金露梅與珠芽蓼草粉對(duì)模擬瘤胃體外發(fā)酵的影響

薛世魁 金珍 王雪酈

摘要：以6頭體重35 kg左右、安裝永久性瘤胃瘺管的健康羯羊?yàn)榱鑫敢汗w動(dòng)物，用持續(xù)人工瘤胃裝置（RUSITEC），基礎(chǔ)日糧混合料為底物進(jìn)行體外發(fā)酵試驗(yàn)，研究添加富含植物次生代謝物的金露梅與珠芽蓼草粉對(duì)瘤胃發(fā)酵的影響，以篩選天然飼料添加劑。結(jié)果表明，基礎(chǔ)日糧中添加10%金露梅和10%珠芽蓼草粉與普通基礎(chǔ)日糧之間，發(fā)酵液pH、甲烷、揮發(fā)性脂肪酸的產(chǎn)生量及干物質(zhì)消失率差異均不顯著（P > 0.05），但有降低甲烷產(chǎn)量、提高干物質(zhì)消化率的趨勢(shì)。因此，在本試驗(yàn)條件下，添加10%金露梅和10%珠芽蓼草粉對(duì)瘤胃發(fā)酵的作用不顯著，不適合做飼料添加劑。

關(guān)鍵詞：植物次生代謝物；體外模擬瘤胃發(fā)酵；金露梅；珠芽蓼；草粉

中圖分類(lèi)號(hào)：S816.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-1463（2018）02-0063-06

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2018.02.017

Effects of Grass Powder of Potentilla fruticosa L. and Polygonum viviparum L. on Simulated Rumen Fermentation in Vitro

XUE Shikui 1， JIN Zhen 2， WANG Xueli 1

（1. Animal Health Supervision Institute， Chengguan District， Lanzhou Gansu 730000， China； 2. Animal Disease Prevention and Control Center， Chengguan District， Lanzhou Gansu 730000， China）

Abstract：The 6 healthy wether， weight about 35 kg， was fitted with permanent rumen fistula as rumen fluid donor， with continuous artificial rumen device （RUSITEC）. Basic diet mixture as a substrate in vitro fermentation experiment， the study was done to add grass powder of Potentilla fruticosa L. and Polygonum viviparum L. rich in plant secondary metabolites on rumen fermentation in RUSITEC， with screening of natural feed additives. The results show that the yield and dry matter disappearance rate of fermentation liquid pH，methane and volatile fatty acid had no significant difference （P > 0.05） between basic diets supplemented with grass powder of 10% Potentilla fruticosa L. and 10% Polygonum viviparum L. and ordinary diet， but there is a trend to increase the dry matter degradation and decrease the methane production. Therefore， under the conditions of this experiment， the effect of adding grass powder of grass powder of 10% Potentilla fruticosa L. and 10% Polygonum viviparum L. on rumen fermentation was not significant， it is not suitable to choose as a feed additive.

Key words：Plant secondary metabolites；Simulated rumen fermentation in vitro；Potentilla fruticosa L.；Polygonum viviparum L.；Grass powder

提高飼料轉(zhuǎn)化率，一直是動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)家關(guān)注的最重要問(wèn)題之一。在反芻動(dòng)物瘤胃厭氧發(fā)酵過(guò)程中，甲烷的產(chǎn)生意味著飼料能量損失和對(duì)環(huán)境產(chǎn)生溫室效應(yīng)。因此，在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中，如何減少瘤胃甲烷排放，提高瘤胃發(fā)酵效率，不僅關(guān)系到飼料利用效率，而且也與維護(hù)大氣環(huán)境有關(guān)，這已是反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究的一個(gè)重要方向[1 ]。然而，至今人們找到唯一有效降低瘤胃甲烷的化學(xué)抑制劑是離子載體，它可抑制供給甲烷形成所需的氫氣[2 ]，減少甲烷排放量高達(dá)25%[3 ]。但自2006年歐盟各國(guó)限制應(yīng)用抗生素類(lèi)添加劑以來(lái)，綠色飼料添加劑越來(lái)越受到廣泛的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，具有特殊生物活性的植物次生代謝物，動(dòng)物所采食雖然富含這些化合物的飼草料不一定能提供營(yíng)養(yǎng)，但會(huì)影響動(dòng)物的消化、代謝過(guò)程[4 ]，調(diào)控瘤胃發(fā)酵模式，提高氮存留，減少甲烷排放[5 ]；一些酚類(lèi)化合物、精油和絲蘭皂甙具有抗菌活性，還可替代抗生素作飼料添加劑[6 ]，所以，在生產(chǎn)實(shí)踐中若能科學(xué)合理地利用植物次生代謝物，將提高飼料利用率，改變瘤胃發(fā)酵模式和產(chǎn)物，最終提高宿主動(dòng)物生產(chǎn)性能[7 ]。含有高濃度次生代謝化合物的植物也許將是最有潛力的候選添加 劑[3 ]，在瘤胃調(diào)控中將有更廣的研究與應(yīng)用前 景[7 ]。

目前，有人已對(duì)一些植物進(jìn)行了測(cè)試，研究了植物性添加劑對(duì)瘤胃發(fā)酵調(diào)控和降低甲烷產(chǎn)量的可能性[8 ]。然而，此類(lèi)天然綠色添加劑的研發(fā)，需要繼續(xù)進(jìn)行大量體外篩選工作[6， 9 ]?；谥参锎紊x物的特殊生物活性，富含這些化合物的植物將被選做候選添加劑[8 ]。在我國(guó)青藏高原地區(qū)，由于其特殊的地理環(huán)境，牧草含有較多植物次生代謝物[10 ]。其中金露梅與珠芽蓼是該區(qū)兩種常見(jiàn)植物，也是藏藥原料成分，生物堿類(lèi)、黃酮類(lèi)、皂苷類(lèi)、甾醇類(lèi)、植物精油、單寧等含量較高[11 - 12 ]。我們利用持續(xù)人工瘤胃裝置，研究添加金露梅與珠芽蓼兩種草粉對(duì)瘤胃發(fā)酵和甲烷產(chǎn)量的影響，以探討其是否適于選做天然綠色添加劑。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)所用日糧各種原料由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院科研訓(xùn)練基地提供。金露梅與珠芽蓼于其生長(zhǎng)季的7月底采自甘肅省天?？h海拔 3 450～3 500 m的金強(qiáng)河高山草地。采樣時(shí)隨機(jī)剖出10個(gè)1 m×1 m的樣方框，采集開(kāi)花期金露梅嫩枝葉和開(kāi)花前期珠芽蓼地上部，采后稱鮮重，置于105 ℃烘箱中烘5 min迅速殺青，之后在70 ℃烘干至恒重后經(jīng)粉碎過(guò)1 mm篩備用。所用體外模擬發(fā)酵裝置為2010年日本生產(chǎn)的持續(xù)動(dòng)態(tài)人工瘤胃裝置RUSITECH（R-S，Shina-gawa）。

1.2 試驗(yàn)方法

采用完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將金露梅和珠芽蓼草粉以配合飼料中添加劑最高比例10%的標(biāo)準(zhǔn)添加。分3組，分別為對(duì)照組（CK）（基礎(chǔ)日糧）、處理1（金露梅替換10%的基礎(chǔ)日糧）、處理2（珠芽蓼替換10%基礎(chǔ)日糧）。基礎(chǔ)日糧參照《中國(guó)美利奴育成公羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》，以綿羊日增重為50 g對(duì)能量和蛋白質(zhì)需要量配制試驗(yàn)日糧配方（表1）。精料由玉米和豆粕組成，粗料為苜蓿干草和小麥秸稈，精粗質(zhì)量比為40∶60。人工瘤胃試驗(yàn)營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）為：干物質(zhì)901.4 g/kg、粗蛋白93.2 g/kg、消化能8.48 MJ/kg、鈣4.0 g/kg、磷1.8 g/kg。

1.3 人工瘤胃

1.3.1 緩沖溶液配制 人工瘤胃緩沖溶液按McDougall配方配制：NaHCO3 9.8 g/L、Na2HPO4·12H2O 9.3 g/L、NaCl 0.47 g/L、KCl 0.57 g/L、MgSO4·7H2O 0.12 g/L、CaCl2·2H2O 0.045 g/L，蒸餾水1 000 mL。配制時(shí)除CaCl2·2H2O以外的試劑用1 000 mL蒸餾水充分溶解后再加入CaCl2·2H2O，然后持續(xù)通入CO2，使溶液pH為6.9±0.1[13 ]。

1.3.2 人工瘤胃液準(zhǔn)備 瘤胃液采自6頭體重35 kg左右、安裝永久性瘤胃瘺管的健康羯綿羊作為培養(yǎng)液的供體羊，飼喂基礎(chǔ)日糧。每天飼喂2次（08：00、20：00時(shí)），自由飲水。晨飼前分別從6頭供體羊瘤胃中采集瘤胃液約3 500 mL，混合后用保溫瓶迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，用四層紗布過(guò)濾，整個(gè)操作于39 ℃水浴中進(jìn)行。過(guò)濾后取3 200 mL瘤胃液搖勻分成8份，加入已分別裝有400 mL緩沖液的8個(gè)發(fā)酵罐內(nèi)，持續(xù)通入CO2氣體2～3 min保持發(fā)酵罐內(nèi)部厭氧環(huán)境。

1.3.3 人工瘤胃工作條件參數(shù) 人工瘤胃的工作條件為稀釋率0.7 /d，緩沖液流量0.39 mL/min，流出液口篩網(wǎng)孔徑為1.2 mm，補(bǔ)料量為20 g/d，發(fā)酵罐內(nèi)溫度為39 ℃，充CO2至厭氧環(huán)境，緩沖液與瘤胃液按體積比1∶1比例添加。

1.3.4 人工瘤胃操作與樣品采集 將供試原料風(fēng)干，粉碎，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)準(zhǔn)確稱取后混合均勻，配制試驗(yàn)全期的總用量。稱取10 g分裝于孔徑為50 μm、尺寸為7 cm×13 cm的尼龍袋中備用。每天分別于08：30時(shí)和20：30時(shí)進(jìn)行補(bǔ)料。首先向每個(gè)發(fā)酵罐加入預(yù)先準(zhǔn)備好的混合日糧10 g，補(bǔ)料完畢充CO2氣體2～3 min，以維持發(fā)酵罐內(nèi)厭氧環(huán)境。

1.3.5 發(fā)酵試驗(yàn) 連續(xù)進(jìn)行兩期發(fā)酵試驗(yàn)。每期試驗(yàn)包括7 d預(yù)試期和2 d正試期。于正試期第1天用集氣袋收集24 h的產(chǎn)氣并記錄產(chǎn)氣量，將部分氣體轉(zhuǎn)移到采氣袋，以備測(cè)定甲烷產(chǎn)量。第2天，投料后3、6、9、24 h經(jīng)取樣口采集發(fā)酵液，加1滴飽和HgCl溶液后立即測(cè)定pH，然后于-20 ℃冷凍保存，以備其他發(fā)酵產(chǎn)物的測(cè)定。收集發(fā)酵罐內(nèi)尼龍袋食糜，于65 ℃烘箱烘干，粉碎，待測(cè)干物質(zhì)降解率。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及樣品分析方法

1.4.1 發(fā)酵24 h總產(chǎn)氣量 用集氣袋收集，然后用氣量計(jì)測(cè)定總量。

1.4.2 不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵液pH 用pH計(jì)（pHS-3C，上海雷磁儀器廠）測(cè)定。

1.4.3 甲烷 用氣相色譜儀（BeifenHP-3420A型）測(cè)定。測(cè)定條件為柱溫80 ℃，氣化室溫度100 ℃，檢測(cè)室溫度120 ℃；載氣使用高純氮?dú)猓倝毫?30 kPa，總流量30.2 mL/min，柱流量1.7 mL/min，線速度39.8 cm/s，分流比15，吹掃流量3 mL/min，循環(huán)流量8 mL/min，H2流量40 mL/min，空氣流量400 mL/min[14 ]。

1.4.4 揮發(fā)性脂肪酸（VFA） 用氣相色譜儀（Beifen HP-3420A型）測(cè)定。樣品預(yù)處理：解凍-20 ℃保存的發(fā)酵液樣品，10 000 g離心10 min，取上清 液1 mL加25%偏磷酸0.1 mL，靜置30 min，在 10 000 g下離心10 min，保留上清液待測(cè)。色譜條件為色譜柱2 m×3 mm內(nèi)裝5%聚二乙二醇丁二酸酯（DEGS）+1%磷酸的不銹鋼柱。儀器條件為柱溫以2 ℃/min由110 ℃升至120 ℃，進(jìn)樣器、檢測(cè)器溫度200 ℃；載氣N2流速20 mL/min、氫氣流速30 mL/min、空氣流速300 mL/min[15 ]。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

基礎(chǔ)數(shù)據(jù)用Excel整理后，用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析處理，顯著性水平為0.05。差異顯著性用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 金露梅和珠芽蓼草粉對(duì)干物質(zhì)消失率、 總產(chǎn)氣量與甲烷產(chǎn)量的影響

從表2可以看出，與對(duì)照相比，添加10%金露梅和10%珠芽蓼的處理，干物質(zhì)消失率較高，而總產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量與均較對(duì)照有所下降，但差異都不顯著（P > 0.05）。

2.2 金露梅和珠芽蓼草粉對(duì)瘤胃液pH的影響

從表3可以看出，添加10%的金露梅和10%珠芽蓼時(shí)，人工瘤胃發(fā)酵罐內(nèi)不同時(shí)間瘤胃液pH變化范圍在6.83～6.97，沒(méi)有產(chǎn)生顯著影響（P >0.05）。發(fā)酵24 h后，各處理的pH均低于投料后3 h的測(cè)定值（P > 0.05）。

2.3 金露梅和珠芽蓼草粉對(duì)瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸濃度的影響

從表4可以看出，基礎(chǔ)日糧中添加10%金露梅和10%珠芽蓼的處理，發(fā)酵產(chǎn)生的丙酸和丁酸濃度均高于對(duì)照，而乙酸、戊酸濃度低于對(duì)照，差異均不顯著（P > 0.05）。各處理乙酸/丙酸和（乙酸+正丁酸）/丙酸比值差異不顯著，添加10%金露梅和10%珠芽蓼的處理均低于對(duì)照。各處理的總揮發(fā)性脂肪酸含量差異不顯著（P > 0.05），但添加10%金露梅和10%珠芽蓼處理的測(cè)定結(jié)果略高于對(duì)照。

3 小結(jié)與討論

研究結(jié)果表明，基礎(chǔ)日糧中添加10%金露梅和10%珠芽蓼草粉與普通基礎(chǔ)日糧之間發(fā)酵液pH、甲烷、揮發(fā)性脂肪酸的產(chǎn)生量及干物質(zhì)消失率差異均不顯著（P > 0.05），但有降低甲烷產(chǎn)量，提高干物質(zhì)消化率的趨勢(shì)。體外發(fā)酵液pH為6.83～6.94，高于王永梅等（6.04～5.90）和陸燕等人的試驗(yàn)結(jié)果（6.61～6.76）[16 - 17 ]，總體高于不用瘤胃模擬裝置的體外發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果（6.50～6.40）[18 ]，原因可能與本試驗(yàn)過(guò)程中，人工瘤胃裝置通過(guò)蠕動(dòng)泵持續(xù)不斷的泵入人工唾液，發(fā)酵產(chǎn)物不斷溢出模擬瘤胃有關(guān)。pH變化范圍處于瘤胃液正常范圍（pH為6.4～7.4）內(nèi)，適合瘤胃內(nèi)微生物的生存條件，不會(huì)影響瘤胃的發(fā)酵功能[19 ]。

許多體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，植物次生代謝物對(duì)動(dòng)物瘤胃發(fā)酵的影響效果不同，有時(shí)甚至得出自相矛盾的結(jié)果，是因?yàn)橹参锎紊x物的添加劑量、化學(xué)組成、純度、日糧類(lèi)型、瘤胃微生物的適應(yīng)性， 以及植物次生代謝物存在形式、體外發(fā)酵裝置都會(huì)影響瘤胃發(fā)酵[6 ]。有文獻(xiàn)報(bào)道，與本試驗(yàn)同年采集時(shí)間接近的8月1號(hào)所采金露梅與珠芽蓼中縮合單寧含量分別為4.51%和2.76%，其純化縮合單寧在體外產(chǎn)氣法試驗(yàn)中，對(duì)總產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量的抑制作用較明顯[20 ]。而在本試驗(yàn)，處理組較對(duì)照的產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量?jī)H有降低的趨勢(shì)，也許是10%添加量中的單寧不足以產(chǎn)生顯著的影響，再者，日糧類(lèi)型與縮合單寧純度都可能是影響瘤胃發(fā)酵的因素。有研究表明，飼料消化率與體外培養(yǎng)時(shí)的產(chǎn)氣量具有高度相關(guān)性，產(chǎn)氣量越高，飼料在瘤胃內(nèi)的降解率越高[21 ]。但本試驗(yàn)處理組干物質(zhì)降解率變化趨勢(shì)與產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量相反，也許是由于開(kāi)花期金露梅與開(kāi)花前期的珠芽蓼本身消化率較高，故處理組的干物質(zhì)降解率較對(duì)照高。雖然金露梅與珠芽蓼含有較多植物次生代謝物，但10%添加量中的單寧不足以影響微生物對(duì)纖維的消化，最終表現(xiàn)是干物質(zhì)降解率和總產(chǎn)氣量，以及甲烷產(chǎn)量差異均不顯著[6 ]。

瘤胃中的飼料被降解，產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸（VFA）的同時(shí)產(chǎn)生大量甲烷（CH4）。揮發(fā)性脂肪酸主要包括乙酸、丙酸、丁酸等，其含量和組成，是反映瘤胃微生物發(fā)酵活動(dòng)的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)三組處理的總揮發(fā)性脂肪酸測(cè)定結(jié)果與王銀山等人的報(bào)道一致[22 ]。在瘤胃發(fā)酵中，生成乙酸和丁酸的過(guò)程產(chǎn)生氫，甲烷可消除發(fā)酵中過(guò)多的氫，是氫的“平衡器”，因此氫是限制甲烷產(chǎn)生的第一要素。當(dāng)乙酸和丁酸比例較高時(shí)，產(chǎn)生較多的氫，甲烷生成量增加；而當(dāng)丙酸比例增高時(shí)，相應(yīng)甲烷產(chǎn)量降低。所以添加金露梅和珠芽蓼后，乙酸、丁酸濃度，乙酸/丙酸及甲烷產(chǎn)量均有低于對(duì)照組的趨勢(shì)，符合瘤胃發(fā)酵一般規(guī)律。曾有研究報(bào)道，瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的甲烷量，對(duì)植物次生代謝物，有劑量依賴性[23 ]。本試驗(yàn)添加金露梅和珠芽蓼降低甲烷產(chǎn)量的效果不顯著，可能與添加量有關(guān)。

戊酸與含4個(gè)或5個(gè)碳原子的支鏈脂肪酸2-甲基丁酸、異丁酸和異戊酸，合稱為異位酸[24 ]。它們是促進(jìn)瘤胃纖維分解菌生長(zhǎng)的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)瘤胃內(nèi)纖維的降解有重要影響，可提高瘤胃對(duì)植物細(xì)胞壁的消化能力，促進(jìn)纖維的消化[25 ]。從本試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，與對(duì)照相比，添加兩種草粉的處理組戊酸和異丁酸比例有所下降，而干物質(zhì)降解率有較高的趨勢(shì)，推測(cè)可能是戊酸和異丁酸被纖維分解菌利用，促進(jìn)了分解菌繁殖，利于干物質(zhì)降解率；兩種草粉可能對(duì)瘤胃微生物區(qū)系有影響，進(jìn)而對(duì)瘤胃發(fā)酵粗纖維飼料有改善。而處理組比對(duì)照異戊酸測(cè)定值較高（P > 0.05），可能是由于異戊酸與飼料纖維降解作用無(wú)關(guān)[26 ]。

在本試驗(yàn)條件下，添加10%金露梅和10%珠芽蓼草粉，對(duì)瘤胃發(fā)酵的作用效果不顯著；也許與兩種植物的添加量，或者日糧類(lèi)型有關(guān)，導(dǎo)致結(jié)果不顯著。據(jù)此認(rèn)為，選擇10%金露梅和10%珠芽蓼草粉作添加劑不可行。

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（本文責(zé)編：陳 偉）