鄒 前,郭 曉,唐晨野,沈瑞林△

(1.浙江中醫(yī)藥大學嘉興學院聯(lián)培基地,浙江杭州 310053;2.嘉興市第二醫(yī)院泌尿外科,浙江嘉興 314000)

據(jù)調(diào)查,2020年,全世界估計有1 930萬新發(fā)癌癥病例(不包括非黑色素瘤皮膚癌)和近1 000萬癌癥死亡病例(不包括非黑色素瘤皮膚癌),前列腺癌發(fā)病率位于所有癌癥發(fā)病率第4位。在男性中,前列腺癌發(fā)病率僅次于肺癌,居第2位,死亡率則位于第5位[1],尋找一種能夠準確診斷前列腺癌的方法十分重要。

1 現(xiàn)有前列腺癌診斷方法缺陷及代謝組學研究方法概述

當前,臨床上最常用的前列腺癌篩查手段是血清前列腺特異性抗原(prostate-specific antigen,PSA)、PSA相關(guān)指標及經(jīng)直腸或會陰超聲引導的穿刺活檢。然而,以上方法進行的前列腺癌篩查均存在局限性:(1)PSA檢測的靈敏度低,且不能很好地區(qū)分前列腺良、惡性增生。ILIC等[2]的研究表明,在PSA≤4 ng/mL的男性中,約15%的患者可為假陰性并在隨后的時間里診斷為前列腺癌,在這其中,約2%為高級別癌。另有研究發(fā)現(xiàn),PSA篩查主要發(fā)現(xiàn)分化良好的前列腺癌,而一些分化差、更致命的前列腺癌患者PSA水平往往正常[3]。(2)PSA檢測的特異性低,這意味著患者可能進行不必要的重復性穿刺活檢[4]。PSA篩查可能降低前列腺癌死亡風險,但與假陽性結(jié)果、過度診斷有關(guān)[5]。因此,現(xiàn)有的前列腺癌早期篩查,仍待進一步發(fā)掘靈敏度和特異性更高的生物標志物。

代謝組學是測定一個生物或細胞內(nèi)所有小分子組成并描繪其動態(tài)變化,組成代謝圖譜,以尋找相關(guān)代謝物改變與疾病發(fā)生、發(fā)展的對應(yīng)關(guān)系的方法。代謝組學可檢測上游生化活動產(chǎn)生的小分子終產(chǎn)物集合,是比基因組學、轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學更下游的生理活動體現(xiàn)[6]。在前列腺癌的研究中,代謝譜被越來越多地用作識別預測、診斷和預后生物標志物的手段。前列腺癌細胞在糖酵解、三羧酸循環(huán)、脂肪酸代謝和尿素代謝等方面具有獨特的代謝轉(zhuǎn)化特征[7]。代謝組學研究過程由三部分組成,分別是樣品的收集和制備、代謝物檢測、數(shù)據(jù)挖掘和提取。

樣品的收集和制備通常使用的是生物體液或組織,其中,在泌尿系統(tǒng)腫瘤研究中較常用到的標本是尿液、血液、精液及手術(shù)后組織。代謝物檢測方法主要是核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)技術(shù)和質(zhì)譜(mass spectrum,MS)技術(shù)。NMR特別適合于具有臨床潛力的代謝組學研究,因為每個樣品的成本低,無需衍生化,各實驗室間的重現(xiàn)性高,并且能夠量化和識別已知和未知代謝物。NMR特別適用于復雜溶液(血漿、血清、尿液等)的表征檢測[8]。在使用MS之前,氣相色譜(gas chromatography,GC)或液相色譜(liquid chromatography,LC)需要衍生化,并對代謝物進行預分離。近年來多使用的氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrum,GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatography-mass spectrum,LC-MS)聯(lián)用技術(shù)可提高檢測的效率、靈敏度和選擇性。數(shù)據(jù)挖掘和提取的方法主要包括層次聚類分析(hierarchical cluster analysis,HCA)、主成分分析(principal component analysis,PCA)、偏最小二乘差分分析(partial least squares-discriminant analysis,PLS-DA)等。以上分析方法可以通過發(fā)現(xiàn)因變量之間的內(nèi)在聯(lián)系從而簡化數(shù)據(jù),提供數(shù)據(jù)的可視化顯示并與相關(guān)代謝庫中的代謝物質(zhì)進行比對,比如人類代謝組數(shù)據(jù)庫、代謝物鏈接數(shù)據(jù)庫、京都基因和基因組百科全書、麥迪遜代謝組學聯(lián)盟數(shù)據(jù)庫等[4]。

2 糖代謝

糖類物質(zhì)為生命活動提供能量和碳源,并通過中間代謝產(chǎn)物和脂肪代謝、氨基酸代謝相聯(lián)系。

2.1 糖酵解和Warburg效應(yīng)

Warburg效應(yīng)指某些增生活躍的組織(比如腫瘤細胞)在有氧條件下仍通過糖酵解生成乳酸,從而避免碳源全部分解為二氧化碳,為腫瘤的增殖積累原料。葡萄糖和乳酸是癌癥Warburg效應(yīng)核心。臨床上,18F-脫氧葡萄糖正電子發(fā)射斷層掃描就是利用了這一特點,即注入的放射性標記葡萄糖被腫瘤細胞以更高的速率吸收,然后可以在成像中檢測到。然而有研究表明,早期前列腺癌依賴脂質(zhì)和其他能量分子產(chǎn)生能量,而不是有氧呼吸。因此,Warburg效應(yīng)在前列腺癌的發(fā)病機制中并不一致,因為這些細胞葡萄糖攝取并未增加。只有在發(fā)生許多突變事件的晚期,前列腺癌才會開始表現(xiàn)出Warburg效應(yīng)并具有高糖攝取[9]。HEVIA等[10]利用褪黑素影響前列腺癌糖酵解的實驗也證實了這一點。以上早期前列腺癌細胞的生物學行為,與下文所述的前列腺癌細胞使三羧酸循環(huán)增強相符。

2.2 三羧酸循環(huán)

GISKE?DEG?RD等[11]的研究結(jié)果認為:經(jīng)直腸超聲引導活檢的高分辨率魔角旋轉(zhuǎn)磁共振光譜儀分析有可能成為一種額外的診斷工具。他們通過手術(shù)標本研究發(fā)現(xiàn),檸檬酸鹽和精胺濃度降低及臨床應(yīng)用的“總膽堿+肌酸+多胺/檸檬酸鹽”比率增加被證明是前列腺癌侵襲性的有效組織生物標志物,且代謝譜與格里森評分(Gleason score,GS)相關(guān)。健康人群組和前列腺癌組分離的正確率為86.0%。檸檬酸鹽濃度可將含有GS=6分的標本與GS≥7分的標本區(qū)分開,而精胺濃度的差異僅在GS=6分和GS≥8分間。GS=7分和GS為8～9分的標本的代謝產(chǎn)物差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),這表明GS=7分(中等風險患者)的標本的代謝模式與高級別癌癥相似。

另有研究表明,檸檬酸合酶的上調(diào)和活化與前列腺癌細胞侵襲性增強有關(guān)。前列腺癌組織中檸檬酸合酶的表達水平高于正常前列腺組織。檸檬酸合酶表達上調(diào)與高GS、晚期病理分期和生化復發(fā)相關(guān)。在功能上,檸檬酸合酶表達的升高促進體外前列腺癌細胞增殖、集落形成、遷移、侵襲能力和加快細胞周期,并在體內(nèi)促進腫瘤生長。此外,檸檬酸合酶上調(diào)對前列腺癌細胞的脂質(zhì)代謝和線粒體功能具有潛在的增強作用[12]。除此之外,還有基于尿液的代謝組學研究表明,尿液中檸檬酸鹽、3-羥基苯乙酸鹽和色氨酸的改變與癌癥pT2向T3期進展有關(guān)。再有,三羧酸循環(huán)代謝產(chǎn)物草酰乙酸和富馬酸有助于產(chǎn)生天冬氨酸,天冬氨酸是核苷酸生物合成的底物[8]。

3 脂肪代謝

脂質(zhì)在多種生物功能和細胞過程中發(fā)揮重要作用,包括膜組成、能量代謝和信號轉(zhuǎn)導。

3.1 脂肪酸代謝

MARKIN等[13]使用血漿標本,基于GC-MS、LC-MS聯(lián)用技術(shù),采取定向和非定向代謝組學的方法分析得出,油酸是區(qū)分前列腺癌與前列腺上皮內(nèi)瘤變(prostatic intraepithelial neoplasia,PIN)和正常前列腺的唯一代謝物。而PIN主要表現(xiàn)為類固醇生成和花生四烯酸代謝的改變[13]。另有研究表明,在3種雄激素受體抵抗性細胞系中,棕櫚酸酯、油酸鹽和硬脂酸鹽的碳13富集顯著高于前列腺癌細胞,表明在激素抵抗細胞中由糖酵解驅(qū)動的從頭脂肪酸合成增加,這可能與晚期前列腺癌Warburg效應(yīng)有關(guān)。而3種耐藥細胞系均表現(xiàn)出大量甘油三酯持續(xù)積聚,尤其是鞘脂和多不飽和脂肪酸[14]。此外,癌細胞還可以通過分解循環(huán)乳糜微粒和脂蛋白中的甘油三酯,從循環(huán)中獲取脂肪酸[15]。

脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase,FASN)是癌細胞從頭合成脂肪酸的第一步所需的酶。過去大量研究集中在設(shè)計或重新設(shè)計FASN抑制劑,以阻止癌細胞產(chǎn)生自身脂質(zhì)的能力[16-17]。

3.2 磷脂代謝與膽固醇代謝

BURCH等[18]得出了磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和甘油磷脂酰肌醇在前列腺癌細胞中增加的結(jié)論。他們的研究顯示:轉(zhuǎn)移性細胞和正常細胞間最明顯的差異出現(xiàn)在磷脂酰乙醇胺類和甘油磷脂酰肌醇類。與非惡性和原發(fā)性腺癌細胞比較,骨轉(zhuǎn)移性前列腺癌中7種已鑒定磷脂的表達水平明顯增加。他們認為,磷脂代謝異常和改變很可能與惡性轉(zhuǎn)化、致瘤性、轉(zhuǎn)移和侵襲性前列腺癌疾病進展有關(guān)。BUSZEWSKA-FORAJTA等[19]基于前列腺癌組織的定向脂質(zhì)組學研究結(jié)果也表明,前列腺癌組織磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿、鞘磷脂和磷脂酰乙醇胺表達水平較正常前列腺組織增加。他們推測磷脂水平的總體增加與前列腺癌的進一步進展及對磷脂的需求增加有關(guān)。此外,根據(jù)BLOMME等[14]的研究,多種神經(jīng)酰胺和心磷脂衍生物也在耐藥(去勢抵抗)的前列腺癌細胞系中富集,而幾類磷脂,如磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺衍生物,相比之下卻在普通前列腺癌中的比例較高。

THYSELL等[20]使用GC-MS進行血漿樣品掃描,并使用化學計量學及生物信息學方法進行數(shù)據(jù)分析,得出結(jié)論:前列腺癌骨轉(zhuǎn)移患者病灶處骨組織中平均膽固醇水平為127.30 mg/g,上述患者轉(zhuǎn)移灶旁的正常骨組織中平均膽固醇水平為35.85 mg/g(P=0.001 0),而其他來源的骨轉(zhuǎn)移瘤患者(如乳腺癌、腎癌骨轉(zhuǎn)移等)骨組織中平均膽固醇水平為81.06 mg/g(P=0.000 2),這說明前列腺癌骨轉(zhuǎn)移患者骨病灶處膽固醇水平更高,顯示出其特有的代謝組學特征。此外,前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的免疫組織化學染色顯示腫瘤上皮細胞中的羥基甲基戊二酰輔酶還原酶、低密度脂蛋白受體和B類1型清道夫受體在骨病灶處轉(zhuǎn)移癌上皮細胞、內(nèi)皮細胞、免疫細胞強烈染色,表明膽固醇內(nèi)流和從頭合成的可能性較大。

4 氨基酸代謝

氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位,各類免疫細胞、免疫因子及腫瘤免疫微環(huán)境的組成都離不開氨基酸的合成和代謝。近年來,隨著分子生物學的發(fā)展,與腫瘤相關(guān)的基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、代謝組學不斷發(fā)展。氨基酸的代謝組學為研究腫瘤的基因、RNA及細胞信號轉(zhuǎn)導通路提供了新的方法。

4.1 一碳單位相關(guān)氨基酸

一碳單位在嘌呤嘧啶合成過程中不可或缺。一碳單位主要來自絲氨酸、色氨酸、組氨酸、甘氨酸分解代謝,而蘇氨酸也可以轉(zhuǎn)變?yōu)楦拾彼岙a(chǎn)生一碳單位。YANG等[21]收集了50例前列腺癌患者和50例非癌癥個體(對照組)的尿液樣本?；跉浜舜殴舱?1Hydrogen-nuclear magnetic resonance,1H-NMR)分析,鑒定出20種代謝物。通過PCA、PLS-DA和正交PLS-DA尋找代謝物,以區(qū)分前列腺癌和正常前列腺組織。他們還采用Wilcoxon試驗發(fā)現(xiàn)兩組間的尿液代謝物水平存在差異,即胍乙酸、苯乙酰甘氨酸和甘氨酸在前列腺癌中明顯增加,而L-乳酸和L-丙氨酸明顯減少。這3種增加的代謝物在按GS=6分和GS≥7分分層的患者中顯示出統(tǒng)計學差異,表明它們可能用于檢測嚴重的前列腺癌。通過使用京都基因和基因組百科全書及小分子途徑數(shù)據(jù)庫進行的途徑富集分析也揭示了“甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝”在前列腺癌中的潛在參與。

另外,有對血漿中代謝物的研究顯示,在PIN和前列腺癌中受影響的途徑是甘氨酸和絲氨酸代謝,甘氨酸增加與前列腺癌細胞的侵襲性有關(guān)[13,22]。然而也有研究表明高濃度甘氨酸也與適度降低前列腺癌風險有關(guān)[23]。BRUZZONE等[8]基于1H-NMR分析所得的前列腺癌患者尿液中組氨酸水平較健康者減少,這與GAMAGEDARA等[24]使用LC-MS檢測獲得的報告一致。有學者對組氨酸相關(guān)代謝物4-咪唑乙酸鹽的研究顯示其在前列腺癌患者的尿液中也被報告為下調(diào)[4]。FALEGAN等[25]則是在前列腺癌和良性增生患者精液中采用1H-NMR和正交PLS-DA的方法對上述人群進行比較,得出結(jié)論:氨基酸水平(尤其是賴氨酸和絲氨酸)的變化及糖酵解中間產(chǎn)物的變化是健康對照組和前列腺癌組之間、GS=6分和GS=7分標本之間最顯著的代謝特征。這表明賴氨酸和絲氨酸水平可能區(qū)分GS=6分和GS=7分的前列腺癌患者。再有,由甘氨酸為骨架合成的含硫氨基酸肌氨酸被認為是預測前列腺癌復發(fā)最有希望的候選標志物之一,其余標志物還有磷酰膽堿、肌醇、精胺、谷氨酸、半胱氨酸、膽堿、谷氨酰胺和脂質(zhì)[26]。SREEKUMAR等[27]分離出肌氨酸作為良性增生和前列腺癌組織標本間的差異代謝物,并進行了進一步實驗,表明:不僅癌癥組織中的肌氨酸水平增加,患者轉(zhuǎn)移灶組織中的肌氨酸水平也進一步增加。

4.2 尿素循環(huán)

如前Warburg效應(yīng)所述,根據(jù)BRUZZONE等[8]基于尿液的1H-NMR分析,表明尿液中尿素循環(huán)和糖酵解所產(chǎn)生的代謝物減少,這有力地支持了前列腺癌減少氮和碳廢物以最大限度地利用以支持癌細胞生長的合成代謝的理念。尿液中這種代謝物的減少意味著前列腺癌細胞減少了氮廢物的產(chǎn)生,并最大限度地將氮捕獲和固定到生物分子中,以支持癌癥的生長。

精氨酸是參與尿素循環(huán)的重要氨基酸,精氨酸的高可用性供應(yīng)是前列腺癌組織持續(xù)生長所必需的。因此,它已成為一個潛在的治療目標[28]。精氨酸可被3種酶降解:精氨酸酶、精氨酸脫羧酶和精氨酸脫胺酶。精氨酸可以由鳥氨酸合成,鳥氨酸則是尿素循環(huán)的關(guān)鍵成分。鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶催化氨甲酰磷酸和鳥氨酸生成瓜氨酸,瓜氨酸隨后通過精氨琥珀酸合酶轉(zhuǎn)化為精氨酸。體外實驗表明,普通前列腺癌細胞系產(chǎn)生的鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶水平較低,而在鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶缺乏的情況下,利用重組人精氨酸酶消除細胞外精氨酸并可導致細胞內(nèi)精氨酸的消耗。

此外,精氨酸脫氨酶也已成為治療前列腺癌的一種常用方法,體外研究表明,精氨酸脫氨酶可以通過饑餓精氨酸細胞殺死易感癌細胞。在Ⅱ期臨床試驗中,精氨酸剝奪與精氨酸脫氨酶聯(lián)合治療癌癥患者的研究正在進行中[29-30]。

4.3 芳香族氨基酸

芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸,其中酪氨酸可以轉(zhuǎn)變?yōu)閮翰璺影?也可以轉(zhuǎn)變?yōu)榧谞钕偌に亍ARKIN等[13]對血漿標本研究還發(fā)現(xiàn),PIN和前列腺癌中的酪氨酸和苯丙氨酸較健康者也明顯增加。富集分析表明,在PIN和前列腺癌中,兒茶酚胺生物合成和甲狀腺激素合成受到高度影響。還有證據(jù)表明甲狀腺激素也與癌癥間存在潛在聯(lián)系[31]。對于兒茶酚胺及其受體與前列腺癌的關(guān)系,有如下研究。ALASKAR等[32]的最新實驗發(fā)現(xiàn),腺苷酸環(huán)化酶/蛋白激酶A是前列腺癌的一個主要的信號通路,體外應(yīng)用10倍摩爾量的β2受體阻滯劑普萘洛爾30 min可抑制前列腺癌細胞的蛋白激酶A底物磷酸化,從而抑制前列腺癌的增殖。此外,兒茶酚胺可通過激活α1腎上腺素受體參與前列腺細胞功能的控制,交感神經(jīng)活動的增加與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。故COLCIAGO等[33]提出了一個前列腺癌激素治療的新靶點,即α1腎上腺素受體。他們所研究的針對該受體的藥物經(jīng)實驗證實對前列腺癌細胞有劑量依賴性的抗增殖作用,可能涉及誘導G0/G1細胞分裂周期的阻滯,但其不涉及細胞凋亡。針對同樣的靶點,MAESTRI等[34]的研究則是通過改變α1腎上腺素受體阻滯劑多沙唑嗪的化學結(jié)構(gòu),以增加新藥物抑制細胞增殖的能力,并可以誘導前列腺癌細胞凋亡。

5 小結(jié)與展望

代謝組學是發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)標志物的寶貴工具,因為生物體液中代謝物水平的變化反映了個體生理狀態(tài)的變化[35-36]。該方法可用于了解腫瘤代謝途徑,前列腺癌的早期檢測、預后分層和治療反應(yīng)監(jiān)測,這些代謝標志物可能在未來前列腺癌的早期診斷和治療中起到至關(guān)重要的作用[37]。然而,代謝組學的臨床應(yīng)用受到多方面因素限制:(1)代謝組學對于早期前列腺癌往往有很高的靈敏度,但特異度缺乏。例如,某些非癌癥疾病,包括肝病、炎癥性腸病或類風濕性關(guān)節(jié)炎,也可以顯示出與癌癥相同的代謝產(chǎn)物的水平升高[38]。不同腫瘤可能有相同的代謝途徑,例如,在乳腺癌、食管癌、肺癌和腎癌也發(fā)現(xiàn)了肌氨酸的升高,說明肌氨酸在前列腺癌細胞中的升高并不特異[20]。(2)代謝組的動態(tài)性質(zhì)常常受到諸如飲食、藥物、活動水平、壓力和晝夜變化等因素影響,所以還需要對關(guān)鍵代謝產(chǎn)物或代謝途徑的基線變異性進行更深入的了解[39]。(3)用于代謝組學分析的儀器成本較大。例如,對于MS而言,即使是提供最基本的低分辨率測量的通用“低成本”質(zhì)譜儀,其成本也超過10萬美元,而最先進的高分辨率儀器的成本往往超過50萬美元,除此之外,儀器維護費用和聘請專業(yè)的技術(shù)人員將進一步增加成本[40]。綜上所述,前列腺癌的代謝組學研究在主動監(jiān)測和治療后監(jiān)測中都有很大的應(yīng)用潛力,但如何解決諸多臨床應(yīng)用方面的問題,仍有待進一步探索。