姚 穎,周應(yīng)聰,杜培巖,李一娟,錢文潔,李柳楊,余志鵬,崔 燕, 余四九,2,樊江峰,2*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,蘭州 730070;2.甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心,蘭州 730070)

牦牛(Bosgrunniens)是生活在青藏高原上的重要家畜資源,與普通牛相比,牦牛性成熟較晚,通常在3～4歲。牦牛繁殖力較低,平均繁殖率僅為48.61%,半數(shù)以上的牦牛兩年一胎或三年兩胎[1-2]。由于惡劣的生存環(huán)境和高發(fā)的衣原體病,導(dǎo)致牦牛自然流產(chǎn)率較高。2014年胡廣衛(wèi)等[3]的調(diào)查資料表明,在青海省玉樹縣、海晏縣等地區(qū)牦牛流產(chǎn)率高達(dá)30%以上。較低的繁殖率和較高的流產(chǎn)率是影響牦牛生產(chǎn)效益的重要因素。妊娠是一個(gè)極其復(fù)雜的過程,要經(jīng)歷受精卵形成、卵裂、胚泡附植、胚胎和胎盤的發(fā)育及妊娠維持等一系列連續(xù)的生物學(xué)過程[4],大量分子、細(xì)胞及信號(hào)通路參與到了妊娠過程的調(diào)節(jié)。妊娠期間,為了滿足胎兒生長(zhǎng)發(fā)育的需求,母體多個(gè)組織器官的新陳代謝活動(dòng)都發(fā)生了顯著的改變,血液中蛋白種類和濃度也發(fā)生了相應(yīng)的變化[5]。同樣,妊娠階段所發(fā)生的分子事件也會(huì)受到蛋白種類和表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。因此,血液蛋白質(zhì)組分析是在分子水平上探究妊娠調(diào)控機(jī)制的重要手段。

串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽技術(shù)(tandem mass tag, TMT)是通過多個(gè)穩(wěn)定同位素標(biāo)記,特異性標(biāo)記多肽的氨基酸基團(tuán)進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析,可用于研究不同組織樣品中蛋白質(zhì)表達(dá)水平的差異[6]。相比于其他定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),TMT技術(shù)在通量和同位素標(biāo)記數(shù)量上更具有優(yōu)勢(shì),并且其靈敏度和可重復(fù)性較高。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展及其在動(dòng)物體中的研究應(yīng)用,為動(dòng)物復(fù)雜的繁殖生理調(diào)控機(jī)制的研究提供了新的方法和思路,但目前關(guān)于妊娠階段牦牛血液蛋白質(zhì)表達(dá)變化的研究鮮有報(bào)道。本研究采用TMT技術(shù)檢測(cè)不同妊娠階段血清蛋白的表達(dá)差異情況,分析差異表達(dá)蛋白參與的信號(hào)通路和生物學(xué)過程,將為進(jìn)一步探明牦牛妊娠維持的分子機(jī)制,開發(fā)新的流產(chǎn)防治藥物和技術(shù)策略提供一些基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 血液樣品的采集與分組

在甘南藏族自治州夏河縣牙利吉鄉(xiāng)阿納扎西牦牛養(yǎng)殖合作社內(nèi)選擇9頭4歲半至6歲齡,健康狀況良好且當(dāng)年未產(chǎn)犢的自然發(fā)情牦牛進(jìn)行人工授精(artificial insemination, AI),并分別在AI后第30、60及90天,采用頸靜脈采血法采集其飼喂前的血液樣品5 mL·頭-1,室溫3 500 r·min-1離心10 min,獲取上清液收集在1.5 mL的滅菌離心管中,編號(hào),并置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。授配母牦牛在AI后第70和90天利用直腸觸診檢查結(jié)合B超探查進(jìn)行妊娠診斷,并依據(jù)診斷結(jié)果對(duì)采集樣品進(jìn)行回顧性分組,即妊娠第1月組(FP)、妊娠第2月組(SP)及妊娠第3月組(TP)。未妊娠組(NP)血樣采自AI后90天并經(jīng)妊娠診斷確診為未孕的牦牛個(gè)體。每組樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù),用于蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)。

1.2 血清蛋白的提取和定量

取200 μL血清樣品置于培養(yǎng)皿中,用PBS洗滌兩次,離心取沉淀后加入1 mL的預(yù)冷SDS裂解緩沖液(含10 μL蛋白酶抑制劑、10 μL PMSF),4 ℃玻璃勻漿器上下手動(dòng)勻漿20次。取勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5 mL預(yù)冷的離心管中,冰上放置10 min,4 ℃、16 000 r·min-1離心10 min,取上清液,即為血清總蛋白。使用ProteoMinerTM蛋白富集試劑盒(Bio-Rad)去除血清總蛋白中高豐度的蛋白質(zhì),然后使用BCA試劑盒對(duì)去除高豐度蛋白的血清蛋白樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)定量檢測(cè)。

1.3 蛋白酶解與TMT標(biāo)記

取200 μg蛋白溶液于離心管中,使用1.5 mmol·L-1二硫蘇糖醇(DTT)還原二硫鍵,37 ℃反應(yīng)1 h,冷卻至室溫后加入30 mmol·L-1碘乙酰胺(IAA)避光反應(yīng)30 min,然后移入超濾管中離心棄去收集液。在超濾管中用賴氨酸蛋白酶(Lys-C)按照酶和蛋白1∶200的比例預(yù)消化蛋白質(zhì)3 h,然后在37 ℃下用胰蛋白酶(Trypsin)按照酶和蛋白1∶100的比例過夜消化。消化后的多肽溶解在適當(dāng)體積的100 mmol·L-1HEPES(pH 8.0)中,按照TMT試劑盒說明書,使用12-plex TMT試劑進(jìn)行標(biāo)記。

1.4 高pH反相分級(jí)

將TMT標(biāo)記的多肽脫鹽干燥后,采用堿性高pH反相高壓液相色譜法進(jìn)行肽分級(jí)。TMT標(biāo)記的混合多肽在溶液A(5 mmol·L-1NH4OH, 20% ACN, pH=10.0)中溶解,經(jīng)C18色譜柱分級(jí)。分離梯度如表1所示。從5 min 到80 min每1 min收集洗脫物至1.5 mL離心管中,將收集的約60個(gè)組分的洗脫物合并為12個(gè)組分,真空干燥。

表1 高pH分離梯度表Table 1 High pH separation gradient table

1.5 LC-MS/MS 質(zhì)譜分析

將樣品溶于液相A液(100% H2O, 0.1% FA)中采用Nano LC系統(tǒng)進(jìn)行洗脫分離,選擇250 μL·min-1流速,并使用2%～100%液相B液(80% ACN, 0.1% FA)的線性梯度洗脫60 min分離樣品。分離后的樣品進(jìn)行質(zhì)譜定量分析,MS條件設(shè)置如下,OTMS1分辨率60 000,自動(dòng)增益控制目標(biāo)(AGC)為1e6,最大離子注入時(shí)間(Max IT)為50 ms;OTMS2分辨率30 000,AGC為5e4,Max IT為200 ms,動(dòng)態(tài)排除參數(shù)為6 s。

1.6 數(shù)據(jù)庫(kù)與數(shù)據(jù)分析

質(zhì)譜下機(jī)原始數(shù)據(jù)為RAW文件,借助Proteome Discovery 1.4軟件對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)GCF_000298355.1_BosGru_v2.0_protein.faa (28 881條蛋白序列)進(jìn)行搜索。具體搜庫(kù)參數(shù)如表2所示。

1.7 生物信息學(xué)分析

以差異倍數(shù)(fold change, FC)≥1.2或≤0.83,且P<0.05為條件對(duì)所獲得的蛋白質(zhì)篩選差異表達(dá)蛋白。并對(duì)所得的DEPs使用BLASTALL(v2.2.26, evalue設(shè)置為1e5)軟件進(jìn)行GO、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋,分析其生物學(xué)功能。利用STRING在線分析軟件(https://string-db.org)對(duì)差異蛋白進(jìn)行蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析。

表2 Proteome Discovery搜庫(kù)參數(shù)Table 2 Proteome Discovery search parameters

2 結(jié) 果

2.1 蛋白定量

不同組別的12份血清樣本(FP: 1-3, SP: 1-3, TP: 1-3, NP: 1-3)去除高豐度蛋白前后的定量結(jié)果如表3所示。結(jié)果顯示,本試驗(yàn)血清樣本總蛋白的提取及高豐度蛋白的去除成功,可以滿足后續(xù)TMT蛋白質(zhì)組學(xué)的試驗(yàn)要求。

表3 高豐度蛋白去除前后血清蛋白定量結(jié)果Table 3 Quantitative results of serum protein before and after high-abundance protein removal

2.2 蛋白質(zhì)鑒定

樣品經(jīng)過TMT標(biāo)記及LC-MS/MS鑒定分析后,以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate, FDR) ≤0.01的條件進(jìn)行過濾,共獲得3 933個(gè)肽段,共鑒定出497個(gè)蛋白質(zhì)。鑒定到的肽段長(zhǎng)度分布如圖1所示,所測(cè)肽段分布長(zhǎng)度主要集中在6～25個(gè)氨基酸之間,說明肽段酶解較為充分。將所鑒定的蛋白質(zhì)的分子量分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì),結(jié)果如圖2所示,分子量>100 ku的蛋白最多,其次是分子量在20～30 ku和50～60 ku的蛋白,分子量<10 ku的最少,且主要集中分布在10～60 ku。

圖1 肽段長(zhǎng)度分布圖Fig.1 Peptide length distribution chart

2.3 差異表達(dá)蛋白的篩選

以差異倍數(shù)FC≥1.2或≤0.83,且P<0.05為條件進(jìn)行篩選,共得到處于妊娠期不同階段及未妊娠期中的牦牛血清差異表達(dá)蛋白68個(gè),對(duì)各組間差異表達(dá)蛋白的分布繪制火山圖,如圖3所示。由圖可知,FP與SP組共有4個(gè)DEPs,其中上調(diào)4個(gè),下調(diào)0個(gè);FP與TP組共有34個(gè)DEPs,其中上調(diào)17個(gè),下調(diào)17個(gè);SP與TP組共有44個(gè)DEPs,其中上調(diào)17個(gè),下調(diào)27個(gè);TP與NP組共有18個(gè)DEPs,其中上調(diào)10個(gè),下調(diào)8個(gè)。各組間的部分DEPs信息如表4、5、6、7所示。

圖2 蛋白分子量分布圖Fig.2 Protein molecular weight distribution chart

A、 B、C、D分別表示FP vs. SP、FP vs. TP、SP vs. TP、TP vs. NP組差異蛋白火山圖 A, B, C, and D represent the differential protein volcano maps of FP vs. SP, FP vs. TP, SP vs. TP, and TP vs. NP groups, respectively圖3 牦牛血清差異蛋白火山圖Fig.3 Volcano plot of differential proteins in yak serum

表4 FP vs. SP組牦牛血清差異蛋白信息Table 4 The serum differential proteins information of yak in FP vs. SP group

表5 FP vs. TP組部分牦牛血清差異蛋白信息Table 5 The serum differential proteins information of yak in FP vs. TP group

表6 SP vs. TP組部分牦牛血清差異蛋白信息Table 6 The serum differential proteins information of yak in SP vs. TP group

2.4 DEPs的GO富集分析

利用BLAST軟件對(duì)GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索,將FPvs.SP、FPvs.TP、SPvs.TP、TPvs.NP四組對(duì)照組中的差異蛋白進(jìn)行功能注釋,并對(duì)各組差異表達(dá)蛋白和全部蛋白背景下GO各二級(jí)功能條目的蛋白富集情況進(jìn)行分析,如圖4所示。結(jié)果表明,各組差異蛋白的GO功能富集情況基本相似,在生物學(xué)過程中主要富集在生物調(diào)節(jié)、代謝、免疫系統(tǒng)、粘附及發(fā)育等過程;在細(xì)胞組分中主要富集在細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞器、蛋白復(fù)合體和膜封閉腔等;在分子功能中主要富集在結(jié)合、催化活性、分子功能調(diào)節(jié)、抗氧化活性和轉(zhuǎn)運(yùn)活性等方面。

表7 TP vs. NP部分牦牛血清差異蛋白信息Table 7 The serum differential proteins information of yak in TP vs. NP group

2.5 DEPs的KEGG富集分析

將各組間的KEGG富集分析結(jié)果以散點(diǎn)圖的形式可視化,如圖5所示。結(jié)果表明,差異表達(dá)蛋白在37個(gè)通路中被富集,圖中呈現(xiàn)了顯著性Q值最小的前20個(gè)通路,且富集因子越大,表示差異表達(dá)蛋白在該通路中的富集水平越顯著。結(jié)果發(fā)現(xiàn),FPvs.TP、SPvs.TP和TPvs.NP組的差異蛋白主要富集于補(bǔ)體與凝血級(jí)聯(lián)、細(xì)胞粘附分子和金黃色葡萄球菌感染等與炎癥和免疫防御相關(guān)的途徑中,FPvs.SP組主要富集在造血細(xì)胞譜系通路中。并且在妊娠期(FP、SP、TP)的各組間差異蛋白富集通路中均包含有PI3K-Akt、Rap1、MAPK等信號(hào)通路。

(圖4續(xù) Continued)

(圖4續(xù) Continued)

A、 B、C、D分別表示FP vs. SP、FP vs. TP、SP vs. TP、TP vs. NP組差異蛋白GO富集分析 A, B, C, and D represent GO enrichment analysis of differential proteins in FP vs. SP, FP vs. TP, SP vs. TP, TP vs. NP groups, respectively圖4 牦牛血清差異表達(dá)蛋白GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of differentially expressed proteins in yak serum

(圖5續(xù) Continued)

(圖5續(xù) Continued)

A、B、C、D分別表示FP vs. SP、FP vs. TP、SP vs. TP、TP vs. NP組差異蛋白KEGG通路富集分析 A, B, C, and D represent the KEGG pathway enrichment analysis of differential proteins in FP vs. SP, FP vs. TP, SP vs. TP, and TP vs. NP groups, respectively圖5 牦牛血清差異表達(dá)蛋白KEGG通路富集散點(diǎn)圖Fig.5 Scatter plot of KEGG pathway enrichment of differentially expressed proteins in yak serum

2.6 與妊娠維持潛在相關(guān)DEPs的篩選

對(duì)妊娠期和未妊娠期的差異蛋白進(jìn)行綜合分析,發(fā)現(xiàn)有5種蛋白:胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2(IGFBP2)、纖維蛋白原γ(FGG)、β-2微球蛋白(B2M)、蛋白二硫化物異構(gòu)酶A4(PDIA4)、鋅-α-2-糖蛋白1(AZGP1),如表8所示,它們?cè)谌焉锲?FP、SP和TP)具有連續(xù)的表達(dá)差異趨勢(shì),即在妊娠第3月(TP)表達(dá)量最高,妊娠第1、2月(FP和SP)表達(dá)量降低,并且這些蛋白在妊娠第3月(TP)相對(duì)于未妊娠(NP)狀態(tài)下調(diào),說明這些蛋白在妊娠第3月(TP)狀態(tài)下表達(dá)量顯著高于未妊娠狀態(tài)。因此這些蛋白可能參與妊娠維持過程,并發(fā)揮一定的生物學(xué)作用。

表8 重要DEPs篩選信息Table 8 The screening information for important DEPs

2.7 與妊娠維持潛在相關(guān)DEPs的網(wǎng)絡(luò)互作分析

利用STRING在線軟件(https://string-db.org)對(duì)所篩選的可能與妊娠維持相關(guān)的差異蛋白繪制網(wǎng)絡(luò)互作(PPI)分析圖,結(jié)果如圖6所示。圖中節(jié)點(diǎn)代表蛋白質(zhì),部分節(jié)點(diǎn)內(nèi)有螺旋結(jié)構(gòu),表示該蛋白結(jié)構(gòu)已知。部分節(jié)點(diǎn)內(nèi)是空的,則表示該蛋白結(jié)構(gòu)暫時(shí)未知。節(jié)點(diǎn)之間的連線表示蛋白之間的相互作用,連線越多表示蛋白間的相互作用關(guān)系越強(qiáng)。在PPI網(wǎng)絡(luò)圖中顯示,篩選出的差異蛋白多數(shù)存在互作關(guān)系,說明我們所鑒定篩選出的蛋白質(zhì)在牦牛妊娠期相互作用,進(jìn)而在維持妊娠中共同發(fā)揮作用。

圖6 與妊娠維持潛在相關(guān)DEPs的網(wǎng)絡(luò)互作分析Fig.6 Network interaction analysis of DEPs potentially related to pregnancy maintenance

3 討 論

哺乳動(dòng)物妊娠過程的建立和維持涉及到母體多器官和系統(tǒng)細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)等多方面的適應(yīng)性調(diào)節(jié)。蛋白質(zhì)是基因表達(dá)翻譯的最終產(chǎn)物,蛋白質(zhì)組學(xué)可以對(duì)某一時(shí)期機(jī)體處于特定生理狀態(tài)下的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行組學(xué)鑒定和研究,通過蛋白豐度的變化來(lái)揭示機(jī)體相關(guān)生物學(xué)過程和功能轉(zhuǎn)變的分子機(jī)制。本研究采用TMT聯(lián)合LC-MS/MS技術(shù)對(duì)處于妊娠第1、2、3月及未妊娠的牦牛血清樣品進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析,結(jié)果共檢測(cè)到3 933個(gè)肽段,定量出497個(gè)蛋白質(zhì),篩選出68個(gè)DEPs。

通過各組間差異表達(dá)蛋白的GO功能注釋,發(fā)現(xiàn)DEPs主要富集在生物過程中的代謝、免疫、粘附和生物調(diào)節(jié),細(xì)胞組分中的細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞器以及分子功能中的結(jié)合和催化活性。研究表明,妊娠會(huì)引起母體代謝的實(shí)質(zhì)性改變,妊娠的前3個(gè)月是合成代謝的狀態(tài),這一階段母體血液內(nèi)孕激素、雌激素和糖皮質(zhì)激素等類固醇激素含量升高有利于脂質(zhì)沉積[7-8]。妊娠早期的合成代謝階段至關(guān)重要,因?yàn)樘旱哪芰啃枨鬅o(wú)法僅通過增加能量攝入來(lái)滿足,更依賴于妊娠早期積累的脂肪儲(chǔ)存[9]。并且有研究表明,妊娠期間類固醇激素與滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖以及妊娠的健康發(fā)展密切相關(guān)[10],由此說明類固醇代謝與妊娠維持相關(guān),對(duì)支持胎兒的生長(zhǎng)和發(fā)育具有關(guān)鍵作用。研究表明,細(xì)胞粘附涉及胚胎細(xì)胞外基質(zhì)的構(gòu)建和胚胎與子宮內(nèi)膜的附著等生殖過程,并影響滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖和分化[11],因此細(xì)胞粘附過程對(duì)妊娠維持有重要意義。妊娠是一個(gè)動(dòng)態(tài)的免疫過程,胚胎所攜帶的遺傳物質(zhì)一半來(lái)自母體,另一半來(lái)自父體,當(dāng)胚胎進(jìn)入母體內(nèi)并且在子宮內(nèi)膜上種植時(shí)無(wú)異于異體植入,會(huì)刺激母體免疫系統(tǒng)。免疫系統(tǒng)通過激活補(bǔ)體C途徑和誘導(dǎo)內(nèi)肽酶對(duì)異物做出反應(yīng),使得母體處于炎癥增加的狀態(tài)[12-13]。同時(shí)為了保證胎兒不被母體免疫排斥,許多免疫相關(guān)分子會(huì)在母胎界面建立免疫耐受,并允許異基因胎兒在滋養(yǎng)層侵入母體組織,進(jìn)而允許胎兒和胎盤的發(fā)育[14-15],因此妊娠期母體免疫調(diào)節(jié)的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)于妊娠的建立和維持是至關(guān)重要的。

KEGG富集分析表明,妊娠期各組間的差異蛋白主要富集在補(bǔ)體與凝血級(jí)聯(lián)、金黃色葡萄球菌感染等與炎癥和免疫防御相關(guān)的通路以及PI3K-Akt、Rap1、MAPK等信號(hào)通路中。妊娠維持、胎盤和胎兒發(fā)育以細(xì)胞增殖、遷移、分化、轉(zhuǎn)化和凋亡等細(xì)胞過程為特征[16],且這些細(xì)胞過程依賴于信號(hào)通路的活動(dòng)。Rap1信號(hào)通路涉及多種細(xì)胞過程,包括細(xì)胞間的相互作用、細(xì)胞分子的粘附和增殖以及胎兒發(fā)育過程中細(xì)胞極性的調(diào)節(jié)[17]。此外,Rap1信號(hào)通路還參與維持上皮和內(nèi)皮細(xì)胞連接的完整性,從而維持胎兒的生存能力[18],因此推測(cè)Rap 1通路可能通過調(diào)節(jié)胎盤和胎兒發(fā)育進(jìn)而維持妊娠的健康發(fā)展。MAPK信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖、分化和轉(zhuǎn)化過程,同時(shí)它還參與了胎盤發(fā)育期間胚胎和卵黃囊的血管生成[19]。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)途徑經(jīng)常在各種細(xì)胞中被激活,并促進(jìn)多種細(xì)胞增殖、粘附、遷移、侵襲和血管生成[20-21]。因此推測(cè),MAPK和PI3K-Akt通路可能與妊娠過程中滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖和胎盤發(fā)育中的血管生成有關(guān)。金黃色葡萄球菌感染通路是一種與炎癥相關(guān)的通路,在人類和動(dòng)物中的研究表明,妊娠中胎盤涉及滋養(yǎng)細(xì)胞侵潤(rùn)和血管生成過程,它的成功依賴于一定程度的子宮炎癥[22-23],因此低程度的炎癥有益于正常胎盤的生長(zhǎng)發(fā)育。補(bǔ)體系統(tǒng)在先天免疫和適應(yīng)性免疫過程中起關(guān)鍵作用,其經(jīng)典通路可以被凋亡細(xì)胞激活,正常孕婦的滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡伴隨著缺血和氧化應(yīng)激的增加,進(jìn)而導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞碎片脫落進(jìn)入母體循環(huán)[24],這也解釋了為什么在牦牛正常妊娠中大量分子富集在補(bǔ)體及凝血級(jí)聯(lián)途徑中。本研究提示,DEPs可能通過細(xì)胞粘附、免疫調(diào)節(jié)和代謝等生物過程以及PI3K-Akt、Rap1、MAPK等信號(hào)通路,參與調(diào)節(jié)胎兒組織細(xì)胞的增殖和胎盤的生長(zhǎng)發(fā)育過程,進(jìn)而在牦牛妊娠維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用,并且當(dāng)這些生物過程和通路失調(diào)時(shí)可能會(huì)損害胎盤和胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育,甚至導(dǎo)致妊娠失敗。

通過比較發(fā)現(xiàn),IGFBP2、FGG、B2M、PDIA4和AZGP1 在牦牛妊娠期血清中具有連續(xù)上調(diào)的表達(dá)趨勢(shì),并且這些蛋白在妊娠第3月表達(dá)量顯著高于未妊娠狀態(tài)。因此推測(cè),這些蛋白在牦牛妊娠維持過程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。IGFBP2是一種發(fā)育調(diào)控因子,具有促進(jìn)細(xì)胞分化、刺激有絲分裂和防止凋亡等功能,能夠與IGF-2相互結(jié)合并調(diào)節(jié)IGF-2對(duì)胚胎生長(zhǎng)功能的促進(jìn)作用[25]。高飛[26]研究發(fā)現(xiàn),在人類中IGFBP2表達(dá)減少會(huì)抑制胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲及增殖,導(dǎo)致子宮肌層螺旋小動(dòng)脈重鑄障礙,進(jìn)而誘發(fā)早產(chǎn)甚至流產(chǎn)。本研究中,IGFBP2在妊娠期表達(dá)上調(diào),意味著其可能通過調(diào)控胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和增殖,參與胎盤植入和發(fā)育過程,進(jìn)而維持妊娠。FGG是纖維蛋白原三條肽鏈(α、β和γ)中的一條,作為纖維蛋白原的結(jié)構(gòu)域發(fā)揮功能[27]。正常妊娠時(shí),母體血液中促凝活性顯著增高,凝血效率增加,纖維蛋白原和凝血因子升高,母體纖維蛋白原通過維持止血平衡和穩(wěn)定胎兒-母體接合處的纖維蛋白層的子宮胎盤附著來(lái)支持妊娠[28]。Iwaki等[29]研究發(fā)現(xiàn),敲除FGG基因的小鼠因?yàn)樽訉m內(nèi)大量異常出血使得胎盤和卵黃囊嚴(yán)重受損破裂,導(dǎo)致胎兒死亡,妊娠不能維持至足月。因此,FGG可能通過維持胎盤止血平衡進(jìn)而在維持牦牛妊娠中發(fā)揮重要作用。B2M屬于I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的組成部分,參與抗原的加工與呈遞,在促進(jìn)免疫細(xì)胞的抗原呈遞和母體-胎兒界面的血管生成方面發(fā)揮重要作用[30]。在妊娠期間,充分的抗原呈遞可以促進(jìn)免疫應(yīng)答進(jìn)而誘導(dǎo)滋養(yǎng)層侵襲、組織重塑、胚胎發(fā)育和胎盤形成[31]。研究表明,人血清中B2M的含量隨著妊娠周期的增加而增加[32],這與本試驗(yàn)中鑒定出的血清B2M的變化趨勢(shì)相一致。PDIA4是蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶家族(PDIs)中的一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白,在維持氧化還原穩(wěn)態(tài)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)折疊等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[33]。正常妊娠中,隨著胎齡的增加,胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生一定程度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),輕度的應(yīng)激反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生抗氧化防御等一系列適應(yīng)性反應(yīng)[34]。因此推測(cè),PDIA4作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白,可能通過調(diào)節(jié)胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗氧化防御,進(jìn)而起到維持妊娠的作用。AZGP1是一種新型脂質(zhì)動(dòng)員因子,具有抗原的加工和呈遞功能,參與細(xì)胞粘附、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)代謝[35-36]。研究發(fā)現(xiàn),在小鼠體內(nèi)AZGP1可以促進(jìn)脂聯(lián)素表達(dá)升高,而脂聯(lián)素又被發(fā)現(xiàn)可以降低小鼠自然流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn),對(duì)維持正常妊娠有積極作用[37-38]。由此提示,AZGP1可能通過影響脂聯(lián)素的表達(dá)直接或間接調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝,從而參與牦牛的妊娠維持。

4 結(jié) 論

本研究利用TMT技術(shù)對(duì)不同妊娠階段和未妊娠的牦牛血清進(jìn)行分析,結(jié)果表明牦牛妊娠早期存在著明顯的血清蛋白組的變化。通過對(duì)這些DEPs進(jìn)行篩選與功能分析,發(fā)現(xiàn)它們分別富集在代謝、免疫、粘附及PI3K-Akt、Rap1、MAPK等與生殖相關(guān)的條目與通路中。這些DEPs在促進(jìn)細(xì)胞粘附與增殖、促進(jìn)母胎血管生成、維持母體代謝與免疫平衡等過程中起到重要作用,進(jìn)而維持母體在妊娠期各器官和系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡。其中IGFBP2、FGG、B2M、PDIA4、AZGP1的表達(dá)在妊娠早期具有連續(xù)上調(diào)的趨勢(shì),推測(cè)其可能通過調(diào)節(jié)胎盤生長(zhǎng)發(fā)育、免疫應(yīng)答和脂質(zhì)代謝,參與了牦牛的妊娠維持過程。本研究是利用蛋白質(zhì)組學(xué)探索在不同妊娠階段和未妊娠牦牛的差異蛋白的初步試驗(yàn),這些結(jié)果為進(jìn)一步探明牦牛維持妊娠過程的調(diào)控機(jī)制提供了基礎(chǔ)資料。