李惠惠,董可兒,劉馨博,張春曉,馬 超,陳利蘋,鐘 旗,姚 剛*, 馬雪連*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,烏魯木齊 830052;2.動(dòng)物保健與畜產(chǎn)品質(zhì)量安全研究實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830052; 3.烏魯木齊市動(dòng)物園,烏魯木齊 830001;4.深圳市真瑞生物有限公司,深圳 518000; 5.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所,烏魯木齊 830000)

犢牛腹瀉是全球養(yǎng)牛業(yè)中一種常見(jiàn)的消化道疾病,以消化不良、腹瀉、痢疾等為主要癥狀,極易造成犢牛生長(zhǎng)發(fā)育不良、生長(zhǎng)周期延長(zhǎng)、繼發(fā)感染甚至死亡,給牧場(chǎng)主造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。病毒所致?tīng)倥８篂a是最常見(jiàn)的因素之一[3]。牛諾瓦病毒(bovine norovirus, BNoV)是嵌杯病毒科、諾瓦病毒屬的無(wú)囊膜單股正鏈RNA病毒[4]。1978年,首次在英國(guó)腹瀉犢牛的糞便中被發(fā)現(xiàn)[5],2018年,首次在我國(guó)犢牛腹瀉糞便中檢測(cè)到[6],BNoV作為一種新發(fā)病原,尚未見(jiàn)關(guān)于重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的報(bào)道。牛輪狀病毒(bovine rotavirus, BRV)屬于呼腸孤病毒科,輪狀病毒屬,是引起犢牛腹瀉的主要病原之一,感染犢牛后引起的疾病具有發(fā)病率高、流行性廣、危害性大等特點(diǎn),嚴(yán)重影響我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展[7-8]。兩者在臨床中單憑癥狀很難區(qū)別,給臨床診斷帶來(lái)了極大的困難,且常有混合感染而加重腹瀉嚴(yán)重度,造成死亡率增加[7,9]。

重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(recombinase aided amplification, RAA)技術(shù),利用重組酶、單鏈結(jié)合蛋白、聚合酶進(jìn)行反應(yīng),是一種具有反應(yīng)速度快、特異性強(qiáng)、靈敏度高的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[10-11]。本研究基于RAA技術(shù),結(jié)合側(cè)流層析試紙條(lateral flow dipstick, LFD)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行可視化觀察,同時(shí)檢測(cè)BNoV和BRV,為有效防控BNoV和BRV提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司),感受態(tài)細(xì)胞pEASY-T1(北京全式金生物技術(shù)有限公司),恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(安普未來(lái)生物科技有限公司),天隆Gentier 48E實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(西安天隆科技有限公司),電熱恒溫水浴鍋(上海尚普儀器設(shè)備有限公司)。

1.1.2 樣品來(lái)源 BNoV、BRV、牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)、牛冠狀病毒(bovine coronavirus, BCoV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV)陽(yáng)性樣品采集自喀什、塔城等地區(qū)經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室收集、鑒定和保存。2022年從新疆博樂(lè)、喀什等地采集犢牛腹瀉臨床樣本共計(jì)168份,樣品放于-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建 選用NCBI中BNoV(登錄號(hào):OM991740)的RdRp和BRV(登錄號(hào):MN928486)的VP7基因序列,利用 DNAMAN 軟件進(jìn)行分析比對(duì),選擇高同源性的保守區(qū)域,利用NCBI Primer-BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)各設(shè)計(jì)1條引物,BNoV-F:5′-CCCAGATGGCCCTCTCAGTTCCA-AAGATCTCA-3′,BNoV-R:5′-TGTTCTCAATCCGGTCGCAA-3′;目的片段長(zhǎng)度為1 254 bp,BRV-F:5′-GGCTTTAAAAGCGAGAATTTCC-3′,BRV-R:5′-GGTCACATCATACAACTCTAAT-3′,目的片段長(zhǎng)度1 062 bp,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系:上下游引物各0.5 μL,2×Easytaq PCR SuperMix 12.5 μL,Nuclease-free Water 9.5 μL,cDNA 2 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,64 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min;瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的片段,純化后連接到pEASY-T1載體,并計(jì)算出pEASY-BNoV和pEASY-BRV的拷貝數(shù)分別為5.27×1010和1.12×1010copies·μL-1。

1.2.2 引物探針的設(shè)計(jì)及篩選 利用NCBI Primer-BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)針對(duì)RdRp和BRV的VP7基因設(shè)計(jì)多條特異性引物,反應(yīng)完成后,用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RAA產(chǎn)物,經(jīng)多次試驗(yàn)篩選,最后選擇了2組引物和探針用于后續(xù)試驗(yàn)。引物序列BNoV-F1:5′-CCCAGATGGCCCTCTCAGTTCCAAAGATCTCAG-3′,BNoV-R1:[5′-TAM]GTGAAATTCTGGGACTGCCCTATTCCAGGGTTG-3′,BNoV-P:[5′FAM]GGGCGA-GAGGTGGCCGTACGCCTCAATGACT[THF]GTAACTGCTACACTTTC[3′C3spacer],片段長(zhǎng)度為272 bp;BRV-F1:5′-GTTCCTCTTGCACAGTCAAAGTGTGTCCATTAAA-3′,BRV-R1:[5′-biotin]CAGCTGTGATGTCTAAAACGTTCGCACCAC-CTAC-3′,BRV-P:[5′FAM]CGTT-TGAAACAGTTGCAACGACGGAGAAACT[THF]GTGATTACAGATGTTGT[3′C3spacer],片段長(zhǎng)度為258 bp。

1.2.3 核酸提取 使用天根生化科技(北京)有限公司的病毒基因組RNA試劑盒提取BNoV陽(yáng)性樣本和BRV陽(yáng)性樣本。將20 μL Proteinase K加入1.5 mL離心管中,并加入200 μL平衡至室溫的肛拭子樣品。加入200 μL Carrier RNA工作液,渦旋混勻15 s。56 ℃孵育15 min。加入250 μL的無(wú)水乙醇,渦旋振蕩15 s,室溫靜置5 min。將離心管中的溶液全部轉(zhuǎn)移至過(guò)濾柱,8 000 r·min-1離心1 min,棄廢液。加500 μL緩沖液GD,8 000 r·min-1離心1 min,棄廢液。加600 μL漂洗液PW,靜置2 min,8 000 r·min-1離心1 min,棄廢液。重復(fù)上一步驟進(jìn)行二次漂洗。加500 μL無(wú)水乙醇,8 000 r·min-1離心1 min,棄廢液。12 000 r·min-1將空的過(guò)濾柱離心3 min。將過(guò)濾柱放入1.5 mL的離心管中,室溫放置3 min后,加入50 μL的RNase-Free ddH2O,室溫靜置5 min后,12 000 r·min-1離心1 min。保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 雙重RAA-LFD反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化 預(yù)試驗(yàn)反應(yīng)體系為50 μL,其中C buffer 20 μL,L buffer 5 μL,P-core 12 μL,dNTPs(25 mmol·L-1)0.6 μL,上、下游引物和探針稀釋至10 μmol·L-1,按照不同的配比進(jìn)行引物探針濃度的篩選,N-core 0.6 μL,DNA 模板3.8 μL,ddH2O 0.9 μL最后加B buffer 2.5 μL?；旌虾箅x心,放入恒溫設(shè)備中39 ℃孵育30 min。將10 μL RAA混合物加90 μL ddH2O混勻,吸取50 μL溶液直接滴加在樣品墊上,10 min后觀察質(zhì)控線與檢測(cè)線判讀結(jié)果。當(dāng)T1檢測(cè)線出現(xiàn)時(shí)表示樣品中含有BRV,當(dāng)T2檢測(cè)線出現(xiàn)時(shí)表示樣品中含有BNoV。確定引物探針濃度后,以標(biāo)準(zhǔn)品為模板,選擇不同的溫度條件(37～42 ℃)和不同時(shí)間條件(5、10、15、20、25、30 min)進(jìn)行反應(yīng),以確定最佳反應(yīng)條件。

1.2.5 特異性試驗(yàn) 以質(zhì)粒pEASY-BNoV(5.27×107copies·μL-1)、pEASY-BRV(1.12×107copies·μL-1),以及BCoV(4.13×107copies·μL-1)、BVDV(2.21×107copies·μL-1)、IBRV(3.20×107copies·μL-1)為模板進(jìn)行RAA擴(kuò)增,上樣量均3.8 μL,LFD檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果,并用ddH2O為模板作為陰性對(duì)照,以確定本方法的特異性。

1.2.6 靈敏度和重復(fù)性分析 以構(gòu)建的pEASY-BNoV和pEASY-BRV進(jìn)行10倍比稀釋,稀釋度選擇107、105、103、102、101copies·μL-1為模板進(jìn)行雙重RAA-LFD試驗(yàn),使用pEASY-BNoV和pEASY-BRV(稀釋度為107和105copies·μL-1)作為模板進(jìn)行3次雙重RAA-LFD試驗(yàn),以ddH2O為模板作為陰性對(duì)照。

1.2.7 臨床樣品檢測(cè) 采用建立的雙重RAA-LFD方法與PCR、qPCR方法檢測(cè)168份腹瀉樣本,并用ddH2O為模板作為陰性對(duì)照,以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作陽(yáng)性對(duì)照,比較3種檢測(cè)方法的符合性。

2 結(jié) 果

2.1 反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化

通過(guò)引物和探針的優(yōu)化,確定BNoV上、下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL,BRV上、下游引物(10 μmol·L-1)各2 μL,BNoV探針(10 μmol·L-1)0.3 μL,BRV探針(10 μmol·L-1)0.6 μL。結(jié)果顯示,試驗(yàn)的最佳反應(yīng)溫度為39 ℃(圖1A)。在最佳反應(yīng)溫度39 ℃的條件下,分別在5、10、15、20、25、30 min的不同反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果顯示,試驗(yàn)的最佳反應(yīng)時(shí)間為15 min(圖1B)。

AB A. 反應(yīng)溫度的優(yōu)化(1. 陰性對(duì)照;2. 37 ℃;3. 38 ℃;4. 39 ℃;5. 40 ℃;6. 41 ℃;7. 42 ℃);B. 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化(1. 5 min;2. 10 min;3. 15 min;4. 20 min;5. 25 min;6. 30 min;7. 陰性對(duì)照) A. Optimization of reaction temperature (1. Negative control; 2. 37 ℃; 3. 38 ℃; 4. 39 ℃; 5. 40 ℃; 6. 41 ℃; 7. 42 ℃); B. Optimization of reaction time (1. 5 min; 2. 10 min; 3. 15 min; 4. 20 min; 5. 25 min; 6. 30 min; 7. Negative control)圖1 RAA-LFD反應(yīng)條件的優(yōu)化Fig.1 Optimization of reaction conditions of RAA-LFD

2.2 特異性試驗(yàn)

雙重RAA-LFD特異性試驗(yàn)結(jié)果使用側(cè)流層析試紙條進(jìn)行分析。結(jié)果顯示(圖2),只有加入了相應(yīng)的病毒模板,試紙條檢測(cè)線才會(huì)出現(xiàn)紅色條帶,未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增,不存在交叉反應(yīng)。

1. BNoV和BRV;2. BRV;3. BNoV;4. BCoV;5. BVDV;6. IBRV;7. 陰性對(duì)照 1. BNoV and BRV; 2. BRV; 3. BNoV; 4. BCoV; 5. BVDV; 6. IBRV; 7. Negative control圖2 RAA-LFD的特異性試驗(yàn)Fig.2 Specificity test of RAA-LFD

2.3 敏感性及重復(fù)性試驗(yàn)

雙重RAA-LFD敏感性及重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果使用側(cè)流層析試紙條進(jìn)行分析。結(jié)果表明(圖3),BNoV和BRV的雙重RAA-LFD的敏感性均為103copies·μL-1。BNoV和BRV標(biāo)準(zhǔn)品分別使用107、105copies·μL-1兩個(gè)稀釋度的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品為模板,結(jié)果表明(圖4),該方法重復(fù)性良好。

1. 陰性對(duì)照;2. 107 copies·μL-1;3. 105 copies·μL-1;4. 103 copies·μL-1;5. 102 copies·μL-1;6. 101 copies·μL-1 1. Negative control; 2. 107 copies·μL-1; 3. 105 copies·μL-1; 4. 103 copies·μL-1; 5. 102 copies·μL-1; 6. 101 copies·μL-1圖3 RAA-LFD的敏感性試驗(yàn)Fig.3 Sensitivity test of RAA-LFD

AB A. 質(zhì)?？截悢?shù)為107 copies·μL-1 (1～3. 質(zhì)粒樣品;4. 陰性對(duì)照);B. 質(zhì)?？截悢?shù)為105 copies·μL-1 (1～3. 質(zhì)粒樣品;4. 陰性對(duì)照) A. The copy number of plasmids was 107 copies·μL-1 (1-3. Plasmids samples; 4. Negative control); B. The copy number of plasmids was 105 copies·μL-1 (1-3. Plasmids samples; 4. Negative control)圖4 RAA-LFD的重復(fù)性試驗(yàn)Fig.4 Repeatability test of RAA-LFD

2.4 雙重RAA-LFD臨床樣本檢測(cè)

用建立的雙重RAA-LFD方法檢測(cè)從牛場(chǎng)采集的腹瀉樣品168份,使用PCR和qPCR法分別檢出BNoV陽(yáng)性樣本70、85份,檢出BRV陽(yáng)性樣本40、71份,使用雙重RAA-LFD法檢出BNoV陽(yáng)性樣本82份,檢出BRV陽(yáng)性樣本41份,利用PCR方法和雙重RAA-LFD法檢測(cè)BNoV的陽(yáng)性符合率為98.57%,陰性符合率為87.86%,總符合率為92.26%;檢測(cè)BRV陽(yáng)性符合率為85.00%,陰性符合率為94.53%,總符合率為92.26%;利用qPCR方法和雙重RAA-LFD法檢測(cè)BNoV的陽(yáng)性符合率為91.76%,陰性符合率為96.39%,總符合率為94.05%;檢測(cè)BRV陽(yáng)性符合率為52.11%,陰性符合率為95.88%,總符合率為77.38%;表明本研究建立的雙重RAA-LFD方法可用于臨床樣品檢測(cè)。

3 討 論

BNoV和BRV在一些國(guó)家和地區(qū)的牛群中廣泛存在,感染會(huì)引起犢牛腹瀉導(dǎo)致嚴(yán)重脫水,并可能繼發(fā)感染加重疾病的嚴(yán)重程度[12],病毒性病原感染導(dǎo)致腹瀉較為嚴(yán)重。孫吉等[13]對(duì)川西北草原的220份犢牛腹瀉樣進(jìn)行檢測(cè),BNoV的檢出率為5.9%,BRV的檢出率高達(dá)40.5%,吳靜等[14]調(diào)查新疆喀什地區(qū)犢牛腹瀉情況,BNoV檢出率為25.07%,BRV檢出率9.37%,其混合感染率為24%。在新疆地區(qū),牛群養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大,病毒混合感染情況較為嚴(yán)重,單一病原診斷多耗時(shí)耗力,故需尋找針對(duì)多病原診斷且快速簡(jiǎn)便的方法。常用的病毒鑒定方法如PCR、qPCR和ELISA等在病毒檢測(cè)中準(zhǔn)確、可靠,但由于過(guò)程耗時(shí),操作繁瑣,無(wú)法實(shí)現(xiàn)基層腹瀉樣本的快速檢測(cè),因此本試驗(yàn)建立了一種可視化雙重RAA-LFD快速檢測(cè)方法。

RAA是具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù),可在恒溫下快速高效地?cái)U(kuò)增DNA序列,結(jié)合LFD可肉眼觀察擴(kuò)增結(jié)果,不需要熱循環(huán)器,只需要一個(gè)水浴鍋就可以進(jìn)行RAA反應(yīng)[15-16],與PCR、qPCR、ELISA、常規(guī)病毒分離和LAMP等方法相比,RAA技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)時(shí)間短[17],后來(lái)旺等[18]根據(jù)金黃色葡萄球菌的保守基因(nuc)建立RAA-LFD法,20 min即可檢測(cè)。王姝等[19]建立了現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)鯉皰疹病毒II型的RAA-LFD法,比RT-PCR法靈敏度高出10倍,該方法可在10 min看到目的片段的有效擴(kuò)增,由此可見(jiàn),RAA-LFD方法在細(xì)菌和病毒方面的快速檢測(cè)已經(jīng)全面發(fā)展。且RAA技術(shù)因其擴(kuò)增效率高、對(duì)設(shè)備要求低以及操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn),在病原檢測(cè)方面極具優(yōu)勢(shì)。近年來(lái),越來(lái)越多的研究者開(kāi)始關(guān)注雙重?zé)晒釸AA檢測(cè)方法的建立,吳江等[20]根據(jù)豬圓環(huán)病毒2型和3型的Cap基因建立了雙重?zé)晒釸AA檢測(cè)方法,周冬根等[21]建立了檢測(cè)漢坦病毒的雙重?zé)晒釸T-RAA技術(shù)。但關(guān)于同時(shí)檢測(cè)兩種病毒的RAA-LFD方法報(bào)道較少,且針對(duì)BNoV和BRV同時(shí)檢測(cè)尚未見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)在重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的基礎(chǔ)上建立了同時(shí)檢測(cè)BNoV和BRV的雙重RAA-LFD方法。最佳檢測(cè)時(shí)間為20 min,后來(lái)旺等[18]檢測(cè)金黃色葡萄球菌最短時(shí)間為20 min,說(shuō)明了其快速檢測(cè)的特點(diǎn);最佳的檢測(cè)溫度為39 ℃,與鄧春冉等[22]建立的鴨星狀病毒RT-RAA方法優(yōu)化溫度結(jié)果一致;且與BCoV、BVDV和IBRV無(wú)交叉反應(yīng),最低檢測(cè)限均為103copies·μL-1,可以看出此方法特異性較好;在臨床樣本檢測(cè)中,陽(yáng)性樣本符合率較高,且檢出陽(yáng)性樣本數(shù)與PCR的檢測(cè)結(jié)果基本一致。臨床樣品檢測(cè)結(jié)果也提示,BNoV在新疆犢牛腹瀉中感染率較高,需要持續(xù)關(guān)注BNoV的流行及其帶來(lái)的危害。

4 結(jié) 論

本研究應(yīng)用RAA-LFD技術(shù)構(gòu)建了對(duì)BNoV和BRV兩種病毒的快速診斷方法,經(jīng)過(guò)靈敏性、特異性及重復(fù)性試驗(yàn),驗(yàn)證其在39 ℃恒溫條件下20 min內(nèi)可以檢出,為基層地區(qū)快速檢測(cè)提供了可能性,為犢牛腹瀉流行的地區(qū)快速篩查、診斷和監(jiān)測(cè)提供了便利工具,有利于病毒感染早期診斷,及時(shí)治療,具有良好的應(yīng)用前景。