進(jìn)入子宮液[15],此為細(xì)胞旁途徑。緊密連接蛋白包括閉合蛋白、閉鎖蛋白、閉合小環(huán)蛋白等[16]。

圖1 蛋雞子宮上皮細(xì)胞的離子轉(zhuǎn)運(yùn)(參考Broinne等[19]和Zhang等[20])Fig.1 The ion transport in uterine epithelial cells of laying hens (Referring to Broinne et al[19] and Zhang et al[20])

子宮部的HCO3-主要來自血液中的HCO3-和CO2[17]。血HCO3-依賴Na+/HCO3-共轉(zhuǎn)運(yùn)體——溶質(zhì)載體家族4成員4、5、7和10(solute carrier family 4, member 4/5/7/10,SLC4A4/5/7/10)進(jìn)入子宮上皮細(xì)胞。CO2則通過擴(kuò)散進(jìn)入上皮細(xì)胞,在碳酸酐酶4(CA4)的催化下與水形成HCO3-。子宮上皮細(xì)胞內(nèi)HCO3-的轉(zhuǎn)出則通過HCO3-/Cl-交換器——溶質(zhì)載體家族4成員8(solute carrier family 4, member 8,SLC4A8)和溶質(zhì)載體家族26成員9(solute carrier family 26, member 9,SLC26A9)。轉(zhuǎn)出的HCO3-隨后與子宮液中游離Ca2+結(jié)合形成碳酸鈣前體物質(zhì),沉積到蛋殼礦化位點(diǎn)[18]。綜上所述,蛋殼礦化是多種離子轉(zhuǎn)運(yùn)(Ca2+、HCO3-、Na+、H+、Mg2+、K+和Cl-)調(diào)控的協(xié)同過程,在此過程中,Ca2+和HCO3-以及有機(jī)質(zhì)前體分泌到子宮液中相互作用形成蛋殼[8]。因此,這些離子轉(zhuǎn)運(yùn)基因和載體與蛋殼礦化和蛋殼品質(zhì)有密切聯(lián)系。

2.2 胞外囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)途徑

胞外囊泡是由脂質(zhì)雙分子層包繞形成的球狀膜性囊泡。已發(fā)現(xiàn)并證實(shí),蛋雞子宮上皮細(xì)胞可通過分泌細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles,EV)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋殼礦化所需的碳酸鈣[4]。有研究在蛋雞輸卵管中鑒定到了胞外囊泡標(biāo)志物的mRNA,并證實(shí)EV參與了蛋殼礦化[4]。Waqas等[21]利用透射電鏡觀察到蛋雞的子宮上皮細(xì)胞和子宮液中存在與EV發(fā)生有關(guān)的多泡小體和包含無定形碳酸鈣(ACC)的EV。Riou等[22]研究了蛋雞子宮液中蛋白質(zhì)的分子功能,發(fā)現(xiàn)有29種蛋白質(zhì)與多泡小體的生物發(fā)生有關(guān),并在EV中檢測(cè)到熱休克蛋白家族成員8、熱休克蛋白家族成員90α、含纈酪肽蛋白、膜聯(lián)蛋白A(annexin-A1/2/4/5,ANXA-1/2/4/5)、帕金森氏病蛋白7和蘋果酸脫氫酶蛋白1等標(biāo)志蛋白。根據(jù)現(xiàn)有證據(jù),推斷EV轉(zhuǎn)運(yùn)Ca2+的模式如圖2所示:在蛋殼礦化開始時(shí),子宮上皮細(xì)胞分泌EV到子宮液,EV中的ANXA形成Ca2+通道,Ca2+與ANXA上的色氨酸殘基結(jié)合被轉(zhuǎn)運(yùn)至EV中,與CA4催化形成的HCO3-作用生成ACC,然后EV包裹著ACC運(yùn)輸至蛋殼礦化位點(diǎn)開始礦化。此過程中卵清蛋白、溶菌酶和其他EV蛋白共同作用阻止了子宮液的非特異性沉淀。有研究表明EGF樣重復(fù)序列和盤狀蛋白I樣結(jié)構(gòu)域3(EGF-like repeats and discoidin I-like domains 3,EDIL3)和重組乳脂球-EGF生長(zhǎng)因子8(recombinant milk fat globule-EGF factor 8,MFGE8)可將含有ACC的EV靶向引導(dǎo)到礦化位點(diǎn)[23]。目前對(duì)蛋雞子宮部EV轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的研究仍十分有限,EV在蛋殼礦化過程的作用和調(diào)控機(jī)制值得深入研究。

3 子宮部鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)蛋殼礦化和蛋殼品質(zhì)的影響

蛋殼礦化初始期碳酸鈣的平均沉積速度約為0.1 g·h-1,快速沉積期為0.33 g·h-1。子宮部Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)涉及了多個(gè)基因及蛋白。Jonchère等[6]通過F-2α前列腺素注射使雞蛋在蛋殼礦化前排出,對(duì)比了37個(gè)離子轉(zhuǎn)運(yùn)基因在礦化和非礦化期的表達(dá)情況,篩選到11個(gè)過表達(dá)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)基因,包括Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)基因(CALB1、ATP2B1,2)、Na+轉(zhuǎn)運(yùn)基因(SCNN1G、ATP1A1)、K+轉(zhuǎn)運(yùn)基因(KCNJ2、KCNJ15和KCNMA1)、HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)基因(CA2、SLC26A9)、Cl-轉(zhuǎn)運(yùn)基因(CLCN2,5)、H+轉(zhuǎn)運(yùn)基因(ATP6V1B2);Zhang等[24]通過轉(zhuǎn)錄組篩選出13個(gè)呈時(shí)序性表達(dá)的與離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因,結(jié)果表明,CALB1、CA2、SCL26A9、SCNN1G、NKAIN4、CLCN2,5和KCNJ15不僅在礦化期過表達(dá),且都在產(chǎn)蛋后16～20 h表達(dá)量達(dá)到最高。研究發(fā)現(xiàn),TRPV6與蛋殼強(qiáng)度和鈣含量呈正相關(guān),而且是調(diào)控蛋殼礦化的關(guān)鍵通道,隨著蛋殼礦化其表達(dá)量在快速沉積期達(dá)到最大[25];Khan等[26]對(duì)比了礦化初始期(排卵后5 h)和線性沉積期(排卵后15 h)的子宮轉(zhuǎn)錄組結(jié)果,發(fā)現(xiàn)與囊泡定位和分子合成相關(guān)的基因在礦化初始期上調(diào),而與Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)及離子和分子合成、分泌活動(dòng)相關(guān)的基因在線性沉積期表達(dá)上調(diào),進(jìn)一步,篩選和鑒定了影響蛋殼礦化和力學(xué)特性的離子轉(zhuǎn)運(yùn)基因[6,27]。高、低蛋殼強(qiáng)度((44.57±0.91)Nvs. (26.68±0.38)N)蛋雞在蛋殼礦化期子宮部的轉(zhuǎn)錄組研究顯示,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)基因(ATP13A5)和HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)基因(SLC4A1,SLC26A9)的表達(dá)水平在高蛋殼強(qiáng)度組中顯著上調(diào)[20];Zhang等[28]比較了高、低強(qiáng)度蛋殼蛋雞基因組,也鑒定出10個(gè)與Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的差異表達(dá)基因,其中包括Na+/Ca2+共轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因(SLC8A1)。另有研究報(bào)道,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)基因(ATP2A3、ITPR1)、Na+/HCO3-共轉(zhuǎn)運(yùn)基因(SLC4A5)和Na+/K+交換器基因(SLC8A3)顯著影響蛋殼強(qiáng)度、蛋殼厚度和蛋殼重量[26];內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+泵(ITPR2)與蛋殼強(qiáng)度和蛋殼厚度有關(guān),并通過其通道開放時(shí)間和時(shí)長(zhǎng)控制Ca2+分泌,從而調(diào)節(jié)蛋殼厚度[28-29]?？梢?蛋雞子宮部Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)與蛋殼品質(zhì)密切相關(guān),并且在蛋殼礦化過程中呈時(shí)序性表達(dá)。

除上述離子轉(zhuǎn)運(yùn)基因,離子轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)蛋殼礦化及品質(zhì)也有重要影響。鈣結(jié)合蛋白(CALB)不僅負(fù)責(zé)胞內(nèi)Ca2+的貯存和運(yùn)輸,還具有促進(jìn)CaCO3晶體沉積和形態(tài)調(diào)控的作用[30];PMCA作為子宮上皮細(xì)胞基底側(cè)膜的Ca2+泵,在子宮部的差異表達(dá)會(huì)影響蛋殼品質(zhì)[11];CA能夠促進(jìn)蛋殼膜上CaCO3晶體的生長(zhǎng)并加速其沉積,在高蛋殼強(qiáng)度產(chǎn)蛋雞體內(nèi)表現(xiàn)出更高的活性[31]。

表1 蛋雞子宮上皮細(xì)胞的離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體及功能Table 1 Ion transpoters and their fuctions of uterine epithelial cells in laying hens

圖2 蛋雞子宮液的胞外囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)(參考Stapane等[4])Fig.2 Extracellular vesicle transport in uterine fluid of laying hens (Referring to Stapane et al[4])

EV的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)成分也在蛋殼礦化過程中發(fā)揮作用。ANXA是EV中種類最豐富的蛋白質(zhì),從不同類型的細(xì)胞中共分離出12種不同的ANXA,其中對(duì)ANXA5在生物礦化中的作用研究最多[34]。而EV的脂質(zhì)成分磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)可提高ANXA5對(duì)Ca2+的親和力,并促進(jìn)CaCO3晶體的生長(zhǎng)[33]。蛋雞子宮部免疫熒光結(jié)果顯示,EDIL3水平在蛋殼礦化起始期間顯著升高[23],研究表明EDIL3和MFGE8可通過與富含Ca2+的晶體表面選擇性相互作用以促進(jìn)晶體成核或改變晶體形態(tài)[35]。另有研究比較了PS與ANXA5和MFGE8的結(jié)合能力,發(fā)現(xiàn)PS與MFGE8的親和力更高,推測(cè)MFGE8對(duì)EV運(yùn)輸ACC到礦化位點(diǎn)起更強(qiáng)的調(diào)控作用[36]。綜上,蛋雞子宮部Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)是蛋殼礦化的關(guān)鍵過程,以子宮部Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)為調(diào)節(jié)靶點(diǎn),通過營養(yǎng)干預(yù)的方式調(diào)節(jié)蛋殼礦化過程,可作為解決生產(chǎn)中多種因素(增齡、飼糧和應(yīng)激水平等)誘發(fā)蛋殼品質(zhì)下降問題的重要方向。

4 影響蛋雞子宮部鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)的因素

4.1 激素

Ca2+和HCO3-的離子平衡受下丘腦-垂體-性腺的激素軸調(diào)控。黃晨軒等[37]研究發(fā)現(xiàn),飼糧鈣水平對(duì)蛋殼品質(zhì)的影響與甲狀旁腺素水平有關(guān)。卵泡刺激素和黃體生成素可以促進(jìn)雌激素的分泌,而蛋雞子宮部CALB基因的表達(dá)受孕酮和雌激素的調(diào)節(jié),孕酮通過下調(diào)子宮部中Ca2+-ATPase、CALB和PMCA的基因表達(dá)抑制蛋殼礦化[38-40],而雌激素在蛋殼礦化期間分泌增加,促進(jìn)了CALB的表達(dá)[41]。Zhang等[42]研究發(fā)現(xiàn),孕酮可以改變蛋殼超微結(jié)構(gòu),進(jìn)而影響蛋殼品質(zhì),在蛋雞產(chǎn)蛋后2 h注射孕酮,可加速乳突體的早期融合,延長(zhǎng)礦化期,從而減少乳突層厚度并增加有效層厚度,其可能的機(jī)制是上調(diào)了礦化初始期子宮部CaBP-d28k及CA2的表達(dá)以增加子宮Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)和改善晶體結(jié)構(gòu),促進(jìn)CaCO3形成與沉積;而產(chǎn)蛋后5 h注射孕酮卻降低了蛋殼有效層厚度,可能是孕酮抑制了快速沉積期CaBP-d28k的表達(dá)使子宮部Ca2+供應(yīng)不足。此外,激素水平的變化影響因素較多,如何利用營養(yǎng)因素通過調(diào)控激素水平間接影響Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)是研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

4.2 維生素

CALB的表達(dá)與維生素D3代謝的強(qiáng)弱密切相關(guān),飼糧維生素D3被攝入體內(nèi)在肝和腎中轉(zhuǎn)化為1,25-二羥維生素D3(1,25-(OH)2D3),1,25-(OH)2D3是類固醇激素,可促進(jìn)腸上皮CALB的表達(dá),增加鈣離子的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn),進(jìn)而影響蛋殼形成,提高蛋殼品質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加125 μg·kg-1維生素D3和1,25-(OH)2D3增加了乳突密度和柵欄層厚度,提高了蛋殼強(qiáng)度,同時(shí)提高了血漿鈣水平[43];350～450 IU·kg-1飼糧維生素D3水平殼顯著改善蛋殼乳突層厚度以及血清鈣、磷含量[44]。飼糧中維生素D3缺乏時(shí),機(jī)體吸收鈣的能力下降,蛋雞子宮部CaCO3濃度隨之降低,則會(huì)導(dǎo)致薄殼蛋和軟殼蛋的產(chǎn)生[45]。然而,1,25-(OH)2D3是否調(diào)節(jié)蛋雞子宮部CALB的表達(dá)存在爭(zhēng)議[41,46],飼糧1,25-二羥維生素D3對(duì)子宮CALB蛋白水平?jīng)]有影響[47],而體外培養(yǎng)蛋雞子宮部組織中添加1,25-二羥維生素D3又可以促進(jìn)CALB蛋白的表達(dá)[48]。此外,有研究表明,維生素D3可以增加上皮組織中PMCA的表達(dá)[49]?？梢源_定的是,蛋雞對(duì)維生素D3或2,5-羥維生素D3的需求與鈣水平一樣存在上限,過量補(bǔ)充維生素D3雖提高了血鈣濃度,但加重了蛋殼丘疹問題[50]。此外有研究發(fā)現(xiàn),飼糧添加維生素A、維生素C對(duì)蛋殼品質(zhì)也有一定的改善作用[44,51],但是否通過調(diào)控Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)揮作用還需進(jìn)一步研究。

4.3 礦物元素

鈣、磷、銅、鋅、錳、鈉和氯等礦物元素是蛋殼形成所必須的,它們通過維持蛋殼礦化時(shí)子宮部的離子穩(wěn)態(tài)來調(diào)控Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn),并最終影響蛋殼的礦化過程[52-55]。

4.3.1 鈣、磷 鈣、磷來源和水平及鈣的溶解度都會(huì)對(duì)蛋殼品質(zhì)產(chǎn)生影響,同時(shí)與Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)有密切關(guān)系[58]。常見的鈣源有石灰石、蛤殼、牡蠣殼、蛋殼等;磷的來源主要有植酸磷和非植酸磷。Lee等[56]對(duì)比了粗、細(xì)雞蛋殼、石灰石、蛤殼和牡蠣殼對(duì)蛋殼品質(zhì)的影響,結(jié)果表明粗蛋殼相較于其他組可以更好地提高蛋殼品質(zhì);粗石灰或牡蠣殼相較于細(xì)石灰石在雞胃中停留時(shí)間長(zhǎng)、溶解速度也較慢,可以更好地為蛋雞供應(yīng)鈣,在夜間也可以維持血鈣濃度[57]。飼糧中添加非植酸磷可以改善蛋殼品質(zhì)[58]。隨周齡增加,蛋雞攝入礦物元素的能力逐漸下降,Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)減弱[59]。飼糧中鈣、磷水平可直接影響產(chǎn)蛋雞子宮腔內(nèi)CALB1蛋白表達(dá)而改變CaCO3的沉積能力[60-61]。研究表明,70周齡產(chǎn)蛋雞飼糧鈣水平升高可線性提高蛋殼強(qiáng)度和厚度,降低蛋殼破損率[62],4%鈣水平顯著降低了子宮部CA活性、提高了子宮部CALB含量,從而改善蛋殼品質(zhì)[63]。然而,一味地增加飼糧鈣水平并非是蛋殼品質(zhì)改善的“萬能密碼”,過高鈣水平亦會(huì)引發(fā)蛋雞子宮部Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)紊亂,造成蛋殼礦化異常[64]。Shet等[65]研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加植酸磷降低了蛋雞子宮部中CALB的表達(dá),說明磷的來源和水平也會(huì)影響Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)基因,但鈣的來源及溶解度對(duì)于Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)的影響還有待進(jìn)一步探究。

4.3.2 鋅、錳 研究發(fā)現(xiàn)鋅源(硫酸鋅和蛋氨酸鋅)和水平會(huì)影響蛋雞子宮部CA、堿性磷酸酶(ALP)、骨橋蛋白(OPN)和蛋殼基質(zhì)蛋白-116(OC-116)的基因表達(dá)及血清中CA和ALP水平,調(diào)控蛋殼礦化過程[66-67]。在蛋鴨上,飼糧添加80 mg·kg-1的鋅可促進(jìn)鴨蛋殼礦化過程中HCO3-的生成,增加蛋殼中的鈣、磷含量,并影響子宮部?jī)?nèi)CA2、SLC4A4/5和SLC26A9的基因表達(dá)[68]。錳源(硫酸錳和氨基酸錳)和水平同樣影響蛋殼礦化過程,飼糧硫酸錳可線性和二次提高蛋殼鈣化層中糖胺聚糖(礦化中Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)和沉積的重要調(diào)控物質(zhì))的含量,而氨基酸錳可同時(shí)提高蛋殼鈣化層和基質(zhì)薄膜中糖胺聚糖含量,二者通過調(diào)控蛋殼的礦化過程增加了蛋殼有效層厚度,從而改善蛋殼品質(zhì)[69],轉(zhuǎn)錄組與PCR結(jié)合分析進(jìn)一步證實(shí)了該過程還涉及錳對(duì)子宮蛋白糖基化和糖代謝的調(diào)節(jié)[70]。

4.3.3 鈉、氯 電解質(zhì)鈉、氯也是影響蛋殼品質(zhì)的重要因素。筆者團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn),利用碳酸氫鈉或硫酸鈉替代氯化鈉降低飼糧氯水平可提高鈣的表觀代謝率和蛋殼中鈣水平,改善蛋殼有效層厚度和蛋殼強(qiáng)度[71]。繼而以硫酸鈉和碳酸氫鈉分別作為鈉源,發(fā)現(xiàn)0.71%硫酸鈉(飼糧總鈉0.3%)可提高蛋殼鈣化層的糖胺聚糖水平,并改善蛋殼厚度和比例[72]。進(jìn)一步地,筆者團(tuán)隊(duì)證實(shí)了硫酸鈉通過上調(diào)子宮部離子轉(zhuǎn)運(yùn)基因SLC8A1、SCNN1α、ATP1BA和KCNMA1的表達(dá),提高峽部ATPS、SULT、DS和CS含量,改善蛋殼礦化結(jié)構(gòu)和品質(zhì)(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。因此,礦物元素在改善蛋殼品質(zhì)方向上具有巨大潛力,其他微量元素如鐵、硒、碘等對(duì)蛋殼子宮部Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)的影響有待進(jìn)一步研究。

4.4 氨基酸

氨基酸對(duì)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)的影響主要通過Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)和酶活性調(diào)控來提高蛋殼品質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn),隨著日糧添加精氨酸-硅酸鹽-肌醇復(fù)合物水平的提高,硅酸鹽和肌醇復(fù)合使用有利于提高精氨酸生物利用度[73],蛋殼鈣沉積量也相應(yīng)提高[74]。保持較低水平(約0.57%)的Met+Cys可以維持蛋殼厚度[75]。此外,氨基酸與礦物元素復(fù)合物似乎對(duì)改善蛋殼品質(zhì)有更好的效果。飼糧中添加Zn-Met和Mn-Met可以顯著增加蛋殼厚度[76];Abd El-Hack等[77]發(fā)現(xiàn),日糧添加50 mg ZnO和100 mg Zn-Met可以提高蛋雞血清中Zn水平;最新一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),在蛋雞飼糧中添加一種蛋白質(zhì)鋅也可以通過提高血清Zn水品顯著提高蛋殼品質(zhì)[78]。進(jìn)一步研究表明,飼糧添加80 mg·kg-1Zn-Met顯著提高了血清鈣含量和子宮CA、CaBP-d28k的基因表達(dá),促進(jìn)蛋殼礦化中Ca2+的沉積而提高蛋殼品質(zhì)[67];Min等[79]研究發(fā)現(xiàn)飼料添加蛋氨酸羥基類似物螯合鋅通過提高肝組織CA活性,促進(jìn)Ca2+沉積,改善蛋殼品質(zhì)。

4.5 植物提取物

近年來,植物提取物(類黃酮、精油)被發(fā)現(xiàn)可能通過促進(jìn)鈣、磷等礦物質(zhì)的吸收或增強(qiáng)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)能力提高蛋殼品質(zhì)[80-81]。類黃酮主要通過影響機(jī)體生長(zhǎng)激素釋放激素、促黃體素、孕酮等激素水平而調(diào)控Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)過程,Xiao等[82]在飼糧中添加大豆苷元與中草藥混合物,發(fā)現(xiàn)機(jī)體鈣、磷含量、黃體生成素水平顯著提高;4,7-二羥基異黃酮顯著提高機(jī)體孕酮、卵泡刺激素、黃體生成素和雌激素水平,從而促進(jìn)子宮中CaCO3晶體形成相關(guān)酶的產(chǎn)生提高蛋殼品質(zhì)[83-84];桑葉黃酮可以通過提高Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因CALB、KCNA1的表達(dá),提高蛋殼品質(zhì)等[85];在患有子宮炎癥的蛋雞飼糧中添加植物精油,可以通過提高CALB1、ATP2B1、ATP2B2、SLC26A9的表達(dá)來改善蛋殼品質(zhì)[86]。此外,酚類物質(zhì)、牛至精油、八角茴香精油等也被證明有提高蛋殼品質(zhì)的作用[87-89],但對(duì)其是否及如何參與蛋雞子宮部蛋殼礦化期的Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)還有待進(jìn)一步研究。綜上,植物提取物對(duì)礦化調(diào)控的作用有待深入研究。

5 總結(jié)與展望

近十余年來,中外學(xué)者對(duì)雞蛋蛋殼礦化過程的認(rèn)知取得了較大進(jìn)展。CaCO3作為蛋殼形成的最主要原料,子宮部Ca2+的有效運(yùn)無疑是蛋殼礦化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和保證。在已知的三條Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)途徑中,對(duì)跨細(xì)胞和細(xì)胞旁途徑的認(rèn)識(shí)已取得長(zhǎng)足進(jìn)展,而對(duì)胞外囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)途徑和調(diào)控機(jī)制的了解仍十分有限,具有很大的創(chuàng)新空間和研究?jī)r(jià)值。蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等技術(shù)的成熟應(yīng)用使得越來越多的Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因和蛋白與蛋殼礦化過程聯(lián)系了起來,這些因子對(duì)蛋殼力學(xué)特性、化學(xué)組成和微觀結(jié)構(gòu)的調(diào)控也正被逐漸認(rèn)知,這對(duì)以Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)為切入點(diǎn),從遺傳或營養(yǎng)角度優(yōu)化蛋殼礦化程序,改善蛋殼品質(zhì)提供了靶點(diǎn)和可能。從營養(yǎng)的角度看,對(duì)蛋殼礦化和品質(zhì)有實(shí)在或潛在調(diào)節(jié)效應(yīng)的物質(zhì)有很多,包括礦物質(zhì)、激素、氨基酸等常規(guī)營養(yǎng)素和植物提取物等飼料添加劑。然而,目前對(duì)這些物質(zhì)如何參與輸卵管子宮部的Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn),及調(diào)節(jié)礦化過程的具體機(jī)制的研究仍不夠深入,一定程度限制了其在生產(chǎn)上的廣泛應(yīng)用。筆者認(rèn)為,以蛋殼礦化過程的Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)為突破口,未來值得深入開展研究的方向有二:一是探索建立成熟的蛋雞子宮上皮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),助力從跨細(xì)胞和旁細(xì)胞途徑探究Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)蛋殼礦化和受外部調(diào)節(jié)的影響;二是加強(qiáng)胞外囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的深入研究,利用多種新興的技術(shù)和儀器開展囊泡形成和分泌機(jī)制、形態(tài)特征、理化性質(zhì)、功能特性和調(diào)控機(jī)制等研究,力求更深入的理解其在蛋殼礦化中的作用和調(diào)控潛力。