謝青云,邢蕙萱,于巖飛,袁 廳,熊祺琰,熊富強,馮志新,3,4*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用生物制品工程重點實驗室,南京 210014; 2.西藏農(nóng)牧學(xué)院,動物科學(xué)學(xué)院,林芝 850400; 3.獸用生物制品(泰州)國泰技術(shù)創(chuàng)新中心,泰州 225300; 4.南京農(nóng)學(xué)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,南京 210095)

由豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)感染引起的豬氣喘病,是一種接觸性慢性呼吸道傳染病,全球范圍內(nèi)發(fā)病率高達(dá)38%～100%,給全球養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。疫苗和抗生素聯(lián)用是防治豬氣喘病的主要方法,但并不能完全控制疾病發(fā)生,豬肺炎支原體的持續(xù)性感染問題頻發(fā)[3]。普遍認(rèn)為,病原微生物逃避宿主免疫監(jiān)測和控制是導(dǎo)致其持續(xù)性感染的主要誘因[4],而同源重組介導(dǎo)的抗原變異是支原體逃避宿主免疫系統(tǒng)的重要途徑之一[5-7]。

據(jù)報道,原核微生物的同源重組首先由RecBCD多酶系統(tǒng)發(fā)起同源重組事件,再經(jīng)RecA催化同源DNA序列的置換反應(yīng),形成一種稱為霍利迪連接體(holliday junctions,HJs)的交叉鏈中間體[8-10];接著,RuvABC多酶系統(tǒng)利用水解ATP供能催化HJs分支遷移(branch migration),進(jìn)而形成成熟的重組雙鏈DNA分子。研究表明,DNA解旋酶RuvA和RuvB專一性催化HJs的分支遷移與解離是同源重組的關(guān)鍵步驟,并且在多種病原體的抗原變異中扮演重要角色[4,11-12]。例如,針對淋球菌Pilin基因抗原變異突變株的基因篩選鑒定研究發(fā)現(xiàn),RuvA和RuvB是介導(dǎo)淋球菌Pilin基因抗原變異的必需基因[13]。

RuvA最初于大腸桿菌中發(fā)現(xiàn),屬于SF6解旋酶超家族中的一員。它作為紫外光敏感突變體之一被命名為Ruv, 繼而又根據(jù)對萘啶酸的敏感性以及微量瓊脂或泛酰內(nèi)酯對紫外線照射細(xì)胞存活的影響,進(jìn)一步細(xì)分為RuvA和RuvB[14]。普遍認(rèn)為,原核微生物的同源重組機制相對保守。但是,對解旋酶RuvA體外生化活性研究發(fā)現(xiàn),不同病原體中RuvA的生物活性存在差異。例如:大腸桿菌RuvAE.coli對HJs的親和力是雙鏈DNA的20倍[15];肺炎支原體RuvAMpn對HJs和單鏈DNA(single strand DNA,ssDNA)具有相似親和力,而生殖支原體RuvAMge對HJs的親和力更高[16-17];RuvAMge、RuvAMpn和RuvAE.coli均能夠與ssDNA形成一種復(fù)合物,而RuvAMpn和RuvAE.coli能夠與HJs形成兩種不同的復(fù)合物,RuvAMge只能與HJs形成一種復(fù)合物[16-18]。目前,解析RuvAMhp生化活性的研究仍是空白。

鑒于此,本研究主要針對RuvAMhp基因進(jìn)行原核表達(dá)、DNA結(jié)合活性鑒定及多克隆抗體制備,為深入探索RuvA調(diào)解同源重組介導(dǎo)豬肺炎支原體抗原變異的分子機制提供生物學(xué)材料并奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 生物樣本來源E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)購自北京擎科生物科技有限公司;pET21a載體購自生工生物工程股份有限公司;豬肺炎支原體168-L株由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存;新西蘭大白兔由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實驗動物中心黃梅基地提供。

1.1.2 主要試劑 限制性核酸內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ購自 NEB 公司;瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒購自O(shè)MEGA公司;PrimeSTAR HS DNA聚合酶購自TaKaRa公司;無縫克隆試劑盒和點突變試劑盒購自南京諾唯贊生物有限公司;Histrap HP層析柱購自GE Healthcare公司;5×SDS-PAGE上樣緩沖液、Bradford蛋白濃度定量試劑盒和TMB顯色液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;超濾離心管購自Millipore公司。

1.1.3 主要儀器 PTC-100 PCR擴增儀(MJ-Research);TGL-16 G-A型高速冷凍離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);SHZ-82A恒溫震蕩培養(yǎng)器;PTC-100 PCR擴增儀(MJ-Research);超聲波細(xì)胞破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司);DYCZ-24垂直電泳儀(北京六一);Typhoon多功能激光掃描成像儀(GE Healthcare);SUNRISE觸摸屏酶標(biāo)儀(TECAN);蛋白電泳儀和半干轉(zhuǎn)印儀(Bio-Rad)。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 以Mhp168-L RuvA(Gene ID: 57101295)的基因序列為模板,參照無縫克隆試劑盒引物設(shè)計方案設(shè)計特異性擴增引物(表1),同源臂和酶切位點(NdeⅠ:5′CATATG3′;XhoⅠ:5′CTCGAG3′)分別以下劃線和斜體表示。值得注意的是,RuvAMhp氨基酸序列中的Trp103由在原核表達(dá)系統(tǒng)中為終止子的密碼子TGA編碼,因此需要參照點突變試劑盒設(shè)計方案設(shè)計突變引物RuvAMhp-TGA-F和RuvAMhp-TGA-R,將307TGA309突變?yōu)門GG。上述引物均由金斯瑞科技有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.2 重組質(zhì)粒pET21a-RuvAMhp的構(gòu)建 參照OMEGA質(zhì)粒小提試劑盒說明書,提取Mhp168-L全基因組DNA。以Mhp168-L全基因組DNA為模板,利用引物RuvAMhp-F、 RuvAMhp-R和PrimeSTAR HS DNA聚合酶擴增目的片段。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,大小約為672 bp。參照無縫克隆試劑盒說明書,利用經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化后的PCR產(chǎn)物和線性化pET21a載體(NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切)構(gòu)建pET21a-RuvAMhp-TGA重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒至E.coliDH5α,37 ℃固定培養(yǎng)18 h后,挑取單克隆送至生工生物工程股份有限公司測序。參照點突變試劑盒說明書,以測序成功的pET21a-RuvAMhp-TGA重組質(zhì)粒為模板,利用引物RuvA-TGA-F、RuvA-TGA-R構(gòu)建pET21a-RuvAMhp重組質(zhì)粒。PCR和雙酶切驗證pET21a-RuvAMhp重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化pET21a-RuvAMhp至E.coliDH5α,37 ℃固定培養(yǎng)18 h后,挑取單克隆送至生工生物工程股份有限公司測序。

1.2.3 重組蛋白RuvA的表達(dá)與純化 轉(zhuǎn)化測序成功的pET21a-RuvAMhp重組質(zhì)粒至E.coliBL21(DE3)中,37 ℃固定培養(yǎng)18 h后挑取單克隆接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中(含100 μg·mL-1氨芐青霉素),37 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)18 h。表達(dá)方式鑒定:取新鮮培養(yǎng)的菌液以1∶100接種于20 mL液體LB培養(yǎng)基中(含100 μg·mL-1氨芐青霉素),37 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)3 h。取2 mL菌液離心收集沉淀,1 mL PBS重懸后作為未誘導(dǎo)對照;以0.5 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)RuvAMhp重組蛋白表達(dá),16 ℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng)18 h,取2 mL菌液離心收集沉淀,1 mL PBS重懸后作為誘導(dǎo)后全菌;剩余菌液離心后收集菌體,1.5 mL PBS重懸后于冰上超聲破碎10 min,11 000 r·min-1離心15 min收集上清為誘導(dǎo)后上清樣品;10 mL PBS重懸沉淀為誘導(dǎo)后沉淀樣品。通過SDS-PAGE鑒定蛋白的表達(dá)形式。大量表達(dá):取新鮮培養(yǎng)的菌液以1∶100接種于2 L液體LB培養(yǎng)基中(含100 μg·mL-1氨芐青霉素),37 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)3 h后以0.5 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)RuvAMhp重組蛋白表達(dá)。16 ℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng)18 h后收集菌體。100 mL上柱緩沖液(20 mmol·L-1HEPES pH 8.0,10 mmol·L-1咪唑,300 mmol·L-1NaCl,2%甘油,1% NP-40)重懸菌體于冰上超聲破碎40 min,11 000 r·min-1離心30 min收集上清。純化:利用Histrap HP層析柱純化RuvAMhp重組蛋白,依次用300 mL清洗緩沖液(20 mmol·L-1HEPES pH 8.0,50 mmol·L-1咪唑,300 mmol·L-1NaCl,2%甘油,1% NP-40)和100 mL洗脫緩沖液(20 mmol·L-1HEPES pH 8.0,250 mmol·L-1咪唑,300 mmol·L-1NaCl,2%甘油)洗脫雜蛋白和目的蛋白。利用SDS-PAGE鑒定純化后RuvAMhp重組蛋白純度。儲存液(20 mmol·L-1HEPES pH 8.0,100 mmol·L-1NaCl,5%甘油)透析濃縮、Bradford蛋白濃度定量試劑盒測定濃度。

1.2.4 兔抗RuvAMhp多克隆抗體制備 選取經(jīng)ELISA方法確定Mhp血清抗體陰性的新西蘭大白兔進(jìn)行試驗。RuvAMhp重組蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化作為免疫原(2 mg·mL-1),采用背部皮下多點注射法(1 mg·只-1)對所選動物進(jìn)行首次免疫;RuvAMhp重組蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑混合乳化作為免疫原(2 mg·mL-1),以同樣的方法依次對免疫后動物進(jìn)行第二次和第三次免疫。首免、二免、三免間隔兩周。三次免疫一周后心臟采血,檢測抗體效價。

1.2.5 兔抗RuvAMhp多克隆抗體效價的測定 用RuvAMhp重組蛋白包被ELISA板,包被濃度為1 μg·mL-1。用PBS按1∶1 000～1∶128 000梯度稀釋制備的兔抗RuvAMhp多克隆抗體,100 μL·孔-1添加至RuvAMhp包被板中,37 ℃孵育2 h后,PBST(PBS pH 7.4,0.05%吐溫20)洗滌3次;5 000倍稀釋HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG,100 μL·孔-1添加至包被板中,37 ℃孵育1 h后,PBST洗滌3次;添加100 μL·孔-1TMB顯色液至包被板中,37 ℃顯色10 min,再加入50 μL終止液,酶標(biāo)儀檢測OD450 nm。設(shè)置免疫前的兔血清為陰性對照,PBS為空白對照,以免疫后血清OD450 nm值/陰性對照血清OD450 nm值≥2.1為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.6 兔抗RuvAMhp多克隆抗體Western blot鑒定 RuvAMhp重組蛋白、牛血清蛋白(BSA)、豬肺炎支原體烯醇化酶(Enolase,EnoMhp)、以及誘導(dǎo)后pET21a-RuvAMhp全菌和pET21a空載全菌經(jīng)12% SDS-PAGE電泳后,利用半干轉(zhuǎn)印儀轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,封閉液(PBS pH 7.4,5%脫脂乳)室溫封閉2 h;用PBST按2 000稀釋制備的兔抗RuvAMhp多克隆抗體作為一抗,4 ℃過夜孵育;PBST洗滌5次,用10 000倍稀釋(稀釋液:PBST,5%脫脂乳)的山羊抗兔HRP抗體作為二抗,室溫震蕩孵育2 h;PBST洗滌5次,ECL顯影。

1.2.7 DNA底物的設(shè)計與構(gòu)建 設(shè)計22 nt(S4-1)和44 nt(S4)的DNA序列用于測定RuvAMhp重組蛋白的DNA結(jié)合活性;設(shè)計4條44 nt(S1、S2、S3和S4)的DNA序列用于退火構(gòu)建結(jié)構(gòu)(HJs,臂長22 bp)。退火體系:20 mmol·L-1HEPES pH 8.0,100 mmol·L-1NaCl,各2 μmol·L-1的S1、S2、S3和S4;PCR上95 ℃處理2 min,再以每8 s下降0.1 ℃降至25 ℃。上述DNA序列均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成,具體序列見表2。

表2 底物DNA序列Table 2 Substrate DNA sequence

1.2.8 DNA結(jié)合活性的鑒定 利用凝膠遷移試驗(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)體外分析RuvAMhp重組蛋白的DNA結(jié)合活性。通過檢測RuvAMhp重組蛋白與底物S4-1和S4的結(jié)合情況,分析序列長度對RuvAMhpDNA結(jié)合活性的影響;通過檢測RuvAMhp重組蛋白與四鏈DNA底物的結(jié)合情況鑒定RuvAMhp的HJs結(jié)合活性。每10 μL的反應(yīng)體系含20 mmol·L-1Tris-HCl (pH 7.5)、1 mmol·L-1DTT、1 mmol·L-1EDTA、15 nmol·L-1熒光標(biāo)記的DNA底物和不同濃度的RuvAMhp重組蛋白;置于冰上孵育10 min后加入4 μL上樣緩沖液(50%甘油);經(jīng)8% Native-PAGE恒壓(220V)電泳3 h后,利用Typhoon多功能激光掃描成像儀顯影(Cy3激發(fā))。利用表面等離子共振技術(shù)(SPR)分析RuvAMhp重組蛋白對四鏈DNA底物的親和力。具體操作如下:20 ℃反應(yīng)條件下,通過鏈霉親和素-生物素反應(yīng)將四鏈DNA底物固定在傳感芯片(SA芯片)表面,將濃度范圍為8～256 nmol·L-1的RuvAMhp重組蛋白以恒定流速流過包被芯片表面,實時檢測芯片上的互作信號。

1.2.9 寡聚特征的鑒定 利用EMSA結(jié)合Western blot體外分析RuvAMhp重組蛋白的寡聚特性。每10 μL的反應(yīng)體系含20 mmol·L-1Tris-HCl (pH 7.5)、1 mmol·L-1DTT、1 mmol·L-1EDTA、15 nmol·L-1熒光標(biāo)記的四鏈DNA底物和不同濃度的RuvAMhp重組蛋白;置于冰上孵育10 min后加入4 μL上樣緩沖液;8% Native-PAGE電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上;參照“1.2.6”中的試驗流程進(jìn)行Western blot檢測。

2 結(jié) 果

2.1 RuvAMhp基因的擴增及表達(dá)載體構(gòu)建

對構(gòu)建的pET21a-RuvAMhp重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定,獲得了單一的特異性擴增條帶,片段大小約為672 bp,與RuvAMhp基因長度相符(圖1)。利用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定pET21a-RuvAMhp重組質(zhì)粒,獲得大小約672 bp的目的基因片段和5 000 bp左右的載體片段,結(jié)果與預(yù)期大小相符(圖2)。上述結(jié)果表明,pET21a-RuvAMhp重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

A. RuvAMhp基因的PCR擴增結(jié)果(M1. 2000 bp DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. pET21a-RuvAMhp重組質(zhì)粒擴增產(chǎn)物);B. pET21a-RuvAMhp雙酶切鑒定結(jié)果(M1. 2000 bp DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);M2. 10000 bp DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. pET21a-RuvAMhp重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物) A. PCR amplification results of RuvAMhp gene (M1. 2000 bp DNA relative molecular weight standard; 1. pET21a-RuvAMhp recombinant plasmid amplification product); B. Identification results of pET21a-RuvAMhp double enzyme digestion (M1. 2000 bp DNA molecular weight standard; M2. 10000 bp DNA relative molecular weight standard; 1. pET21a-RuvAMhp recombinant plasmid double cut product)圖1 pET21a-RuvAMhp重組質(zhì)粒鑒定Fig.1 Identification of pET21a-RuvAMhp recombinant plasmid

2.2 pET21a-RuvAMhp重組質(zhì)粒的表達(dá)形式鑒定

利用測序正確的pET21a-RuvAMhp重組質(zhì)粒在E.coliBL21(DE3)中以0.5 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)RuvAMhp重組蛋白表達(dá)。設(shè)置未添加IPTG的菌液作為未誘導(dǎo)對照。誘導(dǎo)后的菌液經(jīng)超聲破碎,高速離心分別收集上清和沉淀,通過SDS-PAGE鑒定RuvAMhp重組蛋白的表達(dá)形式。結(jié)果如圖2所示,與未誘導(dǎo)對照相比,pET21a-RuvAMhp可經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)RuvAMhp重組蛋白(泳道1和2);RuvAMhp重組蛋白集中在上清中大量表達(dá)(泳道3和4)。

2.3 RuvAMhp重組蛋白的表達(dá)純化

原核表達(dá)2 L的 RuvAMhp重組蛋白菌液,經(jīng)超聲破碎收集上清。利用Histrap HP層析柱純化RuvAMhp重組蛋白,融合His標(biāo)簽的RuvAMhp重組蛋白結(jié)合至層析柱上,再經(jīng)含250 mmol·L-1咪唑的洗脫緩沖液競爭性洗脫。利用SDS-PAGE鑒定純化后RuvAMhp重組蛋白純度。結(jié)果如圖3(A)所示,洗脫液中含有大量相對分子質(zhì)量約為26 ku、條帶單一的重組蛋白,與RuvAMhp預(yù)期大小一致。收集圖3(A)中4～7泳道的洗脫液,利用Bradford蛋白濃度定量試劑盒測定經(jīng)透析濃縮后的RuvAMhp重組蛋白,最終獲得濃度為12.6 mg·mL-1的RuvAMhp重組蛋白,結(jié)果如圖3(B)所示。

M. 180 ku蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. 未誘導(dǎo)對照;2. 誘導(dǎo)后全菌;3. 誘導(dǎo)后破碎沉淀;4. 誘導(dǎo)后破碎上清;紅色方框指示RuvAMhp重組蛋白條帶位置 M. 180 ku protein marker; 1. Uninduced control; 2. Induced whole bacteria; 3. Induced crushing and sedimentation; 4. Crush the supernatant after induction; The red box indicates the position of the RuvAMhp recombinant protein band圖2 RuvAMhp重組蛋白的表達(dá)形式鑒定Fig.2 Expression identification of RuvAMhp recombinant protein

A. RuvAMhp重組蛋白的Histrap HP層析柱純化結(jié)果(M. 180 ku蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. 誘導(dǎo)表達(dá)后上清;2. 上清過柱流穿液;3～7. 洗脫液洗脫蛋白);B. RuvAMhp重組蛋白的透析脫鹽結(jié)果(M. 180 ku蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. RuvAMhp重組蛋白) A. Purification results of RuvAMhp recombinant protein by Histrap HP chromatography column (M. 180 ku protein relative molecular weight Standard; 1. Induce expression in the supernatant; 2. The upper cleaning column flows through the liquid; 3-7. Elution solution for protein elution); B. Dialysis desalination results of RuvAMhp recombinant protein (M. 180 ku protein relative molecular weight standard; 1. RuvAMhp recombinant protein)圖3 RuvAMhp重組蛋白的純化SDS-PAGE結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE identification of purified RuvAMhp recombinant protein

2.4 兔抗RuvAMhp多克隆抗體的鑒定

在新西蘭大白兔完成免疫程序后,獲得兔抗RuvAMhp多克隆抗體,采用間接ELISA法檢測多克隆抗體效價(表3)。結(jié)果表明,制備的兔抗RuvAMhp多克隆抗體效價達(dá)到1∶256 000以上。利用Western blot試驗驗證制備的兔抗RuvAMhp多克隆抗體的特異性,結(jié)果如圖4所示,僅只有RuvAMhp重組蛋白和pET21a-RuvAMhp誘導(dǎo)后全菌出現(xiàn)單一的特異性免疫條帶,兔抗RuvAMhp多克隆抗體與無關(guān)蛋白對照BSA和EnoMhp、以及pET21a空載全菌不存在交叉反應(yīng)。上述結(jié)果表明特異性好、效價高的兔抗RuvAMhp多克隆抗體制備成功。

表3 ELISA方法測定兔抗RuvAMhp多克隆抗體效價Table 3 ELISA method for determining the titers of rabbit anti RuvAMhp polyclonal antibodies

M. 180 ku蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. RuvAMhp重組蛋白;2. BSA;3. EnoMhp重組蛋白;4. pET21a空載全菌;5. pET21a-RuvAMhp全菌 M. 180 ku protein marker; 1. RuvAMhp recombinant protein; 2. BSA; 3. EnoMhp recombinant protein; 4. pET21a whole bacteria; 5. pET21a-RuvAMhp whole bacteria圖4 Western blot分析兔抗RuvAMhp多克隆抗體的特異性Fig.4 Western blot analysis of the specificity of rabbit polyclonal antibody against RuvAMhp

2.5 RuvAMhp重組蛋白的DNA結(jié)合活性分析

利用EMSA體外分析RuvAMhp重組蛋白的DNA結(jié)合活性。通過檢測RuvAMhp重組蛋白與底物S4和S4-1的結(jié)合情況,分析序列長度對RuvAMhpDNA結(jié)合活性的影響。結(jié)果如圖5所示,泳道1為不添加RuvAMhp重組蛋白的空白對照,指示單鏈DNA的位置;泳道2～9為按照2倍濃度梯度添加RuvAMhp重組蛋白的試驗組,可以看出:RuvAMhp與單鏈DNA形成兩種復(fù)合物:RuvAMhp-ssDNA-I和RuvAMhp-ssDNA-II;底物S4和底物S4-1與RuvAMhp形成復(fù)合物的最低試驗濃度分別為4和8 μmol·L-1,并且添加的RuvAMhp濃度越高,形成的高分子量RuvAMhp-ssDNA復(fù)合物的產(chǎn)物越多;單鏈DNA底物長度越長,形成高分子量RuvAMhp-ssDNA復(fù)合物的產(chǎn)物也越多。

A. RuvAMhp重組蛋白與44 nt單鏈DNA底物S4互作的EMSA結(jié)果;B. RuvAMhp重組蛋白與22 nt單鏈DNA底物S4-1互作的EMSA結(jié)果;1. 未添加RuvAMhp重組蛋白對照;2～9. 添加的RuvAMhp重組蛋白濃度分別為1、2、4、8、16、32、64、128 μmol·L-1 A. EMSA results of the interaction between RuvAMhp and 44 nt single stranded DNA substrate S4; B. EMSA results of the interaction between RuvAMhp and 22 nt single stranded DNA substrate S4-1; 1. No RuvAMhp control; 2-9. The concentrations of added RuvAMhp recombinant proteins are 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, and 128 μmol·L-1, respectively圖5 EMSA分析RuvAMhp重組蛋白的DNA結(jié)合活性Fig.5 EMSA analysis of DNA binding activity of RuvAMhp recombinant protein

確定了RuvAMhp重組蛋白的DNA活性后,作者再次利用EMSA體外分析了與四鏈DNA底物的結(jié)合情況。該底物模擬了同源重組進(jìn)程中的關(guān)鍵核酸產(chǎn)物霍利迪連接體(HJs)的結(jié)構(gòu)。結(jié)果如圖6A所示,泳道1為不添加RuvAMhp重組蛋白的空白對照,指示四鏈DNA底物的位置;泳道:13為底物95 ℃處理組,指示單鏈DNA位置;泳道2～12為按照2倍濃度梯度添加RuvAMhp重組蛋白的試驗組,可以看出:0.5 μmol·L-1及以上濃度的RuvAMhp重組蛋白即可與四鏈DNA底物形成一種RuvAMhp-HJs復(fù)合物,并且RuvAMhp濃度越高,高分子量RuvAMhp-HJs復(fù)合物產(chǎn)量越多。與圖5對比可知,RuvAMhp對四鏈DNA底物的親和力強于單鏈DNA。

為了明確RuvAMhp對四鏈DNA底物的親和力大小,利用SPR分析了RuvAMhp重組蛋白與四鏈DNA底物結(jié)合動力學(xué)曲線。結(jié)果如圖6B所示,RuvAMhp對四鏈DNA底物表現(xiàn)出了顯著的親和力,親和力系數(shù)KD值為624.4 pmol·L-1。

A. RuvAMhp重組蛋白與四鏈DNA底物互作的EMSA結(jié)果(1. 未添加RuvAMhp重組蛋白對照;2～12. 添加的RuvAMhp重組蛋白濃度分別為0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128 μmol·L-1;13. 95 ℃處理對照);B. RuvAMhp重組蛋白與四鏈DNA底物互作的SPR結(jié)果 A. EMSA results of the interaction between RuvAMhp and quadruplex DNA substrate (1. No RuvAMhp control; 2-12. The concentrations of added RuvAMhp were 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 μmol·L-1, respectively; 13. 95 ℃ treatment control); B. SPR results of the Interaction between RuvAMhp and four stranded DNA substrates圖6 RuvAMhp重組蛋白的四鏈DNA底物(HJs)結(jié)合活性分析Fig.6 Analysis of four-strand DNA substrate (HJs) binding activity of RuvAMhp recombinant protein

2.6 RuvAMhp重組蛋白的寡聚特性分析

利用EMSA結(jié)合Western blot體外分析RuvAMhp重組蛋白的寡聚特性。結(jié)果如圖7所示,泳道1為不添加RuvAMhp重組蛋白的空白對照;泳道2～3為按照2倍濃度梯度添加RuvAMhp重組蛋白的試驗組,最終形成的寡聚產(chǎn)物條帶主要集中在200 ku左右,RuvAMhp重組蛋白的分子量約為26 ku(圖4),提示RuvAMhp主要以八聚體形式與四鏈DNA底物形成穩(wěn)定復(fù)合物。

M. 180 ku蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. 未添加RuvAMhp重組蛋白對照;2～4. 添加的RuvAMhp重組蛋白濃度分別為1、2、4 μmol·L-1 M. 180 ku protein marker; 1. No RuvAMhp control; 2-4. The concentrations of added RuvAMhp were 1, 2, 4 μmol·L-1, respectively圖7 RuvAMhp重組蛋白的寡聚特征分析Fig.7 Analysis of the oligomerization characteristics of RuvAMhp recombinant protein

3 討 論

支原體在宿主免疫系統(tǒng)施加的外部壓力和抗生素藥物的使用下不斷進(jìn)化,導(dǎo)致持續(xù)性感染問題頻發(fā)。普遍認(rèn)為,病原微生物逃避宿主免疫監(jiān)測和控制的最常見策略是抗原變異,如支原體、奈瑟菌、螺旋體和流感病毒等[4]。研究發(fā)現(xiàn),豬肺炎支原體中具有DNA重復(fù)元件(可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列,VNTR)的基因會發(fā)生序列長度變異[19-20],而同源重組被認(rèn)為是介導(dǎo)上述變異的誘因之一[7,21]。在原核微生物中,DNA解旋酶RuvA在同源重組中作為連接結(jié)合的特異性因子,為其它重組相關(guān)蛋白的組裝提供支架,并積極參與HJs的分支遷移和解離反應(yīng)[22]。豬肺炎支原體基因組大小在580～1 350 kb,可編碼600多個蛋白,大約為大腸桿菌的1/5～1/4[7]。受限于基因組的含量,豬肺炎支原體僅具備一個基本完整的DNA重組修復(fù)系統(tǒng)。目前,在GenBank公布的所有豬肺炎支原體菌株序列中,上述參與原核微生物同源重組的酶僅鑒定出RuvA和RuvB。本研究以RuvAMhp為研究對象,原核表達(dá)了全長RuvAMhp重組蛋白,并利用EMSA結(jié)合SPR試驗和Western blot體外分析了其DNA結(jié)合活性與寡聚特征。

本研究建立的RuvAMhp原核表達(dá)體系表達(dá)量高,經(jīng)Histrap HP層析柱純化后產(chǎn)量可達(dá)25 mg·L-1(圖3)。利用該重組蛋白制備的兔抗RuvAMhp多克隆抗體特異性好,與無關(guān)蛋白對照牛血BSA和EnoMhp,以及轉(zhuǎn)化pET21a空載的全菌蛋白不存在交叉反應(yīng)(圖6);效價高,可達(dá)1∶256 000以上(表3)。RuvAMhp重組蛋白的DNA結(jié)合活性鑒定結(jié)果表明,與肺炎支原體RuvAMpn和生殖支原體RuvAMge一樣,RuvAMhp對ssDNA和HJs都具有較強的結(jié)合活性。不同于RuvAMpn與RuvAE.coli與HJs形成兩種復(fù)合物,與ssDNA形成一種復(fù)合物[16];RuvAMge與ssDNA和HJs均形成一種復(fù)合物[16];EMSA結(jié)果顯示RuvAMhp可與ssDNA形成兩種RuvAMhp-ssDNA復(fù)合物,而與HJs僅形成一種RuvAMhp-HJs復(fù)合物(圖5、6)。據(jù)報道,RuvAE.coli首先以四聚體或八聚體形式與HJs形成復(fù)合物,再招募兩個RuvBE.coli六聚體環(huán)裝載至RuvAE.coli-HJs復(fù)合物上;接著,RuvAB利用水解ATP供能催化HJs的分支遷移與解離,通過延展異源雙鏈體區(qū)域促進(jìn)其它重組相關(guān)蛋白在HJs復(fù)合物上的裝載,為最終成熟重組雙鏈DNA分子的形成創(chuàng)造必要條件[22]。RuvAE.coli的兩種寡聚形式導(dǎo)致了兩種RuvAE.coli-HJs復(fù)合物的形成(四聚產(chǎn)物RuvAE.coli-HJs-I和八聚產(chǎn)物RuvAE.coli-HJs-II)。由于RuvAMhp與ssDNA形成的兩種復(fù)合物在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率與RuvAE.coli和RuvAMpn與HJs形成的兩種復(fù)合物相似,RuvAMhp-HJs復(fù)合物在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率與RuvAMpn-HJs-II復(fù)合物相似[16],因此作者推測RuvAMhp以八聚體形式與HJ形成穩(wěn)定復(fù)合物,而與ssDNA則以四聚體和八聚體形式形成兩種復(fù)合物。這可能歸因于RuvAMhp對HJs的親和力較ssDNA更強,并且符合RuvA在HJ上形成穩(wěn)定的八聚體結(jié)構(gòu)對其充分發(fā)揮酶活至關(guān)重要的研究報道[23-25]。RuvAMpn與四鏈DNA底物結(jié)合時的寡聚特征表征試驗同樣提示RuvAMhp主要以八聚體形式與HJ形成穩(wěn)定復(fù)合物(圖7)。此外,不同于RuvAMpn偏好結(jié)合單鏈DNA,RuvAMhp與RuvAMge對HJs表現(xiàn)出了更強的親和力[16]。無論是ssDNA還是HJs,添加的RuvAMhp濃度越高,形成的高分子量復(fù)合物的產(chǎn)物越多(圖5、6),提示高分子量聚合形態(tài)的RuvAMhp較低寡聚的RuvAMhp與結(jié)合DNA結(jié)合的更穩(wěn)定。符合解旋酶的一般特征[26],RuvAMhp的DNA結(jié)合活性也表現(xiàn)出了長度依賴性,ssDNA底物長度越長(圖5),形成高分子量RuvAMhp-ssDNA復(fù)合物的產(chǎn)物也越多。這可能與長度長的底物更利于解旋酶聚合裝載有關(guān)。

4 結(jié) 論

本研究完成了RuvAMhp重組蛋白的原核表達(dá)、多克隆抗體制備及活性鑒定。制備了特異性好、效價高(1∶256 000)的兔抗RuvAMhp多克隆抗體;體外證明了RuvAMhp對DNA具有較強的結(jié)合活性,尤其是對同源重組四鏈DNA中間體的親和力高達(dá)624.4 pmol·L-1;鑒定出了RuvAMhp不同于其他支原體來源的DNA結(jié)合特征,為進(jìn)一步探究RuvA調(diào)解同源重組介導(dǎo)RuvAMhp抗原變異的分子機制提供了生物學(xué)材料并奠定了基礎(chǔ)。