張德安,楊若渚,劉 杰,劉德武,2,3,鄧 銘,柳廣斌,2,3,孫寶麗,2,3,郭勇慶,2,3, 李耀坤,2,3*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院,廣州 510642;2.華南農(nóng)業(yè)大學畜禽育種國家地方聯(lián)合工程研究中心,廣州 510642;3.華南農(nóng)業(yè)大學廣東省農(nóng)業(yè)動物基因組學與分子育種重點實驗室,廣州 510642)

目前,我國集約化養(yǎng)殖規(guī)模越來越大,飼料原料不足導致我國畜牧業(yè)發(fā)展受阻,所以優(yōu)質(zhì)新型青綠飼料的發(fā)掘仍是目前畜牧業(yè)著力發(fā)展的方向[1]。黃梁木又稱團花,隸屬于茜草科(Rubiaceae)團花屬(Neolamarckia),常綠大喬木[2],主要分布于我國廣東、廣西和云南南部以及越南、緬甸等地[3],其生長迅速,木質(zhì)黃白色,通直圓滿,紋理均勻[4],在水肥管理良好的情況下,1.5年生幼黃梁木平均橫徑可達12 cm,是罕見的速生型用材樹種[5]。黃梁木一般用于制作木質(zhì)包裝箱、建筑材料、工業(yè)材料,也是優(yōu)良的園林綠化、蜜源、飼料和藥材樹種,同時,黃梁木也具有一定的藥物作用,黃粱木提取物中含有多種活性成分,包括生物堿、皂苷、類黃酮、烯萜、類固醇等,具有抗菌消炎、抗病毒[6-8]和抗氧化[9]的作用。在印度,黃粱木是廣泛用于治療眼部感染、皮膚病、口腔炎、咳嗽、發(fā)燒、血液病和胃痛等病癥的一種藥物[9-10]。目前,利用黃粱木作為藥物治療和材料的用途較多,但是使用黃粱木作為飼料原料的應用較少,且有研究表明,青貯黃梁木pH較低,粗蛋白質(zhì)含量較高,是良好的青貯飼料[3]。

本試驗選擇著名地方品種川中黑山羊作為試驗動物,研究青貯黃梁木在川中黑山羊中的飼用效果。川中黑山羊主要分布于四川省金堂縣、樂至縣,是以產(chǎn)肉為主的山羊地方品種,具有生長發(fā)育快、體格高大、繁殖性能突出、產(chǎn)肉性能優(yōu)良、遺傳性能穩(wěn)定等特點,是國內(nèi)目前繁殖性能和產(chǎn)肉性能最好的山羊品種之一[11]。肝是脊椎動物身體內(nèi)以代謝功能為主的一個器官,與動物機體生長有著密切聯(lián)系,在體內(nèi)糖代謝、脂類代謝、蛋白質(zhì)代謝、維生素代謝、激素代謝等方面發(fā)揮重要作用[12];也是許多生理過程的關鍵樞紐,這些生理過程包括血量調(diào)節(jié)、免疫系統(tǒng)支持、生長信號通路的內(nèi)分泌控制、脂質(zhì)和膽固醇穩(wěn)態(tài)以及許多現(xiàn)有藥物在內(nèi)的異種化合物的分解[13]。

目前國內(nèi)對黃粱木的研究主要集中在禽類和羊的飼養(yǎng)試驗上。有研究表明,飼糧添加5%黃梁木葉對麻黃雞具有降血糖和降血脂的作用,同時在一定程度上能夠促進小腸的形態(tài)發(fā)育[14]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),青貯黃粱木替代50%的青貯玉米能有效提高樂至黑山羊的生長性能、屠宰性能和羊肉品質(zhì),飼喂青貯黃粱木組平均日采食量隨替代量的增加極顯著提高,平均日增重也隨替代比例的增加而增加, 但不同比例替代組間無顯著差異;50%青貯黃梁木替代組顯著降低了樂至黑山羊羊肉的失水率與料肉比,極顯著降低了羊肉中苯丙氨酸的含量;顯著提高了育肥期樂至黑山羊的肩寬、眼肌面積,顯著提高了羊肉中蘇氨酸和賴氨酸的含量[15]。本課題組前期采用青貯黃梁木替代青貯玉米,分析了川中黑山羊肝組織代謝譜,篩選得到8種差異代謝產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)相關的如脂肪酸生物合成、甘油脂代謝和脂肪酸代謝等的9個代謝項和8條代謝途徑,推測青貯黃梁木通過調(diào)控脂肪代謝的相關通路來發(fā)揮生物學功能[16]。

轉(zhuǎn)錄組是樣本的全部基因表達的轉(zhuǎn)錄本信息[17],隨著轉(zhuǎn)錄組測序技術的發(fā)展,許多基因組上雖然編碼蛋白質(zhì)的序列只占1%左右,但基因組中70%以上的區(qū)域都可以在特定條件下轉(zhuǎn)錄成RNA,這些不能編碼蛋白質(zhì)的RNA統(tǒng)稱為非編碼RNA,包括長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)等[17]。本研究在前期飼養(yǎng)試驗的基礎上,將試驗組與對照組的肝轉(zhuǎn)錄組測序結果進行比較,挖掘飼喂青貯黃梁木影響川中黑山羊肝代謝的關鍵候選基因,可以研究出飼喂青貯黃粱木對肝功能的影響,從而探究飼喂青貯黃粱木代替青貯玉米影響川中黑山羊的生長性能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物分組與基礎日糧測定

試驗分為三組分別為對照組、青貯黃粱木替代25%青貯玉米組與青貯黃粱木替代50%青貯玉米組,本試驗篩選差異表達顯著的青貯黃粱木替代50%青貯玉米組與對照組進行以下分析。該兩組各隨機選擇體重為(21.07±4.05)kg的5月齡健康的樂至型川中黑山羊公羊3只,分別命名為SACRL試驗組和SCL對照組,SACRL試驗組為青貯黃粱木替代50%青貯玉米組;SCL對照組為青貯玉米組。10 d預飼期,40 d正式試驗期,根據(jù)NRC(1981)和中國羊飼養(yǎng)標準(2004)配制川中黑山羊的基礎日糧。飼養(yǎng)于高床漏縫式木地板的半開放式羊舍,自由采食飲水、充足光照、定期消毒通風、打掃欄舍。試驗基礎日糧組成和營養(yǎng)水平測定值見表1。

表1 試驗川中黑山羊各組日糧組成及營養(yǎng)水平測定值(風干基礎)Table 1 Determination of dietary composition and nutrient levels of each group of Chuanzhong Black Goat in the experiment (air dried basis) %

1.2 試驗材料

黃梁木新鮮枝葉采集自華南農(nóng)業(yè)大學增城林業(yè)基地,當植株高于3 m時刈割,留茬70 cm,去除木質(zhì)化較高枝干,保留嫩枝和樹葉,粉碎至每段1 cm左右,通過拉伸膜裹包青貯技術制作成(30.00±5.00)kg青貯包,常溫下室內(nèi)避光青貯60 d。青貯黃梁木和青貯全株玉米營養(yǎng)水平測定值見表2。

表2 青貯黃梁木和青貯全株玉米營養(yǎng)水平測定值(風干基礎)Table 2 Determination of nutrient levels of silage Neolamarckia Cadamba and silage whole plant maize (air-dried basis) %

1.3 樣品采集

根據(jù)GB/T 19477—2018所述的畜禽屠宰操作規(guī)程進行屠宰后,迅速采集肝組織樣品于凍存管中,而后立刻放置于液氮冷凍,樣品于-80 ℃冰箱內(nèi)長期保存。

1.4 總RNA提取和建庫

使用TRIzol(Thermo Fisher,上海,中國)提取組織樣品中的總RNA,而后使用Agilent 2100生物分析儀和RNA 6000 Nano LabChip Kit(Agilent, Santa Clara, USA)測定RNA總量及完整性。在構建RNA測序文庫前,使用Epicentre Ribo-ZeroTM(Epicentre,美國)試劑盒去除rRNA,而后將產(chǎn)物進行逆轉(zhuǎn)錄以獲得cDNA文庫,該文庫用于mRNA及l(fā)ncRNA的測序。選擇符合建庫標準的 RNA 并送至北京諾禾致源科技股份有限公司測序,委托該公司對測序結果進行分析。每個樣品分別取1 μg總 RNA 作為文庫構建,根據(jù) NEB Next Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina(NEB,Ispawich,USA)的操作步驟,將不同的 index 進行分別標簽建庫。

1.5 數(shù)據(jù)質(zhì)控與組裝

測序得到的原始測序序列,里面含有帶接頭的、低質(zhì)量的reads,為了保證信息分析質(zhì)量,必須對raw reads進行過濾,得到clean reads,后續(xù)分析都基于clean reads。數(shù)據(jù)處理的步驟如下:1)去除帶接頭(adapter)的reads;2)去除N(N表示無法確定堿基信息)的比例大于10%的reads;3)去除低質(zhì)量reads(質(zhì)量值sQ≤5 的堿基數(shù)占整個 read 的 50%以上的 reads)。

1.6 lncRNA的篩選

在進行篩選之前,首先使用 Cuffmerge 軟件,對各樣品拼接得到的轉(zhuǎn)錄本進行合并,并去掉其中鏈方向不確定的轉(zhuǎn)錄本,得到本次測序完整的轉(zhuǎn)錄組信息。篩選過程分以下5個步驟:1)轉(zhuǎn)錄本exon個數(shù)篩選:過濾轉(zhuǎn)錄組拼接結果中大量低表達量、低可信度的單外顯子轉(zhuǎn)錄本,選擇exon個數(shù)≥ 2的轉(zhuǎn)錄本;2)轉(zhuǎn)錄本長度篩選:選擇轉(zhuǎn)錄本長度>200 bp的轉(zhuǎn)錄本;3)轉(zhuǎn)錄本已知注釋篩選:通過 Cuffcompare 軟件,篩除與數(shù)據(jù)庫注釋 exon 區(qū)域有重疊的轉(zhuǎn)錄本,并將數(shù)據(jù)庫中,與本次拼接轉(zhuǎn)錄本 exon 區(qū)域有重疊的 lncRNA 作為數(shù)據(jù)庫注釋 lncRNA納入到后續(xù)分析;4)轉(zhuǎn)錄本表達量篩選:通過Cuffquant計算每個轉(zhuǎn)錄本的表達量,選擇 FPKM ≥ 0.5的轉(zhuǎn)錄本;5)編碼潛能篩選:使用CNCI、CPC、Pfam Scan和PhyloCSF對轉(zhuǎn)錄本進行編碼潛能性分析。

1.7 mRNA和lncRNA差異表達分析

采用 DESeq2對川中黑山羊肝組織的lncRNA和mRNA進行差異表達分析,篩選差異表達基因條件為:顯著性P<0.05。

1.8 lncRNA靶基因預測

位置相關性靶基因分析,根據(jù)lncRNA與mRNA的位置關系進行順式調(diào)控靶基因預測,篩選的范圍為100 K以內(nèi)。

1.9 GO和KEGG功能富集分析

本研究所有富集分析均采用以下方法進行。使用top GO進行基因本體論(Gene Ontology,GO)富集分析,通過超幾何分布方法計算顯著富集的GO term(顯著富集的標準為P<0.05)。使用cluster Profiler軟件進行京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,重點關注P<0.05的通路。

1.10 RT-qPCR 驗證分析

從差異表達lncRNA和mRNA中各隨機選擇3個基因,使用RT-qPCR進行轉(zhuǎn)錄組表達譜驗證分析。反應體系20 μL:10 μL SYBR? Green Master Mix,上下游引物各0.5 μL,1 μL cDNA 和8 μL ddH2O。95 ℃預變性10 min;95 ℃變性5 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸1 min,共40個循環(huán)。引物設計參考NCBI 的山羊(Carpahircus)相關基因序列,β-actin作為lncRNA和mRNA的內(nèi)參基因,使用Primer 5.0軟件設計,并送生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物(表3)。

表3 引物序列Table 3 Primer sequences

2 結 果

2.1 測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量及比對信息

本試驗測序共獲得566 416 000個reads,去除接頭以及低質(zhì)量reads后,獲得547 779 978個高質(zhì)量有效reads。有效reads占原始序列reads的87.20%±0.49%。測序的質(zhì)量分值(Q30)均在90%以上。各個樣本測序概況如表4所示。

表4 試驗組與對照組肝組織RNA測序概況Table 4 Overview of liver RNA sequencing in the test and control groups

2.2 mRNA表達分析

圖1展示的結果為試驗組與對照組肝組織樣品中mRNA表達的概況。測序并分析發(fā)現(xiàn)有43 779個mRNA可以比對到參考基因組并被注釋。使用DEseq軟件進行差異表達分析,共有1 696個mRNA在試驗組與對照組肝組織樣品中的mRNA存在顯著差異。以飼喂青貯玉米的對照組的mRNA為對照,943個mRNA表達上調(diào),753個mRNA表達下調(diào),分別占總差異表達mRNA的55.6%和44.4%。

A.差異表達mRNA火山圖,橫坐標代表差異mRNA在不同樣本中表達倍數(shù)變化,縱坐標代表mRNA變化差異的統(tǒng)計學顯著性,紅色點表示有顯著性差異表達的上調(diào)mRNA,藍色點表示有顯著性差異表達的下調(diào)mRNA;B.差異顯著的上、下調(diào)mRNA所占總差異表達mRNA的比例;C.差異表達mRNA表達量層次聚類圖,紅色表示mRNA表達上調(diào),藍色表示mRNA表達下調(diào) A. Volcanic map of differentially expressed mRNA, with the horizontal axis representing the changes in expression multiples of differential mRNA in different samples, the vertical axis representing the statistical significance of mRNA changes, the red dot representing upregulated mRNA with significant differential expression, and the blue dot representing downregulated mRNA with significant differential expression; B. Proportion of significantly different up-regulated and down-regulated mRNA to the total differentially expressed mRNA; C.Hierarchical clustering diagram of differentially expressed mRNA expression levels, with red indicating upregulation of mRNA expression and blue indicating downregulation of mRNA expression圖1 試驗組與對照組肝組織差異表達mRNA概況Fig.1 Profile of differentially expressed mRNA in liver tissues of the test and control groups

2.3 lncRNA表達分析

試驗組與對照組肝組織樣品所測得的lncRNA共有8 903個,使用Deseq軟件進行差異表達分析,共獲得33個差異表達lncRNA(Differential Expressed lncRNA, DE lncRNA)。如圖2所示,以飼喂青貯玉米的對照組肝組織的lncRNA作為對照,上調(diào)表達的lncRNA共22個,占總DE lncRNA的66.7%;下調(diào)表達的lncRNA共11個,占總DE lncRNA的33.3%。

A.差異表達lncRNA的火山圖,橫坐標代表差異lncRNA在不同樣本中表達倍數(shù)變化,縱坐標代表lncRNA變化差異的統(tǒng)計學顯著性,紅色點表示有顯著性差異表達的上調(diào)lncRNA,藍色點表示有顯著性差異表達的下調(diào)lncRNA;B.上、下調(diào)lncRNA所占總差異表達lncRNA的比例;C.差異表達lncRNA表達量層次聚類圖,紅色表示lncRNA表達上調(diào),藍色表示lncRNA表達下調(diào) A.Volcanic map of differentially expressed lncRNA. The horizontal axis represents the change in expression multiples of differential lncRNA in different samples, the vertical axis represents the statistical significance of the difference in lncRNA changes, the red dot represents upregulated lncRNA with significant differential expression, and the blue dot represents downregulated lncRNA with significant differential expression; B. Proportion of up-regulated and down-regulated lncRNAs in the total differentially expressed lncRNAs; C. Hierarchical clustering diagram of differential lncRNA expression levels, with red indicating upregulation of lncRNA expression and blue indicating downregulation of lncRNA expression圖2 試驗組與對照組肝組織差異表達lncRNA概況Fig.2 Profile of differentially expressed lncRNA in liver tissues of the test and control groups

2.4 mRNA的功能聚類分析

為進一步了解差異表達的mRNA對川中黑山羊肝功能的調(diào)節(jié)作用,對顯著差異表達的1 696個mRNA進行GO功能注釋和KEGG信號通路富集分析。對所有顯著差異表達mRNA進行GO功能注釋,發(fā)現(xiàn)這些差異表達的mRNA被注釋到2 631個GO term中。對這些GO term進行顯著性分析,發(fā)現(xiàn)有33個GO term能被顯著富集(P<0.05),其中包括4個生物過程(Biological process,BP)、18個細胞組成(Cellular component,CC)、11個分子功能(molecular function,MF)。圖3A列出了試驗組和對照組顯著富集到的33個GO term,根據(jù)GO富集結果進行篩選,選擇與肝功能相關的GO term,涉及生物過程的主要的有代謝過程(metabolic process)等;涉及細胞組成的主要有細胞(cell)、細胞組分(cell part)和細胞內(nèi)(intracellular)等;涉及分子功能的主要有催化活性(catalytic activity)等?；贙EGG數(shù)據(jù)庫的通路富集分析,對顯著差異的mRNA進行富集得到20個通路,圖3B列出了試驗組和對照組顯著差異的20個富集通路(P<0.05),主要富集的與肝功能相關的通路有代謝途徑(metabolic pathways)等。

圖3 差異表達mRNA的GO功能注釋(A)與KEGG信號通路富集分析(B)Fig.3 GO functional annotation(A) and enrichment analysis of KEGG signaling pathway(B) of differentially expressed mRNA

2.5 差異表達lncRNA靶基因預測及功能分析

為進一步了解差異表達的lncRNA對川中黑山羊肝功能的調(diào)節(jié)作用,搜尋已測得lncRNA 基因上、下游100 kb以內(nèi)的蛋白編碼的基因,預測到33個差異表達的lncRNA,對顯著差異表達的33個lncRNA靶基因進行了GO功能注釋和KEGG功能聚類分析。對所有顯著差異表達lncRNA進行GO功能注釋發(fā)現(xiàn),這些差異表達的lncRNA靶基因被注釋到858個GO term中。對這些GO term進行顯著性分析,發(fā)現(xiàn)有95個GO term能被顯著富集(P<0.05),差異表達lncRNA靶基因的前30個GO term主要包括14個生物過程、6個細胞組成、1個分子功能。圖4A根據(jù)P值列出了試驗組和對照組差異顯著lncRNA的前30個GO term。根據(jù)GO富集結果進行篩選,選擇與肝功能相關的GO term,涉及生物過程的主要的有鉀離子遷移(potassium ion transport)和抗原處理和傳遞(antigen processing and presentation)等;涉及細胞組成的主要有核泛素連接酶復合物(nuclear ubiquitin ligase complex)、后期促進復合物(anaphase-promoting complex)和cullin RING泛素連接酶復合物(anaphase-promoting complex)等;涉及分子功能的主要有小分子結合(small molecule binding)、核苷酸結合(nucleotide binding)和核苷磷酸鹽結合(nucleoside phosphate binding)等。對所有顯著差異表達lncRNA進行KEGG信號通路富集分析,基于KEGG數(shù)據(jù)庫的通路富集分析,對顯著差異的lncRNA進行富集得到20個通路,圖4B列出了試驗組和對照組顯著差異的20個富集通路(P<0.05),主要富集的通路有藥物代謝-細胞色素P450(Drug metabolism-cytochromeP450)及細胞色素P450對異源物質(zhì)的代謝(Metabolism of xenobiotics by cytochromeP450)等。

圖4 差異表達lncRNA的GO功能注釋(A)與KEGG信號通路富集分析(B)Fig.4 GO functional annotation(A) and enrichment analysis of KEGG signaling pathway(B) of differentially expressed lncRNA

2.6 差異表達的lncRNA順式調(diào)控靶基因與差異表達mRNA的交集基因分析

對預測到的差異表達lncRNA順式調(diào)控的靶基因與差異表達mRNA取交集,用于分析可能存在于川中黑山羊肝組織mRNA中,且受到lncRNA的順式調(diào)控作用的基因,在試驗組vs. 對照組中,差異表達lncRNA 順式調(diào)控靶向了175個mRNA,其中有24個差異表達mRNA,所篩選的mRNA與lncRNA的作用關系如圖5所示。其中交集的差異表達基因有NDUFA10、NDUFS5、ICK、SRRM2、TCEB2、LOC102172184、ZNFX1等。

橙色代表lncRNA,藍色代表mRNA,三角代表上調(diào),下箭頭代表下調(diào) Orange represents lncRNA, blue represents mRNA, triangle represents up-regulation while down-arrow represents down-regulation圖5 差異表達lncRNA順式調(diào)控靶基因與差異表達mRNA作用關系圖Fig.5 Relationship between differentially expressed lncRNA cis regulatory target genes and differentially expressed mRNA interactions

2.7 測序結果RT-qPCR驗證

通過熒光定量對隨機挑選的6個差異表達mRNA和lncRNA進行驗證。結果表明,隨機挑選的6個mRNA和lncRNA的熒光定量結果與轉(zhuǎn)錄組測序結果的表達趨勢相符(圖6),證實川中黑山羊肝組織轉(zhuǎn)錄組測序結果具有可靠性,可用于后續(xù)研究。

3 討 論

圖6 差異表達基因 RT-qPCR驗證Fig.6 RT-qPCR validation of differentially expressed genes

lncRNA是一種大于200個核苷酸的長鏈RNA,一直以來被看作是無用的剪切產(chǎn)物,但隨著高通量技術的進步,lncRNA的多種功能已經(jīng)在被逐步挖掘,可以直接通過與DNA、RNA或蛋白質(zhì)結合進行順式或反式調(diào)控[18-19]。在試驗組與對照組兩組間發(fā)現(xiàn)了一些差異表達的基因和顯著富集的通路與肝功能有關,在對差異表達lncRNA靶基因的功能富集結果與差異表達mRNA功能富集結果取交集對比后發(fā)現(xiàn),其中大多差異基因的功能都是代謝過程,包括細胞多糖代謝過程、葡聚糖分解代謝過程、纖維素分解代謝過程等;在針對差異lncRNA靶基因的KEGG信號通路富集分析中,發(fā)現(xiàn)較為顯著富集的差異表達通路,如藥物代謝-細胞色素P450及細胞色素P450對異源物質(zhì)的代謝等。

本研究根據(jù)差異表達mRNA與lncRNA靶基因交集基因功能注釋并結合mRNA的功能聚類分析發(fā)現(xiàn),關于編碼泛醌氧化還原酶亞基的基因如NDUFA10、NDUFB11、NDUFS5等表達顯著差異,并且試驗組的表達顯著高于對照組。NDUF家族蛋白具有調(diào)節(jié)線粒體呼吸鏈功能和線粒體內(nèi)蛋白質(zhì)合成的生物學功能[20]。此類基因表達主要參與了肝組織細胞中的多糖代謝過程、葡聚糖分解代謝過程、纖維素分解代謝過程等生物過程。在人類醫(yī)療領域中,缺少NDUF家族蛋白可引起心肌炎、心肌梗死[21]、惡性腫瘤轉(zhuǎn)移[22]、視神經(jīng)病變[23]等問題。Hoefs等[24]研究發(fā)現(xiàn),NDUFA10的突變會致使細胞線粒體復合物I缺陷,進而打破氧化磷酸化系統(tǒng)的平衡。線粒體復合體I在線粒體內(nèi)膜中作為一個疏水性的“臂”,親水性臂延伸到線粒體基質(zhì)或細胞質(zhì)中。復合物I的14個核心亞基包括所有NDUF家族等催化所有復合物I編碼,它們包括對2個結構域作出響應的兩組7個亞基,分別為7個疏水亞基和7個親水亞基。7個核編碼的親水亞基連接黃素單核苷酸和8個鐵硫簇,分別催化NADH氧化和轉(zhuǎn)移黃素上的電子到醌[25]。NAD+是一種二核苷酸輔因子,具有在各種細胞氧化還原反應中接受電子的潛力。還原后的NADH是一種無處不在的細胞電子供體。NAD+、NADH和NAD+/NADH比值可以控制幾種氧化還原酶的活性[26]。在這種電子轉(zhuǎn)移過程中釋放的能量被用來在線粒體內(nèi)膜上轉(zhuǎn)移質(zhì)子,產(chǎn)生質(zhì)子梯度,可用于合成ATP[27]。Panelli等[28]研究發(fā)現(xiàn),NDUFB11轉(zhuǎn)錄后調(diào)控可能參與細胞凋亡過程,且對復合物I的功能有影響。Rea等[29]研究發(fā)現(xiàn),NDUFB11在發(fā)育中的斑馬魚胚胎中被敲低會導致心組織結構異常,證明了NDUFB11在心組織病理學中的病理作用。李博[30]研究發(fā)現(xiàn),咳平鹽酸鹽通過抑制線粒體氧化磷酸化途徑中的復合物亞基NDUFS5蛋白,抑制了氧化磷酸化的發(fā)生,從體內(nèi)和體外抑制了食管鱗狀細胞癌的增殖。因此猜測,飼喂青貯黃粱木會影響川中黑山羊肝組織中的NDUFA10、NDUFB11、NDUFS5等基因的表達,催化細胞線粒體復合物I的編碼,提高細胞ATP水平,從而影響肝的各種代謝過程。

根據(jù)差異表達lncRNA靶基因的KEGG信號通路富集分析結果可發(fā)現(xiàn),細胞色素P450的代謝通路在飼喂黃粱木的試驗組中富集。細胞體具有多種解毒酶,能夠清除數(shù)千種自然產(chǎn)生的毒素和外來化學物質(zhì)[31],這些有毒化合物的代謝過程一般分為I相和II相反應。大多數(shù)I期酶既能解毒又能激活代謝,細胞色素P450酶占所有I期酶的70%～80%[32]。細胞色素P450酶是一個很大且可自身氧化的亞鐵血紅素蛋白家族,主要在肝細胞中表達,又稱混合功能氧化酶和單加氧酶[33-34],也是代謝內(nèi)源性化合物即膽汁酸和外源物質(zhì)的酶,這些外源物質(zhì)包括藥物、致癌物、毒素、天然物質(zhì)和化學產(chǎn)物,同時參與維持脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)調(diào)控,主要調(diào)控膽固醇、維生素D、氧化甾醇和膽汁酸代謝等[35]。本研究中關于細胞色素P450的代謝信號通路中所包含的有11個差異表達基因,包括了GST家族與其他編碼谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶及有關蛋白的基因,其中GSTA3、GSTA4的表達明顯上調(diào)。在肝中活性和含量占優(yōu)勢的是GST的A類,主要功能是編碼谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶。谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶是Ⅱ相藥物代謝酶,在解毒和細胞保護方面起著關鍵作用[36],能通過抑制微粒體過氧化反應、修復自由基引起的膜磷脂損傷等途徑發(fā)揮抗氧化作用。GSTA家族由5個不同的成員組成,包括GSTA1、GSTA2、GSTA3、GSTA4和GSTA5[31,37],GSTA1和GSTA2對過氧化物、脂肪酸和氫過氧化物具有抗氧化活性;GSTA3在人類疾病上的研究較多,杜偉一等[38]研究發(fā)現(xiàn),GSTA3具有與抑癌因子一樣的作用,在人類鼻咽癌復發(fā)、轉(zhuǎn)移中起到保護作用,在畜牧領域中,楊世雄等[39]研究發(fā)現(xiàn),重組外源GSTA3蛋白對TD肉雞有促生長作用;GSTA4在4-羥基壬烯醛(4-HNE)與GSH10、GSH11偶聯(lián)作用具有高催化效率,4-HNE是脂質(zhì)過氧化的細胞毒性最終產(chǎn)物,可共價修飾蛋白質(zhì)和DNA,并導致神經(jīng)退行性疾病、衰老和癌癥[40],可得GSTA4具有解毒作用。由于GST類作為細胞信號激酶途徑的介質(zhì)參與了細胞周期轉(zhuǎn)換,如增殖和凋亡,Romero等[41]研究發(fā)現(xiàn),在Caco-2細胞內(nèi),GSTA的表達增加會影響細胞對外界應激的抵抗能力,因此猜想,飼喂青貯黃粱木會影響川中黑山羊肝細胞轉(zhuǎn)錄組中GSTA3、GSTA4基因表達,加大谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶的表達量,促進了脂質(zhì)穩(wěn)態(tài),影響了肝細胞對外界應激的抵抗能力。

4 結 論

本研究對青貯黃粱木代替青貯玉米的川中黑山羊和對照組的肝組織進行高通量測序,發(fā)現(xiàn)差異表達的mRNA共有1 696個,其中943個上調(diào),753個下調(diào);差異表達lncRNA共有33個,其中22個上調(diào),11個下調(diào)。對差異表達基因進行GO功能注釋和KEGG信號通路富集分析發(fā)現(xiàn),差異表達的NDUFA10、NDUFB11、NDUFS5等基因顯著上調(diào),它們可通過多糖代謝過程、葡聚糖分解代謝過程、纖維素分解代謝過程等代謝通路影響肝功能,催化細胞線粒體復合物I的編碼,提高細胞ATP水平,從而影響肝的各種代謝過程;差異表達的GSTA3、GSTA4基因顯著上調(diào),影響藥物代謝-細胞色素P450及細胞色素P450對異源物質(zhì)的代謝等代謝通路,加大谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶的表達量,促進了脂質(zhì)穩(wěn)態(tài),影響了肝細胞對外界應激的抵抗能力。綜上推測,飼喂青貯黃粱木可以通過影響川中黑山羊肝的代謝過程及細胞解毒能力來發(fā)揮生物功能。