陳姝宇,朱雪蛟,周金柱,陶 然,張雪寒,索朗斯珠,貢 嘎*,李 彬*

(1.西藏農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,林芝 860000;2.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)院 獸醫(yī)研究所,南京 210000; 3.獸用生物制品(泰州)國(guó)泰技術(shù)創(chuàng)新中心,泰州 225300)

輪狀病毒(rotavirus,RV)近年來(lái)嚴(yán)重危害全球健康,是一種人畜共患病原體。輪狀病毒為呼腸孤病毒科、輪狀病毒屬,是一種分節(jié)段的雙鏈核糖核苷酸(dsRNA)病毒,其結(jié)構(gòu)呈二十面對(duì)稱體,無(wú)囊膜,三層衣殼結(jié)構(gòu)包裹11段dsRNA,分為結(jié)構(gòu)蛋白(VP1～VP4、VP6～VP7)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1～NSP5)。輪狀病毒分為10個(gè)群(A～J),其中A、B、C及H群在世界各地流行并感染人和多種動(dòng)物。其中I群來(lái)源于犬,J群來(lái)源于蝙蝠[1]。目前,人類輪狀病毒A群(rotavirus-A,RVA)有較完整數(shù)據(jù),但對(duì)豬輪狀病毒(porcine rotavirus,PoRV)的了解有限。PoRV A群造成的危害最為嚴(yán)重,也是我國(guó)主要高發(fā)病原體[2]。G9型RVAs是G型中最常見(jiàn)的,被認(rèn)為是豬和人類的新興病原體,豬源G9型的所有基因組片段與人類RVAs的基因組片段相似度高,所以豬被認(rèn)為是人類G9型RVAs的潛在宿主庫(kù)[3]。豬輪狀病毒A群是引起幼齡仔豬發(fā)生急性胃腸炎的主要病原之一,主要侵害小腸上皮細(xì)胞[4],多以糞口途徑傳播,其中小于10～20日齡的仔豬感染后死亡率極高,且該病原經(jīng)常與其他病原混合感染。雖然有多種檢測(cè)輪狀病毒的方式,比如ELISA、PCR等[5-6],但目前尚無(wú)治療輪狀病毒的有效藥物,接種疫苗仍是預(yù)防輪狀病毒性胃腸炎暴發(fā)的重要措施。

鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白1(guanylate-binding protein-1,GBP1)、鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白2(guanylate binding protein-2,GBP2)屬于鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白家族(GBPs),是干擾素(interferon,IFN)誘導(dǎo)的 GTPases 超家族(65～72 ku)成員,GBP1、GBP2能夠被干擾素誘導(dǎo)表達(dá)。GBPs家族具有GTPase酶活性結(jié)構(gòu)域,有多篇文獻(xiàn)報(bào)道其活性與抗病毒作用相關(guān)[7-8],主要作用為抵抗原生動(dòng)物感染[9-11]、抑制細(xì)菌增殖、抗病毒復(fù)制、抗腫瘤作用以及促進(jìn)炎癥反應(yīng)形成,在抗病原微生物反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。已有多項(xiàng)研究表明,GBP1對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)[12]、豬偽狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)[13-14]、口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)[15]、腦淋巴結(jié)心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus, EMCV)和水皰型口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV)[16]等多種病毒均有抗病毒作用。然而,GBP1、GBP2 在 PoRV 感染過(guò)程中的作用目前還未見(jiàn)研究報(bào)道,基于此,探索GBP1、GBP2蛋白的未知功能及對(duì)PoRV復(fù)制的影響,深層次理解PoRV復(fù)制的分子機(jī)制,為候選抗病基因提供重要的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒、細(xì)胞和質(zhì)粒

PoRV A群G9P[7]型毒株NJ2012,包含11段dsRNA(NCBI序列號(hào)MT874983～MT874993)[17]、恒河猴細(xì)胞MA104細(xì)胞和pCDNA3.1(+)真核表達(dá)質(zhì)粒,均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存。

1.2 試劑

GAPDH小鼠單克隆抗體、GBP1鼠多克隆抗體、GBP2兔多克隆抗體購(gòu)自Proteintech公司;胎牛血清(四季青FBS)、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司;2Phanta Master Mix高保真酶/2Phanta Max Master Mix(Dye Plus)、HiScript?II Q RT SuperMix for qPCR/5 HiScript?II Q RT SuperMix for qPCR逆轉(zhuǎn)錄酶、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、2×AceQ qPCR Probe Master Mixa、50×ROX Reference Dye 2b購(gòu)自Vazyme公司;NSP5熒光定量PCR引物及探針購(gòu)自生工公司;轉(zhuǎn)染試劑Lipo3000、T4 DNA Ligase(40000 EU)連接酶、KpnⅠ、BamHⅠ、ApaⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Thermo Fisher公司;RIPA蛋白裂解液和胰酶購(gòu)自碧云天公司;大腸桿菌感受態(tài)Trans5α購(gòu)自Transgen公司;泛GTPase酶抑制劑(CID-1067700)購(gòu)自Selleck公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

分別根據(jù)豬源的GBP1基因(Gene ID: 100151938)、GBP2基因(Gene ID: 100153137),使用Snapgene軟件設(shè)計(jì)引物,由擎科生物科技有限公司合成。在引物的5′端和3′端添加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)KpnⅠ、BamHⅠ、ApaⅠ和XhoⅠ。引物序列見(jiàn)表1、siRNA序列見(jiàn)表2。

表1 引物片段序列Table 1 Primer fragment sequences

(續(xù)表1 Continued)

表2 siRNA片段Table 2 siRNA fragments

1.4 GBP1和GBP2分段基因的擴(kuò)增及真核重組質(zhì)粒的構(gòu)建

按Vazyme試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞內(nèi)的RNA,并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,反轉(zhuǎn)錄體系:16 μg RNA,4 μL 5 HiScript?II Q RT SuperMix for qPCR,反應(yīng)條件為50 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為:cDNA模板2 μL,2 Phanta Max Master Mix(Dye Plus)12.5 μL,上游引物(10 μmol·L-1)1 μL,下游引物(10 μmol·L-1)1 μL,加ddH2O 補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性15 s,58 ℃退火15 s,72 ℃延伸2 min;共30個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸5 min。最后用濃度為1%瓊脂糖凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物大小。

將條帶大小正確的GBP1全長(zhǎng)、GBP2(47-592 aa)、(131-592 aa)基因片段、GBP1、GBP2的G、M、E、ME截?cái)囿w和pCDNA3.1(+)空載體同時(shí)使用KpnⅠ、BamHⅠ、ApaⅠ和XhoⅠ雙酶切回收,T4 DNA連接酶過(guò)夜連接后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)Trans 5α。次日,挑取單菌落培養(yǎng)提取重組質(zhì)粒,再酶切鑒定確定條帶大小,并送測(cè)序分析序列的正確性。

1.5 PoRV感染對(duì)GBP1和GBP2表達(dá)影響試驗(yàn)

將MA104細(xì)胞消化后鋪于24孔板,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層,將107TCID50·mL-1毒價(jià)的PoRV(NJ 2012)病毒液按0.1 MOI接毒量感染細(xì)胞,接毒后分別在0、1、6、12和24 h收取細(xì)胞,Western blot檢測(cè)PoRV病毒和GBP1、GBP2表達(dá)情況。同時(shí)設(shè)置(+)PoRV接毒組和(-)PoRV未接毒組。

1.6 GBP1、GBP2基因的過(guò)表達(dá)

將MA104細(xì)胞消化后鋪于24孔板,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層,Lipo3000轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒,參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行正向轉(zhuǎn)染操作。pCDNA3.1(+)、GBP1全長(zhǎng)、GBP2(47-592 aa)、(131-592 aa)、GBP1、GBP2的G、M、E、ME截?cái)囿w轉(zhuǎn)染至MA104細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后24 h,按0.1 MOI感染PoRV病毒液,接毒后12 h左右,收取細(xì)胞。通過(guò)定量PCR和Western blot方法分別檢測(cè)PoRV和GBP1、GBP2基因在mRNA和蛋白水平的變化。

1.7 GBP1、GBP2基因的siRNA干擾試驗(yàn)

前期細(xì)胞鋪板、培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染方法同“1.6”所描述,按照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。將轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒更換為GBP1、GBP2的siRNA基因片段,對(duì)照組由pCDNA3.1(+)空載體更換為公司合成的Negative control(NC)空白對(duì)照,序列見(jiàn)表1。轉(zhuǎn)染后24 h,按0.1 MOI接毒量感染PoRV,接毒后12 h,收取細(xì)胞,檢測(cè)在mRNA水平上GBP1、GBP2和病毒基因PoRV-NSP5變化和蛋白水平上PoRV-VP6的變化,分析干擾GBP1、GBP2表達(dá)對(duì)PoRV復(fù)制的影響。

1.8 GBPs泛GTPase酶活性區(qū)域抑制試驗(yàn)

前期細(xì)胞鋪板、培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及接毒方法同“1.6”所描述,分成兩組,過(guò)表達(dá)組操作同“1.6”,抑制組分別在接毒前1 h和接毒后1 h加入泛GTPase酶活性抑制劑,濃度每孔10 μmol。繼續(xù)培養(yǎng),接毒后12 后收取細(xì)胞,定量PCR和Western blot分別檢測(cè)PoRV和GBP1、GBP2基因在mRNA和蛋白水平的變化。

1.9 Western blot檢測(cè)

蛋白樣品的制備:棄掉細(xì)胞板中培養(yǎng)基,收取細(xì)胞,加PBS重懸,加RIPA裂解液,冰上裂解10 min,加蛋白上樣緩沖液,混勻后金屬浴煮沸10 min,SDS-PAGE分析并進(jìn)行Western blot鑒定。用半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上,5%脫脂奶粉封閉2 h,含0.5%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗膜3次,根據(jù)檢測(cè)靶標(biāo)選擇對(duì)應(yīng)抗體,4 ℃過(guò)夜孵育,次日PBST洗膜3次,再孵育對(duì)應(yīng)一抗和二抗,繼續(xù)室溫孵育60 min,PBST洗滌后,ECL曝光檢測(cè)。

1.10 熒光定量PCR檢測(cè)

分別使用SYBR Green法和探針?lè)z測(cè)GBP和PoRV基因表達(dá)情況,引物序列見(jiàn)表1。GBP1和GBP2基因用SYBR Green法檢測(cè)體系和擴(kuò)增程序。熒光定量體系:ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 5 μL,qGBP1、qGBP2-F 0.2 μL,qGBP1、qGBP2-R 0.2 μL,模板cDNA 3 μL,ddH2O補(bǔ)足10 μL。熒光定量程序:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性10 s,60 ℃延伸30 s,熔解曲線為默認(rèn)程序。PoRV-NSP5基因用探針?lè)z測(cè),熒光定量體系為:2×AceQ qPCR Probe Master Mixa10 μL,50×ROX Reference Dye 2b0.4 μL,qNSP5-F 0.4 μL,qNSP5-R 0.4 μL,TaqMan Probe 0.2 μL,Template cDNA 2 μL,ddH2O補(bǔ)足20 μL。熒光定量程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性 10 s,60 ℃延伸30 s,熔解曲線為默認(rèn)程序。GBP1、GBP2的qPCR引物序列見(jiàn)表3。

表3 qPCR引物片段序列Table 3 qPCR primer fragment sequences

1.11 病毒毒價(jià)檢測(cè)

將MA104細(xì)胞消化后鋪于24孔板,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層,用5 μg·mL-1含胰酶的DMEM培養(yǎng)基稀釋病毒,按照10倍比稀釋,從10-1稀釋到10-10。每孔加入100 μL稀釋好的病毒液,每個(gè)稀釋度重復(fù)8孔,對(duì)照孔加入100 μL 5 μg·mL-1含胰酶的DMEM培養(yǎng)基維持。每日觀察病變并記錄,一般觀察5 d左右。按照Reed-Muench兩氏法計(jì)算結(jié)果。

1.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析/試驗(yàn)數(shù)據(jù)均利用GraphPad Prism9軟件作圖,通過(guò)one-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并通過(guò)Tukey’s multiple comparisons test進(jìn)行組內(nèi)多重比較,其中,*表示差異較顯著為(P<0.05),**表示差異顯著(P<0.01),***表示差異極顯著(P<0.001),****表示差異極顯著(P<0.000 1)。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以豬腎細(xì)胞反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板,成功擴(kuò)增出全長(zhǎng)pCDNA3.1-GBP1-HIS(1 773 bp)、pCDNA3.1(+)-GBP2(47-592 aa)-HIS(1 635 bp)和pCDNA3.1(+)-GBP2(131-592 aa)-HIS(1 383 bp)片段。

以GBP1和GBP2的全長(zhǎng)質(zhì)粒為模板,成功擴(kuò)增出GBP1的pCDNA3.1-GBP1-G-HIS(840 bp)、pCDNA3.1-GBP1-M-HIS(243 bp)、pCDNA3.1-GBP1-E-HIS(600 bp)、pCDNA3.1-GBP1-ME-HIS(930 bp)和GBP2的pCDNA3.1-GBP2-G-HIS(840 bp)、pCDNA3.1-GBP2-M-HIS(531 bp)、pCDNA3.1-GBP2-E-HIS(279 bp)、pCDNA3.1-GBP2-ME-HIS(933 bp)四段結(jié)構(gòu)域截?cái)囿w,瓊脂糖凝膠分析顯示與預(yù)期結(jié)果一致(圖1 A、C、D)。以上重組質(zhì)粒經(jīng)KpnⅠ、BamHⅠ、ApaⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定,可見(jiàn)與預(yù)期結(jié)果大小一致(圖1 B、E、F),并且測(cè)序結(jié)果與GenBank 序列一致,沒(méi)有突變。

A. GBP1、GBP2基因的PCR擴(kuò)增[1. GBP1(1 773 bp)全長(zhǎng)基因擴(kuò)增產(chǎn)物;2. GBP2(47aa-592aa)(1 635 bp)基因擴(kuò)增產(chǎn)物;3. GBP2(131aa-592aa)(1383bp)基因擴(kuò)增產(chǎn)物];B. pCDNA3.1(+)-GBP1-全長(zhǎng)-HIS、pCDNA3.1(+)-GBP2-(47、131-592aa)-HIS重組質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證;C. GBP1截?cái)囿wG、M、E、ME基因的PCR擴(kuò)增;D. GBP2截?cái)囿wG、M、E、ME基因的PCR擴(kuò)增;E. pCDNA3.1(+)-GBP1-HIS截?cái)囿wG、M、E、ME重組質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證;F. pCDNA3.1(+)-GBP2-HIS截?cái)囿wG、M、E、ME重組質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證;M. DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) A. PCR amplification of GBP1 and GBP2 genes, 1. Full-length gene amplification product of GBP1 (1 773 bp), 2. Gene amplification product of GBP2 (47aa-592aa) (1 635 bp), 3. Gene amplification product of GBP2 (131aa-592aa) (1 383 bp); B. Enzymatic verification of pCDNA3.1(+)-GBP1-full-length-HIS, pCDNA3.1(+)-GBP2-(47, 131-592aa)-HIS recombinant plasmids; C. PCR amplification of GBP1 truncated G, M, E, ME genes; D. PCR amplification of GBP2 truncated G, M, E, ME genes; E. Enzymatic validation of pCDNA3.1(+)-GBP1-HIS truncator G, M, E, ME recombinant plasmid; F. Enzymatic validation of pCDNA3.1(+)-GBP2-HIS truncator G, M, E, ME recombinant plasmid; M. DL2000 DNA molecular weight standard圖1 重組質(zhì)粒構(gòu)建與驗(yàn)證Fig.1 Recombinant plasmid construction and validation

2.2 PoRV感染MA104細(xì)胞后不同時(shí)間GBP1、GBP2蛋白的表達(dá)情況

按0.1 MOI接毒量PoRV感染細(xì)胞,接毒后6、12、24 h分別收取(+)PoRV接毒組和(-)PoRV未接毒組樣品,通過(guò)Western blot和相對(duì)熒光定量PCR,結(jié)果顯示,接毒后6、12、24 h PoRV-VP6(40 ku)蛋白表達(dá)逐漸升高,GBP2(65 ku)蛋白表達(dá)逐漸升高,接毒組GBP1(65 ku)蛋白與未接毒組組相比,在6和12 h表達(dá)明顯升高(圖2A)。與不同時(shí)間對(duì)應(yīng)未接毒組相比較,接毒組的GBP1、GBP2基因mRNA拷貝數(shù)均逐漸升高,接毒后6 h,接毒組GBP1、GBP2表達(dá)量無(wú)明顯變化。接毒后12 h,GBP1基因mRNA拷貝數(shù)升高7倍左右,GBP2基因mRNA拷貝數(shù)升高5倍左右。接毒后24 h,GBP1、GBP2基因表達(dá)量達(dá)到最高,GBP1基因mRNA拷貝數(shù)升高15倍左右,GBP2基因mRNA拷貝數(shù)升高12倍左右(圖2B、2 C)。結(jié)果表明,在MA104細(xì)胞中,PoRV感染能上調(diào)GBP1、GBP2的表達(dá)。

2.3 siRNA干擾GBP蛋白表達(dá)對(duì)PoRV復(fù)制的影響

針對(duì)GBP1、GBP2基因的特異性siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)MA104細(xì)胞24 h后,按0.1 MOI感染PoRV,接毒后12 h收取樣品。通過(guò)Western blot、定量PCR、毒價(jià)測(cè)定等方法檢測(cè),結(jié)果顯示,與無(wú)關(guān)干擾NC接毒組相比較,干擾GBP1、GBP2后的接毒組,PoRV-VP6蛋白表達(dá)量升高(圖3 A),干擾GBP1、GBP2組的PoRV-NSP5基因mRNA拷貝數(shù)均升高至2倍以上(圖3 B)。干擾GBP1組的毒價(jià)升高至108TCID50·mL-1,干擾GBP2組的毒價(jià)升至接近108TCID50·mL-1(圖3 C)。結(jié)果表明,GBP1、GBP2蛋白表達(dá)下調(diào)后,PoRV復(fù)制明顯升高。

A. 蛋白水平上GBP1、GBP2的表達(dá)+表示PoRV接毒組;-表示PoRV未接毒組;hpi表示病毒接毒時(shí)間;B. mRNA水平上GBP1的表達(dá) ;C.mRNA水平上GBP2的表達(dá);6、12、24 hpi表示PoRV不同時(shí)間接毒組;6 h-mock、12 h-mock、24 h-mock表示不同時(shí)間未接毒組(差異性分析指同時(shí)間接毒組與未接毒組相比較)。***.P<0.001;****.P<0.000 1 A. Expression of GBP1 and GBP2 at the protein level + indicates PoRV attached group; - indicates PoRV unattached group; hpi indicates the time of virus attachment; B. Expression of GBP1 at the mRNA level; C. Expression of GBP2 at the mRNA level; 6 hpi, 12 hpi, 24 hpi indicate PoRV unattached group; 6 h-mock, 12 h-mock, 24 h-mock indicate PoRV unattached group, 12 h-mock, 24 h-mock denote the uninfected group at different times (differential analysis refers to the comparison of the simultaneous indirect poisoning group with the uninfected group).***.P<0.001;****.P<0.000 1圖2 接種病毒后不同時(shí)間點(diǎn)GBP1、GBP2蛋白在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制水平Fig.2 Replication levels of GBP1 and GBP2 proteins in cells at different time points after virus inoculation

A. PoRV-VP6蛋白水平變化;B. PoRV-NSP5 mRNA表達(dá)的變化;C. PoRV毒價(jià)的變化。**.P<0.01;****.P<0.000 1 A. Change in PoRV-VP6 protein level; B. Change in PoRV-NSP5 mRNA expression; C. Change of PoRV virulence value. **.P<0.01;****.P<0.000 1圖3 干擾GBP1、GBP2蛋白后PoRV復(fù)制水平變化Fig.3 Changes in PoRV replication levels after interference with GBP1 and GBP2 proteins

2.4 過(guò)表達(dá)GBP1、GBP2蛋白對(duì)PoRV復(fù)制的影響

將重組質(zhì)粒pCDNA3.1(+)-GBP1-HIS(1-590 aa、65 ku)和pCDNA3.1(+)-GBP2-HIS(47-592 aa、60 ku)(131-592 aa、55 ku)轉(zhuǎn)染進(jìn)MA104細(xì)胞24 h后,按0.1 MOI 感染PoRV,接毒后12 h,進(jìn)行Western blot、定量PCR、毒價(jià)測(cè)定。結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒的接毒組(Mock組)相比,過(guò)表達(dá)GBP1、GBP2后PoRV-VP6蛋白表達(dá)下降(圖4 A),過(guò)表達(dá)GBP1接毒組,PoRV-NSP5基因mRNA拷貝數(shù)降低60%,過(guò)表達(dá)GBP2(47-592 aa)PoRV-NSP5基因mRNA拷貝數(shù)降低44%、GBP2(131-592 aa)PoRV-NSP5基因mRNA拷貝數(shù)降低46%(圖4 B),過(guò)表達(dá)GBP1接毒組的PoRV毒價(jià)降低至104TCID50·mL-1左右,過(guò)表達(dá)GBP2接毒組PoRV毒價(jià)降至105TCID50·mL-1左右(圖4 C)。結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)GBP1、GBP2蛋白抑制PoRV的復(fù)制。

A. PoRV-VP6蛋白水平變化;B. PoRV-NSP5 mRNA表達(dá)的變化;C. PoRV毒價(jià)的變化。**.P<0.01;***.P<0.001 A. Change in PoRV-VP6 protein level; B. Change in PoRV-NSP5 mRNA expression; C. Change of PoRV virulence value.**.P<0.01;***.P<0.001圖4 過(guò)表達(dá)GBP1、GBP2蛋白后PoRV復(fù)制水平變化Fig.4 Changes in PoRV replication levels after overexpression of GBP1 and GBP2 proteins

2.5 過(guò)表達(dá)GBP1、GBP2蛋白對(duì)PoRV不同復(fù)制時(shí)間的影響

初步驗(yàn)證GBP1、GBP2蛋白對(duì)PoRV的抑制作用后,將重組質(zhì)粒pCDNA3.1(+)-GBP1-HIS和pCDNA3.1(+)-GBP2-HIS(47-592 aa、131-592 aa)轉(zhuǎn)染進(jìn)MA104細(xì)胞24 h后,以0.1 MOI感染PoRV,并在接毒后0、6、12、24 h 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)分批收樣,進(jìn)行Western blot、定量PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒的接毒組(Mock組)相比,接毒0 h,過(guò)表達(dá)GBP1、GBP2后接毒組的PoRV-VP6蛋白未見(jiàn)明顯條帶,PoRV-NSP5基因表達(dá)無(wú)明顯差異。接毒后6 h,Mock組的PoRV-VP6蛋白表達(dá)未見(jiàn)明顯條帶,過(guò)表達(dá)GBP1的PoRV-NSP5基因mRNA拷貝數(shù)表達(dá)下降38%,過(guò)表達(dá)GBP2(47-592 aa)的PoRV-NSP5基因mRNA拷貝數(shù)降低27%、GBP2(131-592 aa)的PoRV-NSP5基因mRNA拷貝數(shù)降低24%。接毒后12 h細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)最好,過(guò)表達(dá)GBP1、GBP2后接毒組的PoRV-VP6蛋白的表達(dá)均下降、過(guò)表達(dá)GBP1的PoRV-NSP5基因mRNA拷貝數(shù)表達(dá)下降51%,過(guò)表達(dá)GBP2(47-592 aa)的PoRV-NSP5基因mRNA拷貝數(shù)降低42%、GBP2(131aa-592aa)的PoRV-NSP5基因mRNA拷貝數(shù)降低40%。接毒后24 h,過(guò)表達(dá)GBP1、GBP2后,PoRV-VP6蛋白的表達(dá)下降、過(guò)表達(dá)GBP1的PoRV-NSP5基因mRNA拷貝數(shù)表達(dá)下降35%,過(guò)表達(dá)GBP2(47-592 aa)的PoRV-NSP5基因mRNA拷貝數(shù)降低20%、GBP2(131-592 aa)的PoRV-NSP5基因mRNA拷貝數(shù)降低29%(圖5A、5 B)。結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)GBP1、GBP2在接毒后12 h抑制PoRV的復(fù)制效果最明顯,24 h其次,說(shuō)明GBP1、GBP2在PoRV吸附、入侵等前期階段沒(méi)有明顯效果,GBP對(duì)病毒基因轉(zhuǎn)錄水平在6 h開(kāi)始有明顯抑制作用,而對(duì)病毒蛋白在接毒后12、24 h發(fā)揮抑制效果。

A.PoRV-VP6蛋白水平變化;B.PoRV-NSP5 mRNA表達(dá)的變化(每不同時(shí)間組與對(duì)應(yīng)時(shí)間Mock組間比較)。*.P<0.05;**.P<0.01 A. Changes in PoRV-VP6 protein levels; B. Changes in PoRV-NSP5 mRNA expression (comparison between each different time group and the corresponding time Mock group).*.P<0.05;**.P<0.01圖5 過(guò)表達(dá)GBP蛋白不同時(shí)間的PoRV復(fù)制水平變化Fig.5 Changes in PoRV replication levels at different times of overexpression of GBP protein

2.6 抑制GTPase酶活性對(duì)PoRV的影響

利用廣譜GTPase酶抑制劑泛GTPase酶抑制劑(CID-1067700),驗(yàn)證抑制劑對(duì)過(guò)表達(dá)GBP1、GBP2蛋白后PoRV感染的影響。將重組質(zhì)粒pCDNA3.1(+)-GBP1-HIS和pCDNA3.1(+)-GBP2-HIS(47-592 aa、131-592 aa)轉(zhuǎn)染進(jìn)MA104細(xì)胞24 h后,分成酶活性非抑制組(Overexpression)和酶活性抑制組(Inhibition)。根據(jù)酶抑制劑推薦接種劑量10 nmol,設(shè)置6種劑量梯度。PoRV感染MA104細(xì)胞,接毒后12、24 h后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)收樣。通過(guò)CCK8方法、Western blot、定量PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示,抑制劑加入MA104細(xì)胞后,6.25 nmol、12 h細(xì)胞狀態(tài)最好,細(xì)胞活力最高,酶抑制劑毒性最小(圖6 A)。Inhibition組加入抑制劑并過(guò)表達(dá)GBP1、GBP2后接毒,與Mock-Inhibition組比較,GBP1-Inhibitor、GBP2-Inhibitor組PoRV-NSP5基因mRNA拷貝數(shù)表達(dá)量均上升至1.5倍左右(圖6 B)、PoRV-VP6蛋白表達(dá)上升(圖6 C),說(shuō)明對(duì)GBP1、GBP2抑制PoRV復(fù)制的效果被解除。Overexpression組過(guò)表達(dá)GBP1、GBP2后接毒,與Mock組相比較,過(guò)表達(dá)GBP1、GBP2組PoRV-NSP5基因mRNA拷貝數(shù)表達(dá)均下降,其中GBP1組下降33%,GBP2組下降46%(圖6 B),PoRV-VP6蛋白表達(dá)也下降(圖6 D),GBP1、GBP2抑制PoRV的復(fù)制。結(jié)果表明,GBP1、GBP2蛋白對(duì)PoRV的復(fù)制發(fā)揮作用需要GTPase活性區(qū)域。

2.7 驗(yàn)證GBP1、GBP2蛋白的不同結(jié)構(gòu)域?qū)oRV的影響

A.細(xì)胞活力水平(%);B.PoRV-NSP5 mRNA水平的變化(與Mock組間比較,未標(biāo)記為無(wú)顯著差異);C.Inhibition組PoRV-VP6、GBP1、GBP2蛋白水平變化;D.Overexpression組PoRV-VP6、GBP1、GBP2蛋白水平變化。*.P<0.05;**.P<0.01 A. Cell viability levels (%); B. Changes in PoRV-NSP5 mRNA levels (compared with no significant difference between Mock groups, unlabeled); C. Changes in PoRV-VP6, GBP1, and GBP2 protein levels in the Inhibition group; D. Changes in PoRV-VP6, GBP1, and GBP2 protein in the Overexpression group level changes.*.P<0.05;**.P<0.01圖6 抑制GBP1、GBP2蛋白結(jié)構(gòu)域后PoRV的變化Fig.6 Changes in PoRV after inhibition of the structural domains of GBP1 and GBP2 proteins

根據(jù)GBP家族蛋白具有的不同結(jié)構(gòu)區(qū)域,N端具有球狀GTPase結(jié)構(gòu)域,具有水解和結(jié)合GTP的功能,標(biāo)為G區(qū)域。中間的螺旋部分起連接作用,標(biāo)為M區(qū)域。C端具有GTPase效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域,標(biāo)為E區(qū)域[18]。將全長(zhǎng)的GBP1(1-590 aa)、GBP2(1-592 aa)蛋白分別截?cái)酁?段,GBP1-G(1-280 aa)、GBP1-M(280-361 aa)、GBP1-E(361-560 aa)、GBP1-ME(280-560 aa)、GBP2-G(1-280 aa)、GBP2-M(281-464 aa)、GBP2-E(464-557 aa)、GBP2-ME(281-592 aa),驗(yàn)證對(duì)PoRV產(chǎn)生影響作用的區(qū)域(圖7 A、7 B)。將重組質(zhì)粒pCDNA3.1(+)-GBP1-G/M/E/ME-HIS和pCDNA3.1(+)-GBP2--G/M/E/ME-HIS轉(zhuǎn)染進(jìn)MA104細(xì)胞24 h后,以0.1 MOI 感染PoRV,接毒12 h后收樣。通過(guò)Western blot、定量PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒的接毒組相比,過(guò)表達(dá)GBP1、GBP2的G區(qū)、M區(qū)、E區(qū)、ME區(qū)4段截?cái)囿w后,過(guò)表達(dá)后G區(qū)域PoRV-VP6蛋白表達(dá)下降最明顯。過(guò)表達(dá)GBP1截?cái)囿w中,M區(qū)PoRV-VP6蛋白部分表達(dá)下降。過(guò)表達(dá)GBP2截?cái)囿w中,M、E區(qū)PoRV-VP6蛋白部分表達(dá)下降(圖7 C),過(guò)表達(dá)G區(qū)域的PoRV-NSP5基因mRNA拷貝數(shù)表達(dá)下降,GBP1-G下降54%,GBP2-G下降50%,其他區(qū)域PoRV-NSP5基因表達(dá)無(wú)明顯差異(圖7 D)。結(jié)果表明,GBP1和GBP2的G區(qū)域抑制PoRV的復(fù)制,說(shuō)明主要發(fā)揮抑制PoRV復(fù)制作用的功能區(qū)域是G區(qū)域。

A、B. GBP1、GBP2截?cái)囿wG、M、E、ME區(qū)結(jié)構(gòu)域示意圖;C. PoRV-VP6蛋白水平變化;D. PoRV-NSP5 mRNA水平的變化(與Mock組間比較,未標(biāo)記為無(wú)顯著差異,*.P<0.05) A, B. Schematic diagram of the structural domains of the G, M, E, and ME regions of GBP1 and GBP2 truncates; C. Changes in PoRV-VP6 protein levels; D. Changes in PoRV-NSP5 mRNA levels (compared with the Mock group, unlabeled as not significantly different,*.P<0.05)圖7 GBP1、GBP2蛋白的G、M、E、ME區(qū)截?cái)囿w對(duì)PoRV復(fù)制的變化Fig.7 Changes in the truncated G, M, E, and ME regions of GBP1 and GBP2 proteins on PoRV replication

3 討 論

PoRV是養(yǎng)殖場(chǎng)最主要的病毒性腹瀉病原之一[19],盡管多種安全有效的PoRV疫苗已在全國(guó)范圍廣泛使用,但PoRV仍嚴(yán)重危害生豬養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。由于對(duì)PoRV發(fā)病機(jī)制和病毒與宿主相互作用的基礎(chǔ)方面了解不足,阻礙了疫苗改進(jìn)和有效抗病毒治療產(chǎn)品的研發(fā)。本試驗(yàn)室在前期轉(zhuǎn)錄組學(xué)中發(fā)現(xiàn)(數(shù)據(jù)未公開(kāi)),PoRV感染豬小腸上皮細(xì)胞后可顯著上調(diào)GBP1、GBP2 基因表達(dá),但與哪個(gè)病毒蛋白互作,或者通過(guò)哪種信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮作用,都尚不明確。

PoRV可以通過(guò)DAP參與許多生物過(guò)程和信號(hào)通路,如代謝過(guò)程、免疫系統(tǒng)過(guò)程、氨基酸代謝、MHC Ⅰ類肽組裝復(fù)合物、Hippo信號(hào)通路等,以此對(duì)抗細(xì)胞的免疫機(jī)制[20]。但細(xì)胞受到病毒感染時(shí),首先細(xì)胞會(huì)通過(guò)啟動(dòng)自身的一系列免疫應(yīng)答反應(yīng)來(lái)阻止病毒的入侵或者抑制病毒的復(fù)制,從而維持細(xì)胞自身的穩(wěn)態(tài)。GBPs家族被IFN誘導(dǎo)后可以大量表達(dá)[21],具有抑制細(xì)胞增殖減少病理?yè)p傷的作用。GBP1抗豬瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)[7]、甲型流感病毒(influenza A virus, IAV)[22]、偽狂犬病病毒(PRV)都需要GTPase發(fā)揮作用。GBP2抗PRRSV、PRV、EMCV、VSV也依賴于GTPase的活性,且GBP2對(duì)弓形蟲(chóng)和沙門菌呈現(xiàn)顯著抑制[9]。本研究發(fā)現(xiàn)PoRV感染MA104細(xì)胞后,GBP1、GBP2的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)。作者首先通過(guò)構(gòu)建真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MA104細(xì)胞實(shí)現(xiàn)GBP1、GBP2過(guò)表達(dá),發(fā)現(xiàn)PoRV-VP6蛋白和PoRV-NSP5 mRNA基因均顯著降低,病毒復(fù)制一定程度受到抑制。為進(jìn)一步明確GBP1、GBP2與PoRV關(guān)系,設(shè)計(jì)特異性siRNA感染片段轉(zhuǎn)染MA104細(xì)胞,沉默GBP1、GBP2基因在細(xì)胞中的表達(dá),PoRV復(fù)制增加。由此可見(jiàn),GBP1、GBP2基因能夠抑制PoRV復(fù)制。通過(guò)GTPase酶活性抑制試驗(yàn)和GBP1、GBP2截?cái)囿w過(guò)表達(dá)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)G區(qū)域?qū)oRV具有抑制復(fù)制的效果。說(shuō)明GBP1、GBP2 共有的N端的G區(qū)域GTPase酶功能區(qū)為其發(fā)揮抗病毒效果所必需,但具體機(jī)制尚有待深入研究。

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建了GBP1全長(zhǎng)、GBP2兩段真核表達(dá)質(zhì)粒、GBP1、GBP2的G、M、E、ME結(jié)構(gòu)域截?cái)囿w,并驗(yàn)證了其能夠成功表達(dá)。隨著PoRV在MA104細(xì)胞中的復(fù)制,GBP1、GBP2的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)。過(guò)表達(dá)GBP1、GBP2蛋白顯著抑制 PoRV在MA104細(xì)胞中的復(fù)制。沉默表達(dá)GBP1、GBP2蛋白顯著促進(jìn)PoRV在MA104細(xì)胞中的復(fù)制。通過(guò)抑制GBP1、GBP2的酶活性區(qū)域和過(guò)表達(dá)GBP1、GBP2的G、M、E、ME區(qū)截?cái)囿w,發(fā)現(xiàn)GBP1、GBP2依賴GTPase酶的G區(qū)域來(lái)抑制PoRV的復(fù)制。該研究首次揭示了GBP1、GBP2蛋白能夠發(fā)揮抗豬輪狀病毒的作用,為深入研究GBP1、GBP2蛋白開(kāi)辟了新道路。