張 越,楊 超

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院,吉林 吉林 132011)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)是全球最常見的惡性腫瘤之一。在2020年全球報告了超過10 000例OSCC新發(fā)病例,導(dǎo)致5 000人死亡[1]。當(dāng)前用于治療OSCC的療法包括手術(shù)、化學(xué)療法和放射療法[2]。雖然在診斷和臨床治療的OSCC已經(jīng)取得進(jìn)展,但由于疾病的進(jìn)展和復(fù)發(fā),OSCC患者的5 a生存率仍然相對較低[3-4]。因此,確定潛在的生物標(biāo)志物對改善OSCC的預(yù)后和制定治療策略至關(guān)重要。

微小RNA(miRNA/miR)是一類非編碼RNA,轉(zhuǎn)錄后通過識別靶向mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)的互補(bǔ)序列調(diào)節(jié)基因表達(dá)[5-6]。miRNA在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要功能,包括發(fā)育、細(xì)胞增殖和凋亡[7-8]。研究[7,9-14]發(fā)現(xiàn),幾乎在多種癌癥中均觀察到miRNA的表達(dá)失調(diào),包括腎癌、結(jié)直腸癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌和乳腺癌等,miR-758-3p可以抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究[15-16]發(fā)現(xiàn),miR-758-3p通過靶向MDM2和MTER抑制肝細(xì)胞癌的進(jìn)展。miR-758-3p通過靶向MEPE調(diào)節(jié)子宮頸浸潤癌的發(fā)展。然而,目前尚未有研究報道m(xù)iR-758-3p在OSCC中的生物學(xué)功能。因此,本研究通過檢測miR-758-3p在OSCC中的表達(dá),探究miR-758-3p對CAL27細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響,旨在為OSCC的治療提供新的靶標(biāo)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

正常牙齦上皮細(xì)胞及OSCC細(xì)胞系(CAL27、SCC9和SCC25,上海斯信生物科技有限公司);miR-758-3p和miR-NC(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司);Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、BCA蛋白檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(深圳晶美生物工程有限公司);MMP2、MMP9抗體(北京中杉金橋生物試劑公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

在含有10%FBS的DMEM(Gibco; Thermo Fisher Scientific,Inc.)中培養(yǎng)HGE細(xì)胞和CAL27細(xì)胞;將HGE細(xì)胞和CAL27細(xì)胞接種于6孔板中,采用Lipofectamine 2000(Invitrogen)按照說明書轉(zhuǎn)染至相應(yīng)細(xì)胞內(nèi)。

1.3 RT-qPCR

應(yīng)用TRIzol(Invitrogen)提取總RNA;應(yīng)用NanoDrop分光光度計測定RNA純度和濃度;應(yīng)用BcaBest RNA PCR Kit(TaKaRa公司,日本)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA;應(yīng)用SYBR Green染料在BIO-RAD T100實時PCR系統(tǒng)上進(jìn)行定量RT-PCR(qRT-PCR),以確定基因表達(dá),使用2-ΔΔCt方法計算目的基因的表達(dá)水平。將U6 miRNA和GAPDH作為內(nèi)參,PCR引物由上海生工合成,引物序列見表1。

表1 qRT-PCR的引物序列Tab.1 Primer sequence of qRT-PCR

1.4 WST-1

將各組細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng),在48 h后加入10 μL的WST-1試劑,在溫度為37 ℃、5%CO2的恒定環(huán)境下孵育1 h,在4個時間點(0、24、48、72 h)應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測儀測定450 nm處的吸光度。

1.5 Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲試驗

細(xì)胞遷移試驗:將轉(zhuǎn)染后的CAL27細(xì)胞饑餓12～24 h后,收集細(xì)胞懸液,計數(shù)后加入Transwell小室,將Transwell小室放入24孔板; 24 h后拿出小室,去除培養(yǎng)基,用4%多聚甲醛固定15 min;0.1%結(jié)晶紫溶液染色15 min;取出小室,清洗干凈后,顯微鏡下觀察計數(shù)。

細(xì)胞侵襲試驗:先將Transwell小室的聚碳酸酯膜上室鋪上一層Matrigel基質(zhì)膠,之后重復(fù)細(xì)胞遷移試驗的步驟。

1.6 Western Blot印跡實驗

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后收集細(xì)胞,提取總蛋白。通過SDS-PAGE電泳分離蛋白,然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜,用5%脫脂奶封閉后,一抗TRIM44(1∶1 000)4 ℃孵育過夜,二抗(1∶5 000)室溫1 h。采用ECL發(fā)光液進(jìn)行顯色及成像分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 HGE細(xì)胞與OSCC細(xì)胞系中miR-758-3p的PCR表達(dá)情況

RT-qPCR結(jié)果表明,與HGE細(xì)胞比較,TSCC細(xì)胞系CAL27、SCC9和SCC15中miR-758-3p表達(dá)下調(diào)(P<0.05),其中CAL27細(xì)胞中miR-758-3p表達(dá)量最低,因此,選擇CAL27細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(見圖1)。

圖1 OSCC細(xì)胞系及HGE細(xì)胞中miR-758-3p表達(dá)水平Fig.1 Expression levels of miR-758-3p in OSCC cell lines and HGE cells

2.2 miR-758-3p過表達(dá)抑制OSCC細(xì)胞CAL27的增殖活性

將過表達(dá)miR-758-3p和miR-NC轉(zhuǎn)染至CAL27細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染后,細(xì)胞培養(yǎng)48 h,通過RT-qPCR驗證miR-758-3p的表達(dá)水平。RT-qPCR結(jié)果表明,與miR-NC組CAL27細(xì)胞中miR-758-3p表達(dá)水平(0.97±0.12)比較,miR-758-3p組表達(dá)水平(5.48±0.31)明顯增高(見圖2 a)。WST-1分析顯示,miR-758-3p過表達(dá)能顯著抑制CAL27細(xì)胞的活力(P<0.05)(見圖2 b)。

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2.3 miR-758-3p過表達(dá)能抑制OSCC細(xì)胞CAL27的遷移和侵襲

Transwell試驗結(jié)果顯示,與miR-NC對照組比較,miR-758-3p組細(xì)胞遷移數(shù)量顯著減少(P<0.05)(見圖3 a);與miR-NC對照組比較,miR-758-3p組細(xì)胞侵襲數(shù)量顯著減少(P<0.05)(見圖3 b)。

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2.4 miR-758-3p過表達(dá)對CAL27細(xì)胞中MMPs蛋白表達(dá)的影響

Western Blot結(jié)果顯示,與miR-NC組比較,miR-758-3p組CAL27細(xì)胞中MMP-2及MMP-9的蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)。見圖4。

a MMP-2與MMP-9蛋白表達(dá)水平

3 討 論

有研究[17-19]發(fā)現(xiàn),多種miRNA在健康人和OSCC患者之間存在差異表達(dá),miRNA在多種人類腫瘤的病理過程中起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。miRNA通過調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá),對各種細(xì)胞生物學(xué)功能產(chǎn)生影響,例如細(xì)胞生長、發(fā)育和增殖。同時,miRNA通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移[20],唾液miR-139-5p是OSCC治療反應(yīng)和復(fù)發(fā)評估很有價值的生物標(biāo)志物[18]。CALIN G A等[20]報道,miR-124-3p通過降解極光激酶A的mRNA可以抑制膀胱癌的生長和轉(zhuǎn)移。在OSCC進(jìn)展中有更多miRNA被作為診斷或預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)[18-19]。與正常組織比較,miR-758-3p在多種癌組織中的表達(dá)顯著降低,例如膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌等。本研究結(jié)果顯示,miR-758-3p在 OSCC細(xì)胞中呈低表達(dá),并且在CAL27細(xì)胞系中表達(dá)最低,提示miR-758-3p表達(dá)量與OSCC的病情進(jìn)展程度具有相關(guān)性。

為探究miR-758-3p在OSCC發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制,本研究將 miR-758-3p mimics轉(zhuǎn)染到CAL27細(xì)胞內(nèi),發(fā)現(xiàn)miR-758-3p過表達(dá)能顯著抑制CAL27細(xì)胞增殖,并降低其活性,還能降低CAL27細(xì)胞的遷移及侵襲的能力。Western Blot結(jié)果提示,miR-758-3p過表達(dá)可以明顯抑制CAL27細(xì)胞中MMP-2及MMP-9的蛋白表達(dá),提示miR-758-3p可能是OSCC潛在作用靶點,miR-758-3p在CAL27細(xì)胞中作為腫瘤抑制因子,可作為OSCC患者惡性程度的指標(biāo)之一。

綜上所述,miR-758-3p在OSCC細(xì)胞中呈低表達(dá),并且在CAL27細(xì)胞中表達(dá)最低,上調(diào)miR-758-3p可以抑制OSCC細(xì)胞的遷移和侵襲,表明miR-758-3p可能是OSCC治療的靶標(biāo)。