肝細(xì)胞核因子-1b在糜爛性毒劑2-氯乙基乙基硫醚誘導(dǎo)急性肺支氣管上皮細(xì)胞損傷中的作用及其機(jī)制

孔德欽，劉思佳，2，劉建豪，2，馬 耀，2，馬丞飛，2，趙昱舜，2，周嘉恒，師敏婕，李 嘉，，劉江正，

(1.空軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系軍事毒理學(xué)與防化醫(yī)學(xué)教研室/陜西省自由基生物學(xué)與醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/教育部特殊作業(yè)環(huán)境危害評估與防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710032；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院學(xué)員二大隊(duì)，陜西 西安 710032；3.空軍軍醫(yī)大學(xué)航空航天醫(yī)學(xué)系飛行人員康復(fù)與療養(yǎng)教研室，陜西 西安 710032)

糜爛性毒劑作為一種經(jīng)典的化學(xué)戰(zhàn)劑，曾廣泛應(yīng)用于多次戰(zhàn)爭或恐怖襲擊，導(dǎo)致了大量人員傷亡，對我國的化學(xué)安全構(gòu)成了潛在的現(xiàn)實(shí)威脅。糜爛性毒劑經(jīng)呼吸道或皮膚暴露后能夠?qū)е录毙苑螕p傷，是導(dǎo)致傷員死亡和影響遠(yuǎn)期效應(yīng)的最重要原因之一[1]。目前，糜爛性毒劑誘導(dǎo)急性肺損傷的中毒機(jī)制尚不明確，也缺乏有效的救治藥物[2]。研究表明，糜爛性毒劑誘導(dǎo)急性肺損傷與過度活性氧(reactive oxygen species，ROS)聚集導(dǎo)致的氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙密切相關(guān)[3-4]。肝細(xì)胞核因子-1b(hepatocyte nuclear factor-1b，HNF-1b)，亦稱為HNF1β或TCF2，是一種在肝臟組織中大量表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，屬于含有同源域的超家族，在物種間高度保守[5]。HNF1-b的功能喪失或HNF-1b 等位基因截?cái)嗫蓪?dǎo)致一種常染色體顯性遺傳疾病，稱為青年5 型糖尿病(maturity-onset diabetes of the young type 5，MODY5)[6]。本課題組之前的研究表明，HNF-1b 在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和代謝過程中發(fā)揮了重要的作用[7]，過表達(dá)HNF-1b能夠顯著減輕多氯聯(lián)苯或雙酚A誘導(dǎo)肝臟脂質(zhì)代謝紊亂和肝損傷的發(fā)生和發(fā)展[8-9]，其機(jī)制可能與抗氧化和保護(hù)線粒體功能相關(guān)[8]。除肝臟外，HNF-1b蛋白也被發(fā)現(xiàn)在其他器官和組織，包括肺、腸、胰腺、腎臟、生殖道和泌尿道中表達(dá)，被認(rèn)為在上述器官的發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。此前雖已證實(shí)HNF-1b在肺部上皮細(xì)胞中也有廣泛表達(dá)，但其功能尚不明確[10]。本研究通過硫芥模擬劑2-氯乙基乙基硫醚(2-chloroethyl ethyl sulfide，CEES)構(gòu)建糜爛性毒劑誘導(dǎo)體外肺支氣管上皮損傷模型，檢測CEES暴露后HNF-1b的變化；并通過慢病毒感染技術(shù)在人肺支氣管上皮細(xì)胞系BEAS-2B細(xì)胞中過表達(dá)HNF-1b，探討過表達(dá)HNF-1b 對CEES 誘導(dǎo)肺支氣管上皮細(xì)胞損傷的調(diào)控作用及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

2-氯乙基乙基硫醚(純度99.5%)購自美國Sigma 公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco 公司；PBS、雙抗溶液、0.25%胰酶、BCA 蛋白定量試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；CCK-8細(xì)胞活性檢測試劑盒和凋亡檢測試劑盒均購自南京恩晶生物有限公司；DCFH-DA、MitoSOX、JC-1熒光探針購自美國Thermo公司；DHE熒光探針購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；HNF-1b 抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司，GAPDH抗體及二抗購自美國Bioworld公司；其他化學(xué)試劑均為分析純以上級別。

Infinite M200 Pro全波段酶標(biāo)儀購于瑞士Tecan公司；流式細(xì)胞儀為美國Beckman 公司產(chǎn)品；全自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)購于美國Sigma公司；CKX41S倒置顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡購于日本奧林巴斯公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞處理和分組人支氣管上皮細(xì)胞系BEAS-2B 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。BEAS-2B細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿、6孔板或96孔板，使用含10%胎牛血清、100 IU/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基在CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。CEES 預(yù)先溶解于無水乙醇中制備成100 mmol/L的儲備液，使用時(shí)稀釋。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為對照組和CEES 染毒組，其中對照組給予含1%(V/V)乙醇的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基處理24 h，染毒組分別給予0.4、0.6、0.8、1.0 和1.2 mmol/L CEES 處理24 h；在分子功能實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞分為4 組：溶劑對照組、CEES 組、HNF-1b 過表達(dá)組、HNF-1b 過表達(dá)+CEES組，CEES 的濃度為1 mmol/L，溶劑為1%(V/V)乙醇，處理時(shí)間為24 h，染毒結(jié)束后進(jìn)行相應(yīng)的檢測。

1.2.2 CCK-8 試劑盒檢測細(xì)胞活力采用試劑盒測定BEAS-2B 細(xì)胞活力。CEES 染毒結(jié)束后，向每孔中加入10 μL CCK-8，并將細(xì)胞在37 ℃條件下避光孵育1 h。通過全波段酶標(biāo)儀檢測450 nm 波長處吸光值，每組設(shè)10個(gè)復(fù)孔，取均值作為每組的吸光值，以對照組的吸光值為1，各組的細(xì)胞活力以其與對照組的相對值表示。

1.2.3 細(xì)胞大體形態(tài)觀察將BEAS-2B細(xì)胞接種至6孔板，用不同濃度的CEES 處理24 h 后將細(xì)胞置于倒置顯微鏡下，在明場觀察細(xì)胞大體形態(tài)的變化。

1.2.4 DCFH-DA 和DHE 檢測細(xì)胞ROS 水平將BEAS-2B細(xì)胞接種至6孔板，按分組處理24 h后去除培養(yǎng)基，使用胰酶消化收集細(xì)胞沉淀，細(xì)胞內(nèi)加入無血清培養(yǎng)基配制的終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA或10 μg/mL的DHE探針工作液并重懸，在37 ℃孵箱內(nèi)避光孵育30 min，去除探針，PBS 清洗1 次，用PBS重懸后用流式細(xì)胞儀檢測，分別采用CytExpert軟件收集檢測數(shù)據(jù)，F(xiàn)lowJo軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.5 MitoSOX 檢測線粒體ROS(mtROS)水平使用線粒體靶向的MitoSOX 熒光探針檢測mtROS 含量。待BEAS-2B 細(xì)胞按分組處理24 h 后用胰酶消化收集細(xì)胞沉淀，加入無血清培養(yǎng)基配制的終濃度為5 μmol/L 的MitoSOX 探針，置于37 ℃孵箱內(nèi)避光孵育20 min，后續(xù)操作同1.2.4。

1.2.6 Western blot 法檢測HNF-1b 蛋白表達(dá)BEAS-2B 細(xì)胞處理結(jié)束后用4 ℃預(yù)冷的PBS 洗1 次，加入RIPA 裂解液在冰上裂解30 min，收集細(xì)胞裂解物，置于4 ℃高速離心機(jī)以12 000g離心20 min，收集上清即為細(xì)胞總蛋白。取少量蛋白，使用BCA法蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測定。其余蛋白樣品加入5×上樣緩沖液及二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)，100 ℃加熱5 min 后用于Western blot 實(shí)驗(yàn)。取40 μg蛋白進(jìn)行上樣，電泳時(shí)初始電壓設(shè)置為90 V，待蛋白到達(dá)分離膠時(shí)切換為120 V。在恒壓20 V條件下使用PVDF 膜進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)印30 min，5%的脫脂奶粉封閉2 h，加入相應(yīng)的HNF-1b 或GADPH 一抗，4 ℃搖床孵育16 h，TBST 洗膜3 次，加入1∶6 000 稀釋的山羊抗兔二抗，搖床上孵育1 h，TBST 洗膜4 次，將條帶置于凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影并用Quantity One 軟件進(jìn)行拍照。

1.2.7 過表達(dá)HNF-1b 的BEAS-2B 細(xì)胞系的構(gòu)建為了評價(jià)HNF-1b 在糜爛性毒劑誘導(dǎo)急性肺損傷中的作用及機(jī)制，我們構(gòu)建了過表達(dá)HNF-1b 的BEAS-2B細(xì)胞系。首先用全基因合成的方式合成HNF-1b基因片段，并構(gòu)建含有目的基因的重組質(zhì)粒pCDH-CMVMCS-EF1-Puro-HNF1B，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293lenti 細(xì)胞，產(chǎn)生高滴度的慢病毒。將BEAS-2B 細(xì)胞以5×104的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后加入10 μg/mL的凝聚胺(polybrene)，同時(shí)以 感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為60 的滴度分別加入空載體對照病毒和HNF-1b 過表達(dá)的慢病毒。48 h 后換液，加入嘌呤霉素對有效感染的細(xì)胞進(jìn)行篩選并擴(kuò)增，從而構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)HNF-1b的BEAS-2B細(xì)胞系。

1.2.8 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡使用Annexin V-FITC/PI 試劑盒經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。分別將正常細(xì)胞或者過表達(dá)細(xì)胞BEAS-2B接種在6 孔板，處理結(jié)束后用0.25%胰酶消化、離心、收集細(xì)胞，在細(xì)胞沉淀中加入200 μL 細(xì)胞凋亡檢測工作液(緩沖液∶Annexin V-FITC∶PI=100∶1∶1)，混勻后置于37 ℃孵箱中避光孵育30 min，PBS 洗1次，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，通過CytExpert 軟件收集數(shù)據(jù)，F(xiàn)lowJo 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.9 JC-1 檢測線粒體膜電位使用JC-1 染料檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)的變化。將BEAS-2B 細(xì)胞接種在共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿，待細(xì)胞處理結(jié)束后加入終濃度為2 μg/mL 的JC-1 工作液，置于37 ℃孵箱中避光孵育30 min，用PBS 洗3 次，使用共聚焦顯微鏡觀察并拍照(紅色熒光，EX/EM 為585/590 nm；綠色熒光，EX/EM為514/529 nm)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 CEES對BEAS-2B細(xì)胞活力水平的影響

不同濃度CEES 染毒24 h 后，CCK-8 法檢測細(xì)胞活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，0.4 mmol/L CEES處理組BEAS-2B細(xì)胞活力升高(P＜0.05)，當(dāng)CEES濃度超過0.6 mmol/L 時(shí)，細(xì)胞活力均顯著降低(P＜0.01)，且具有劑量效應(yīng)關(guān)系(r=-0.93，P＜0.01)。上述結(jié)果提示糜爛性毒劑誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞損傷體外模型構(gòu)建成功，見圖1。

圖1 不同劑量的CEES染毒后對BEAS-2B細(xì)胞活力的影響

2.2 CEES 染毒后對BEAS-2B 細(xì)胞形態(tài)和ROS 的影響

光學(xué)顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，0.6 mmol/L CEES 處理組細(xì)胞數(shù)量顯著降低，上皮狀細(xì)胞呈現(xiàn)纖維化表征，當(dāng)CEES 濃度超過0.8 mmol/L 時(shí)，皺縮狀的死細(xì)胞明顯增多(圖2)。

圖2 不同劑量CEES染毒后的BEAS-2B細(xì)胞形態(tài)

氧化應(yīng)激在糜爛性毒劑導(dǎo)致肺損傷中發(fā)揮了關(guān)鍵效應(yīng)?；贒CF-DA 探針和MitoSOX 探針的流式細(xì)胞術(shù)分別檢測細(xì)胞內(nèi)總ROS 和線粒體ROS 水平，見圖3。與對照組相比，0.6 mmol/L CEES 處理組總ROS(P＜0.01)和線粒體ROS水平降低(P＜0.05)，而0.8 和1 mmol/L CEES 處理導(dǎo)致總ROS 和線粒體ROS 水平均顯著升高(P＜0.01)。上述結(jié)果提示CEES 能夠誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激，同時(shí)引發(fā)線粒體氧化損傷。由于1 mmol/L CEES 處理組上述指標(biāo)均顯著，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)用該濃度處理細(xì)胞。

圖3 不同劑量CEES染毒后對BEAS-2B細(xì)胞ROS的影響

2.3 CEES 染毒對BEAS-2B 細(xì)胞HNF-1b 表達(dá)的影響

Western blot 檢測BEAS-2B 細(xì)胞中HNF-1b 蛋白的表達(dá)，與對照組細(xì)胞相比，1 mmol/L CEES 染毒組HNF-1b 的蛋白水平顯著下調(diào)(圖4，P＜0.01)。結(jié)果表明，HNF-1b 可能是糜爛性毒劑誘導(dǎo)急性肺損傷的重要靶分子。

圖4 CEES染毒對BEAS-2B細(xì)胞HNF-1b表達(dá)的影響

2.4 過表達(dá)HNF-1b抑制CEES染毒導(dǎo)致的細(xì)胞損傷和凋亡

與對照組細(xì)胞相比，采用慢病毒轉(zhuǎn)染過表達(dá)HNF-1b 的BEAS-2B 細(xì)胞系HNF-1b 的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(圖5A)。CCK-8 檢測細(xì)胞活力結(jié)果表明，與正常對照組相比，過表達(dá)HNF-1b顯著抑制了CEES導(dǎo)致的細(xì)胞活力降低(圖5B，P＜0.01)。細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果表明，過表達(dá)HNF-1b還明顯拮抗了CEES導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡發(fā)生(圖6，P＜0.01)。此結(jié)果表明，過表達(dá)HNF-1b顯著減輕了CEES誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞損傷。

圖5 過表達(dá)HNF-1b抑制CEES導(dǎo)致的細(xì)胞增殖活力

圖6 過表達(dá)HNF-1b抑制CEES導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡

2.5 過表達(dá)HNF-1b 可逆轉(zhuǎn)CEES 誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞ROS生成

氧化應(yīng)激是糜爛性毒劑誘導(dǎo)急性肺損傷的重要機(jī)制之一。通過DHE 熒光探針檢測，結(jié)果顯示單獨(dú)CEES 作用時(shí)，細(xì)胞內(nèi)總ROS 水平較對照組明顯升高(P＜0.01)；而過表達(dá)HNF-1b 可逆轉(zhuǎn)CEES 染毒導(dǎo)致的BEAS-2B細(xì)胞內(nèi)總ROS水平的升高(圖7，P＜0.01)。上述結(jié)果提示，過表達(dá)HNF-1b 可能通過抗氧化作用抑制CEES誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞損傷。

圖7 過表達(dá)HNF-1b抑制CEES導(dǎo)致的細(xì)胞總ROS生成

2.6 過表達(dá)HNF-1b 逆轉(zhuǎn)CEES 染毒導(dǎo)致的BEAS-2B細(xì)胞線粒體功能障礙

本研究檢測了過表達(dá)HNF-1b 后線粒體損傷相關(guān)指標(biāo)的變化，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HNF-1b顯著抑制了CEES導(dǎo)致的線粒體ROS水平升高(圖8，P＜0.01)，同時(shí)減輕了CEES 導(dǎo)致的MMP 水平降低(圖9)。上述結(jié)果表明，HNF-1b 能夠通過調(diào)控線粒體功能參與糜爛性毒劑CEES誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞損傷過程。

圖8 過表達(dá)HNF-1b抑制CEES導(dǎo)致的mtROS生成

圖9 過表達(dá)HNF-1b抑制CEES導(dǎo)致的線粒體膜電位受損

3 討 論

糜爛性毒劑是一類能夠直接損傷器官、組織和細(xì)胞，吸收后能導(dǎo)致全身中毒損傷的致死性化學(xué)戰(zhàn)劑，曾在戰(zhàn)爭歷史上被廣泛使用，造成了眾多的軍事人員和平民中毒[11]。但其中毒和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前也缺乏有效的救治手段，需要研究新的中毒靶點(diǎn)和相關(guān)機(jī)制，以尋求新的干預(yù)靶標(biāo)和救治思路[12]。此外，糜爛性毒劑導(dǎo)致的肺損傷如治療不及時(shí)或不徹底，將會轉(zhuǎn)變成慢性肺損傷，嚴(yán)重影響中毒傷員的預(yù)后和生活質(zhì)量[13]。研究表明，過量ROS 生成導(dǎo)致的氧化應(yīng)激被認(rèn)為是糜爛性毒劑誘導(dǎo)急性肺損傷的關(guān)鍵致病因素之一，氧化應(yīng)激還介導(dǎo)了炎癥和凋亡的發(fā)生和發(fā)展[14]。使用抗氧化劑或抗氧化酶可在一定程度上減輕糜爛性毒劑誘導(dǎo)的器官損傷[15-16]。

本課題組以往的研究證實(shí)，HNF-1b 作為肝臟中大量表達(dá)的一種核轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)脂肪合成、脂肪細(xì)胞分化、葡萄糖穩(wěn)態(tài)和胰島素抵抗中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，同時(shí)還能通過調(diào)控氧化酶的表達(dá)和炎癥因子釋放發(fā)揮氧化應(yīng)激和炎癥調(diào)節(jié)作用[10]。HNF-1b缺乏能夠?qū)е聫?fù)雜和異質(zhì)的臨床表型，如腎臟和胰腺的發(fā)育異常、糖耐量異常等[17]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，肺組織內(nèi)也有HNF-1b 表達(dá)，目前其功能尚不明確[18]。過表達(dá)HNF-1b 可以通過抑制PI3K/Akt 磷酸化，顯著抑制肺上皮細(xì)胞系A(chǔ)549 的惡性生物學(xué)行為[18]，提示肺部HNF-1b 的表達(dá)對于呼吸系統(tǒng)可能具有其特殊的生物學(xué)功能。為了探索HNF-1b 在糜爛性毒劑導(dǎo)致急性肺損傷中的作用及調(diào)控機(jī)制，我們構(gòu)建了CEES 染毒的BEAS-2B細(xì)胞模型，檢測HNF-1b的表達(dá)改變對CEES誘導(dǎo)肺損傷的調(diào)控作用，以期為開發(fā)新的抗毒靶標(biāo)和深入理解糜爛性毒劑中毒機(jī)制提供新思路。

在前期研究中，我們已證實(shí)，過表達(dá)HNF-1b慢病毒或使用化學(xué)單體齊墩果酸藥理性激活HNF-1b能夠通過上調(diào)抗氧化關(guān)鍵調(diào)控因子Nrf-2的表達(dá)和抑制NF-κB信號，進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)過度激活，表現(xiàn)出對環(huán)境污染物脅迫的保護(hù)作用[7]。本研究中，在CEES染毒BEAS-2B細(xì)胞后，HNF-1b蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)，結(jié)合HNF-1b對氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的負(fù)向調(diào)控作用，我們推測HNF-1b的表達(dá)下調(diào)可能參與了CEES導(dǎo)致的急性肺損傷的發(fā)生和發(fā)展。后經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建了過表達(dá)HNF-1b的肺支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)HNF-1b的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，且過表達(dá)HNF-1b能夠顯著減輕CEES染毒所誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞活力，進(jìn)一步證實(shí)了HNF-1b可能是拮抗糜爛性毒劑導(dǎo)致細(xì)胞損傷的保護(hù)性分子。

凋亡是一種受多種因素調(diào)節(jié)的程序性細(xì)胞死亡過程，文獻(xiàn)已證實(shí)糜爛性毒劑染毒可以通過抑制VDR/Nrf2/Sirt3信號通路等誘發(fā)肺支氣管上皮細(xì)胞的凋亡[19]。Kang等[18]報(bào)道HNF-1b通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡途徑參與了胚胎器官的發(fā)育過程。本文通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HNF-1b可抑制CEES誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞凋亡，提示上調(diào)HNF-1b 表達(dá)具有抗細(xì)胞凋亡的作用。上述結(jié)果表明，HNF-1b對糜爛性毒劑導(dǎo)致的肺上皮細(xì)胞發(fā)揮了保護(hù)作用，而CEES染毒導(dǎo)致的HNF-1b的抑制可能參與了肺上皮細(xì)胞的凋亡過程。

ROS 被認(rèn)為是糜爛性毒劑誘導(dǎo)毒性的關(guān)鍵介質(zhì)[20]。使用低分子量抗氧化劑或輔助因子、酶性抗氧化劑可以有效改善糜爛性毒劑中毒的損傷程度。糜爛性毒劑暴露后導(dǎo)致ROS 過量生成，介導(dǎo)脂質(zhì)、蛋白和核酸發(fā)生氧化損傷[14]。目前，糜爛性毒劑導(dǎo)致氧化應(yīng)激的機(jī)制尚不明確，可能涉及還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)的耗竭[21]與抗氧化酶SOD的抑制[22]等。大量研究也證實(shí)，HNF-1b介導(dǎo)的氧化還原穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)可以抑制多氯聯(lián)苯混合物誘導(dǎo)的氧化損傷[8]，且多氯聯(lián)苯[7]和雙酚A[9]還能通過抑制HNF-1b促進(jìn)氧化應(yīng)激，提示HNF-1b 可能是一個(gè)新的氧化還原調(diào)控因子。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)HNF-1b 過表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)CEES 染毒誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS 水平和線粒體ROS水平升高，進(jìn)而減輕氧化應(yīng)激損傷。上述結(jié)果說明HNF-1b 作為一種保護(hù)性分子可能通過抗氧化而發(fā)揮拮抗糜爛性毒劑作用。另外，在本研究中還發(fā)現(xiàn)，0.4 mmol/L CEES 處理能夠輕度提高細(xì)胞活力，0.6 mmol/L 時(shí)使總ROS 和線粒體ROS 水平輕微降低，這可能是由于毒物興奮效應(yīng)引起的，這是一種生物體對外界不利環(huán)境或者有毒物質(zhì)產(chǎn)生的適應(yīng)性保護(hù)反應(yīng)，低水平的刺激作用會促進(jìn)細(xì)胞活力增加，并通過激活Nrf2分子等增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)防氧化能力，進(jìn)而降低細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，從而使生物體更易于存活[23]。

糜爛性毒劑導(dǎo)致急性肺損傷的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中線粒體功能障礙備受關(guān)注[24]。越來越多的研究表明，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的線粒體結(jié)構(gòu)和功能異常參與了肺上皮細(xì)胞的死亡[24-25]。靶向線粒體的抗氧化劑能夠顯著減輕CEES誘導(dǎo)的細(xì)胞活力降低[24]。本課題組前期研究也證實(shí)，線粒體抗氧化劑MitoQ 能夠有效減輕氮芥誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷[26]。Casemayou 等[27]報(bào)道，HNF-1b 的缺失導(dǎo)致腎小管細(xì)胞線粒體呼吸發(fā)生異常，提示HNF-1b 的下調(diào)可能參與了線粒體功能異常。為了進(jìn)一步明確HNF-1b 對糜爛性毒劑誘導(dǎo)急性肺損傷的調(diào)控作用，我們通過JC-1 探針技術(shù)檢測了MMP 水平。MMP 是線粒體活性的關(guān)鍵指標(biāo)，它反映了電子運(yùn)輸和氧化磷酸化的過程，而氧化磷酸化是ATP產(chǎn)生的驅(qū)動(dòng)力[28]。在本研究中，結(jié)果顯示CEES暴露能夠?qū)е戮€粒體功能異常，表現(xiàn)為MMP 的顯著降低，而過表達(dá)HNF-1b能夠顯著拮抗CEES對線粒體功能的損傷效應(yīng)，提示線粒體功能調(diào)節(jié)可能參與了HNF-1b對糜爛性毒劑肺損傷的拮抗作用。

本研究通過構(gòu)建糜爛性毒劑模擬物CEES 染毒體外細(xì)胞模型，證實(shí)CEES暴露后能夠?qū)е翲NF-1b表達(dá)的顯著下調(diào)，其可能是重要的干預(yù)靶標(biāo)。過表達(dá)HNF-1b 能夠顯著減輕CEES 誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷和凋亡，抑制線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激，靶向激活HNF-1b可能在糜爛性毒劑誘導(dǎo)急性肺損傷的臨床救治中發(fā)揮重要作用。