李慧杰,孫金龍,張鳴遠(yuǎn),王宏興,葛澤儒,龐久寅,夏富才

(1.吉林省木質(zhì)材料科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北華大學(xué)),吉林 吉林 132013;2.梅河口市山城鎮(zhèn)綜合行政執(zhí)法隊(duì),吉林 梅河口 135022;3.長春凈月經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)應(yīng)急管理局,吉林 長春 130000)

糠椴(Tiliaamurensis)隸屬椴樹科(Tiliaceae),主要生長在濕潤的山區(qū)和溫暖濕潤的平原地帶。由于具有顯著的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值,糠椴被認(rèn)為是一種可持續(xù)資源和環(huán)保原料[1]。木聚糖為普遍存在的半纖維素,是由β-1,4-糖苷鍵連接的多糖單元組成的能夠自然生物降解的大分子物質(zhì)[2-3],在環(huán)保方面展現(xiàn)出重大的應(yīng)用價(jià)值[4-5]。木聚糖存在于植物細(xì)胞的半纖維素組分中,具有綠色環(huán)保、有效抑制微生物、無刺激性和可生物降解等特性,展現(xiàn)出了優(yōu)異的抗菌性能[6]。

為高效開發(fā)與利用糠椴資源,本文采用堿提法提取木聚糖。堿提法是一種常用的木聚糖提取方法,能從糠椴中有效提取高純度木聚糖,可為后續(xù)研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。納米木聚糖是對(duì)木聚糖進(jìn)行納米級(jí)修飾后的產(chǎn)物,能充分發(fā)揮木聚糖的固有優(yōu)勢(shì)[7-8],主要體現(xiàn)在顯著增強(qiáng)機(jī)械性能,如抗拉強(qiáng)度、韌性和耐久性等,這些特性的顯著提升極大拓展了納米木聚糖在多種材料中的應(yīng)用。納米木聚糖具有良好的生物降解和環(huán)保特性[9-10],在多種材料生產(chǎn)過程中,采用納米木聚糖可以顯著降低與傳統(tǒng)塑料等不可生物降解材料相關(guān)的環(huán)境影響[11-12]。此外,相較于未經(jīng)修飾的木聚糖,納米木聚糖顯示出優(yōu)異的熱穩(wěn)定性,特別適用于需要高耐熱性材料的應(yīng)用場景,如電子和汽車行業(yè)[13]。納米木聚糖以其獨(dú)特的性質(zhì)和優(yōu)勢(shì),已經(jīng)成為被廣泛應(yīng)用的多功能材料[14]。本文通過堿提法從糠椴中提取木聚糖,通過二次堿液處理制備納米木聚糖,并采用響應(yīng)面法(RSM)[15-16]優(yōu)化納米木聚糖制備工藝[17],可為糠椴資源開發(fā)提供參考與支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

糠椴莖、葉,市場購買;木糖(化學(xué)純),二乙醇胺、氫氧化鈉(分析純),上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司;無水乙醇(工業(yè)級(jí)),3,5-二硝基水楊酸(化學(xué)純),無水乙醇、乙酸乙酯、無水甲醇(分析純),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;酒石酸鉀鈉、苯酚、鹽酸、硫酸、亞硫酸鈉、戊二醛,分析純,上海阿拉丁生物科技股份有限公司;馬來酸酐,分析純,濟(jì)南創(chuàng)科化學(xué)有限公司;對(duì)甲苯磺酸,分析純,上海源葉生物科技有限公司;3-氯-2-羥丙基三甲基氯化銨,分析純,上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋(HH-1),金壇市富華儀器有限公司;數(shù)顯多頭磁力加熱攪拌器(HJ-6A),常州市億能實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;分析天平(TG328A),上海天平儀器廠;電子萬用爐(DK-98-Ⅱ),天津市泰斯特儀器有限公司;高速離心機(jī)(HC-3514),安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;高速多功能粉碎機(jī)(HL-FS400),上海寰熙醫(yī)療器械有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱(DL102),天津市實(shí)驗(yàn)儀器廠;真空冷凍干燥機(jī)(BK-FD12T),山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司;納米激光粒度儀(Winner802),濟(jì)南微納儀器股份有限公司;電子顯微鏡(TM3030 plus),日本日立高新技術(shù)公司。

1.3 糠椴木聚糖提取

選擇無變質(zhì)糠椴,放入高速多功能粉碎機(jī)粉碎后用80目篩篩選,得到糠椴粉末。將糠椴粉末在索氏提取器中用95%乙醇溶液抽提12 h,除去蠟質(zhì),然后用去離子水洗滌,置于40 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中,干燥后取出。取糠椴粉末10 g放入燒杯中,加入150 mL 10%NaOH溶液,在90 ℃下浸提3 h,經(jīng)過抽濾得到提取液,調(diào)節(jié)pH為5,將3倍體積的乙醇加到剩余液體中進(jìn)行醇沉,將得到溶液放在4 ℃冰箱中12 h。濾去多余液體后,用高速離心機(jī)在8 000 r/min下離心10 min,重復(fù)3次,將得到的物質(zhì)放入真空冷凍干燥機(jī)中凍干。

1.4 木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別將0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液加到25 mL比色管中,加水至1.0 mL,再加入3 mL的3,5-二硝基水楊酸(DNS)溶液。在沸水浴下蒸煮5 min,冷卻至室溫,加水定容,搖勻,在520 nm處測定木糖溶液吸光度。以不含木糖的溶液作為對(duì)照,利用木糖的質(zhì)量濃度繪制吸光度曲線,最終確定木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 木聚糖得率測定

取一定量的木聚糖溶液,調(diào)pH至5.5,加入3倍體積的乙醇進(jìn)行醇沉,置于4 ℃冰箱中過夜,然后在高速離心機(jī)5 000 r/min下離心10 min,從離心管中濾去上清液,取其沉淀,加入一定量的0.1 mol/L HCl,于90 ℃水解2 h,中和、定容、過濾,測定濾液的還原糖質(zhì)量,乘以木聚糖聚合因數(shù)0.9作為木聚糖質(zhì)量,采用DNS法測定還原糖。木聚糖得率(%)=(m1/m2)×100%,式中:m1為提取的木聚糖質(zhì)量(g);m2為原料質(zhì)量(g)。

1.6 納米糠椴木聚糖制備

取1 g凍干的糠椴多糖粉末,加入200 mL的5%氫氧化鈉溶液中,在70 ℃下溶解,冷卻至室溫,使用稀鹽酸將pH調(diào)至5.5,倒入3倍體積的無水乙醇進(jìn)行醇沉。將沉淀物在索氏提取器中抽提1.5 h,抽提后,在真空冷凍干燥機(jī)冷凍干燥24 h,機(jī)械研磨得到淡黃色粉末,即為納米糠椴木聚糖。

1.7 粒徑測定

將制備的納米木聚糖在蒸餾水中充分溶解,超聲分散,利用納米激光粒度儀測定納米木聚糖粒徑。

1.8 響應(yīng)面法優(yōu)化工藝

依據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則,將納米木聚糖粒徑作為指標(biāo)設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面分析試驗(yàn),因素水平見表1。利用Design Expert 8.6軟件建立的二項(xiàng)式模型分析數(shù)據(jù),確定納米木聚糖最佳制備工藝參數(shù)。

表1 Box-Behnken 設(shè)計(jì)因素及水平

1.9 透射電鏡分析

利用HT7800型透射電子顯微鏡(TEM,加速電壓200 kV)對(duì)納米木聚糖粒子形態(tài)進(jìn)行觀測。取1滴分散在無水乙醇中的納米木聚糖溶液滴置于鋪有碳膜的銅網(wǎng)上,在溶劑揮發(fā)后進(jìn)行表征。

2 結(jié)果與分析

2.1 木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過分光光度法測定木糖標(biāo)準(zhǔn)樣品在520 nm波長的吸光度,根據(jù)已知木聚糖標(biāo)準(zhǔn)樣品的質(zhì)量濃度(x)和對(duì)應(yīng)的吸光度(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。建立的回歸方程為y=0.904 6x+0.004 5,線性相關(guān)系數(shù)R2=0.997 1,見圖1。

圖1 木聚糖質(zhì)量濃度與吸光度的回歸線性方程Fig.1 Regression linear equation of xylan mass concentration and absorbance

2.2 不同條件對(duì)木聚糖得率的影響

2.2.1 堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)木聚糖得率的影響

堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)木聚糖得率的影響見圖2。由圖2可見:當(dāng)堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí),木聚糖的得率最高;當(dāng)堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過10%時(shí),大部分木聚糖會(huì)隨著堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高而逐漸水解,可能是因?yàn)閴A液可以溶解植物細(xì)胞壁中的木聚糖,過高的堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)會(huì)使木聚糖發(fā)生堿解,斷裂β-1,4糖苷鍵,導(dǎo)致木聚糖鏈降解轉(zhuǎn)化為低聚木糖和單糖,從而降低了提取率。因此,從糠椴中提取木聚糖的最佳堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%。

2.2.2 固液比對(duì)木聚糖得率的影響

固液比對(duì)木聚糖得率的影響見圖3。由圖3可見:當(dāng)固液比(g/mL)由1∶5增加到1∶15時(shí),木聚糖得率大幅上升;當(dāng)固液比繼續(xù)增加到1∶20時(shí),得率僅僅提高了0.76%。當(dāng)固液比大于1∶15后,得率隨固液比提高的上升趨勢(shì)并不明顯,可能是當(dāng)固液比為1∶15時(shí),木聚糖在提取液中的溶解度已接近飽和。適量溶劑可以充分溶解和提取木聚糖,但過多的溶劑會(huì)導(dǎo)致溶液中的木聚糖濃度過低,從而降低了木聚糖從植物細(xì)胞壁向溶液內(nèi)部擴(kuò)散的濃度梯度,提取率下降。

圖2 堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)木聚糖得率的影響Fig.2 Effect of alkali concentration on the yield of xylan圖3 固液比對(duì)木聚糖得率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the yield of xylan

2.2.3 處理溫度對(duì)木聚糖得率的影響

處理溫度對(duì)木聚糖得率的影響見圖4。由圖4可見:當(dāng)處理溫度為90 ℃時(shí),木聚糖的得率最高,為42.65%。反應(yīng)溫度繼續(xù)提高,木聚糖得率大幅下降,這可能是因?yàn)槟揪厶堑姆€(wěn)定性會(huì)隨著溫度升高而降低,當(dāng)溫度持續(xù)上升時(shí),多糖結(jié)構(gòu)受到破壞,木聚糖鏈發(fā)生裂解,產(chǎn)生了大量的低聚糖、寡糖和單糖,導(dǎo)致木聚糖得率下降。因此,最佳處理溫度為90 ℃。

2.2.4 處理時(shí)間對(duì)木聚糖得率的影響

處理時(shí)間對(duì)木聚糖得率的影響見圖5。由圖5可見:處理時(shí)間在60～120 min時(shí),隨著處理時(shí)間的增加木聚糖的得率顯著提高;超過120 min后有小幅降低,這是因?yàn)楫?dāng)達(dá)到飽和狀態(tài)后,過長時(shí)間的處理會(huì)導(dǎo)致溶液中的木聚糖鏈發(fā)生降解,產(chǎn)生低聚物,導(dǎo)致木聚糖得率下降。當(dāng)處理時(shí)間為120 min 時(shí),木聚糖得率最大。因此,處理時(shí)間應(yīng)選擇120 min。

圖4 處理溫度對(duì)木聚糖得率的影響Fig.4 Effect of treatment temperature on yield of xylan圖5 處理時(shí)間對(duì)木聚糖得率的影響Fig.5 Effect of processing time on extraction yield of xylan

2.3 各因素對(duì)納米木聚糖粒徑的影響

2.3.1 堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)納米木聚糖粒徑的影響

堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)納米木聚糖粒徑的影響見圖6。由圖6可見:隨著堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高,納米木聚糖的粒徑呈現(xiàn)下降趨勢(shì),當(dāng)堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過3%時(shí),納米木聚糖的粒徑呈現(xiàn)大幅上升趨勢(shì),這可能是因?yàn)閴A液在木聚糖粒子納米化的過程中發(fā)揮著催化劑作用,當(dāng)堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時(shí),隨著堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高,對(duì)木聚糖粒子向納米木聚糖粒子的分解和轉(zhuǎn)化起著促進(jìn)作用;但當(dāng)堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高時(shí),會(huì)破壞木聚糖的長鏈結(jié)構(gòu),產(chǎn)生小分子物質(zhì),大部分木聚糖粒子在納米化的過程中受到阻礙,從而抑制了木聚糖粒子的分解速率。

2.3.2 處理溫度對(duì)納米木聚糖粒徑的影響

處理溫度對(duì)納米木聚糖粒徑的影響見圖7。由圖7可見:隨著處理溫度的提高,納米木聚糖的粒徑減小,當(dāng)處理溫度為60 ℃時(shí),粒徑為9.56 nm,達(dá)到最小值;當(dāng)處理溫度超過60 ℃時(shí),納米木聚糖的粒徑增大。這可能是因?yàn)楫?dāng)溫度較低時(shí),隨著溫度的升高,提高了大分子木聚糖粒子的反應(yīng)活性,從而促進(jìn)了大分子木聚糖粒子向小分子納米木聚糖粒子的轉(zhuǎn)化;當(dāng)溫度過高時(shí),納米木聚糖粒子在納米化的過程中表面能升高(吸收了大量熱能),為了降低表面能,大量新生的納米木聚糖粒子會(huì)發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象而達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。因此,當(dāng)溫度過高時(shí),納米木聚糖的粒徑反而出現(xiàn)上升的情況。

圖6 堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)納米木聚糖粒徑的影響Fig.6 Effect of alkali concentration on theparticle size of nanoscale xylan圖7 處理溫度對(duì)納米木聚糖粒徑的影響Fig.7 Effect of treatment temperature on particle size of nanoscale xylan

2.3.3 處理時(shí)間對(duì)納米木聚糖粒徑的影響

處理時(shí)間對(duì)納米木聚糖粒徑的影響見圖8。由圖8可見:隨著處理時(shí)間的增加,納米木聚糖的粒徑呈現(xiàn)變小的趨勢(shì)。但當(dāng)處理時(shí)間超過2 h時(shí),納米木聚糖的粒徑反而會(huì)大幅增加,這可能是因?yàn)楫?dāng)處理時(shí)間較短時(shí),木聚糖粒子活性較小,分解和轉(zhuǎn)化速率很慢;當(dāng)處理時(shí)間增加時(shí),木聚糖粒子逐漸納米化,粒徑達(dá)到最小,但如果處理時(shí)間過長,大量粒子會(huì)出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象,從而引起納米木聚糖的粒徑大幅上升[18]。

圖8 處理時(shí)間對(duì)納米木聚糖粒徑的影響Fig.8 Effect of processing time on the particle size of nanoscale xylan

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化糠椴納米木聚糖的提取工藝參數(shù)

2.4.1 試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

通過Design-Expert 8.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)回歸分析,得到二次回歸方程:y=9.63+0.11A+2.84B-2.55C+0.057AB+0.31AC+0.8BC+9.44A2+11.53B2+19.49C2.Box-Behnken 試驗(yàn)結(jié)果見表2,回歸模型方差分析見表3。表1給出了響應(yīng)面試驗(yàn)因素設(shè)計(jì);表2為根據(jù)表1參數(shù)設(shè)計(jì)記錄的17次試驗(yàn)結(jié)果,為建模和優(yōu)化提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ);表3驗(yàn)證了所建立的回歸模型具有良好的擬合效果和顯著性,可用于優(yōu)化確定最優(yōu)條件。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

2.4.2 響應(yīng)面分析

堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)和處理溫度對(duì)納米木聚糖粒徑的影響見圖9,處理溫度和處理時(shí)間對(duì)納米木聚糖粒徑的影響見圖10。由圖9、10對(duì)比可見,圖10建立的3D響應(yīng)面傾斜度最高,等高線顏色變深,說明處理時(shí)間和處理溫度的交互作用最為顯著,其他因素的主效應(yīng)不明顯。

圖9 堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)和處理溫度對(duì)納米木聚糖粒徑的影響Fig.9 Effect of alkali concentration and treatment temperature on particle size of nanoscale xylan

圖10 處理溫度和處理時(shí)間對(duì)納米木聚糖粒徑的影響Fig.10 Effect of treatment temperature and processing time on particle size of nanoscale xylan

為了進(jìn)一步驗(yàn)證不同因素對(duì)響應(yīng)值影響的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,我們對(duì)回歸方程系數(shù)進(jìn)行了顯著性檢驗(yàn)[19],結(jié)果見表4。表4檢驗(yàn)結(jié)果也顯示處理溫度B和處理時(shí)間C及其交互項(xiàng)BC對(duì)粒徑影響達(dá)極顯著水平(P<0.000 1),而堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)A和其交互項(xiàng)AB、AC的影響不顯著(P>0.05),這與響應(yīng)面分析結(jié)果一致,表明處理溫度和時(shí)間是決定納米木聚糖粒徑的主效應(yīng)因素。為確定響應(yīng)面模型的最優(yōu)點(diǎn),分析建立的回歸方程數(shù)據(jù),結(jié)果表明:當(dāng)處理溫度為58.74 ℃、處理時(shí)間為3.03 h、堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時(shí),納米木聚糖粒徑最小,為9.36 nm。

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

為了檢驗(yàn)試驗(yàn)的可靠性,在最佳制備條件下制備納米木聚糖。同時(shí),考慮到實(shí)際操作的方便性,將最佳制備條件調(diào)整為處理溫度59 ℃,處理時(shí)間2 h,堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%,在此處理?xiàng)l件下,納米木聚糖的粒徑為9.36 nm。如圖11所示(綠色代表通過率,紅色代表粒徑占比),在此優(yōu)化條件下經(jīng)過多次試驗(yàn)驗(yàn)證得到的納米木聚糖粒徑為9.58 nm,與納米木聚糖粒徑的理論值9.36 nm相比,相對(duì)誤差為2.2%。由此表明,試驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測吻合度較高,驗(yàn)證了響應(yīng)面法求解最優(yōu)點(diǎn)的準(zhǔn)確性,也表明優(yōu)化后的工藝條件能夠較好地控制產(chǎn)品粒徑,獲得粒徑較小、分布較均勻的納米木聚糖產(chǎn)品。因此,采用響應(yīng)面法優(yōu)化納米木聚糖最佳制備條件參數(shù)準(zhǔn)確、可靠,具有非常高的實(shí)用價(jià)值[20]。

圖11 納米木聚糖粒徑Fig.11 Nanometer xylan particle size

2.5 透射電鏡分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證納米木聚糖的粒徑,使用透射電子顯微鏡觀察納米木聚糖的形態(tài),并測量粒子大小,見圖12。圖12 a、b、c分別為納米木聚糖在500、200、200 nm下的透射電鏡圖像。

圖12 納米木聚糖TEM圖Fig.12 TEM image of nano xylan

由圖12可見:納米木聚糖粒子接近于圓狀的且形狀較規(guī)則;粒徑在20～40 nm,這一結(jié)果與粒徑測定結(jié)果相符;納米木聚糖粒子聚集在一起,這是因?yàn)楸砻婺芨?納米木聚糖發(fā)生了團(tuán)聚現(xiàn)象。

3 結(jié) 論

采用響應(yīng)面法對(duì)糠椴木聚糖的堿法提取與納米木聚糖制備工藝進(jìn)行了優(yōu)化。通過試驗(yàn)確定了糠椴木聚糖最佳提取工藝參數(shù),即以糠椴為原料,堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%,處理溫度為90 ℃,處理時(shí)間為3 h,固液比為1∶15(g/mL),在此條件下,能夠有效地從糠椴中提取出木聚糖;納米木聚糖的最佳制備工藝參數(shù)為處理溫度59 ℃,處理時(shí)間2 h,堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%,在此條件下得到的納米木聚糖粒徑為9.36 nm;通過透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),納米木聚糖呈現(xiàn)出接近于圓形的形態(tài),形狀規(guī)則,粒徑基本在20～40 nm,這個(gè)結(jié)果與納米激光粒度儀的粒徑測試結(jié)果相符合,證實(shí)了按照上述工藝制備的納米木聚糖的質(zhì)量和粒徑。

本研究驗(yàn)證了響應(yīng)面法在工藝參數(shù)優(yōu)化中的有效性,同時(shí)為從糠椴中提取木聚糖、制備納米木聚糖并確認(rèn)其粒徑提供了一種有效方法,具有一定的理論價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。