周夢婷,宋銀娟*,許 健,李 斌,冉多良,儲岳峰,*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所, 蘭州大學(xué)動物醫(yī)學(xué)與生物安全學(xué)院, 動物疫病防控全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730046;2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,烏魯木齊 830052)

疫苗接種是預(yù)防傳染性疾病的有效手段,它能使機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫來抵抗病原體的感染。由于傳統(tǒng)疫苗現(xiàn)已無法對某些疾病產(chǎn)生良好的保護(hù)效力,或是免疫原性較弱,如預(yù)防結(jié)核病的疫苗卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin, BCG)。因此,需要添加佐劑來增強(qiáng)疫苗的免疫應(yīng)答。佐劑是指添加到疫苗中以刺激和增強(qiáng)免疫應(yīng)答強(qiáng)度或改變免疫應(yīng)答類型的物質(zhì),應(yīng)用時(shí)可與抗原同時(shí)或預(yù)先注射于機(jī)體,可以減少昂貴抗原的用量,減少加強(qiáng)免疫的次數(shù),產(chǎn)生更快速、更持久的免疫應(yīng)答[1]。

盡管佐劑在亞單位疫苗中起著重要作用,但被批準(zhǔn)用于人類商用疫苗的佐劑少之又少。鋁佐劑作為首個被美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration, FDA)批準(zhǔn)應(yīng)用的佐劑,它在人類和獸用疫苗中已使用超過100年。鋁佐劑是一種乳白色的凍膠狀半固體,目前常見的鋁佐劑有氫氧化鋁凝膠、磷酸鋁、硫酸鋁、銨明礬及鉀明礬等,但常用的種類為氫氧化鋁佐劑。鋁佐劑對抗原具有吸附作用,將它注射到機(jī)體后可緩慢地釋放抗原,從而延長抗原的作用時(shí)間。但鋁佐劑也存在著一些不足,如只能引起Th2型反應(yīng),會在注射部位產(chǎn)生肉芽腫,引起機(jī)體過敏反應(yīng)等。繼鋁佐劑后,又有幾種佐劑相繼被允許使用在疫苗中,分別是含有角鯊烯的MF59和AS03佐劑;含有MPL和QS-21的AS02水包油乳化劑;含有角鯊烯、Span80、Brij56的水包油乳化佐劑AF03[2-3];基于脂質(zhì)體的AS01和添加了MPL的鋁鹽佐劑AS04,SE及其衍生物,ISA720、ISA51和CpG1018[4]。目前它們都已在商用疫苗中有所應(yīng)用,但這些佐劑的作用機(jī)制尚未完全明確,仍需進(jìn)一步深入的研究。

由于廣泛使用鋁佐劑會引發(fā)機(jī)體的多種不良反應(yīng),所以迫切需要一種有效的、毒性較小且易代謝的佐劑。碳水化合物作為自然界中分布最廣泛的一類生物分子,它們在免疫系統(tǒng)功能和刺激免疫應(yīng)答中起著關(guān)鍵作用。碳水化合物具有許多有益的特性,如高生物相容性、耐受性以及強(qiáng)大的安全性,使其成為了有前途的候選佐劑[5]。目前已有多種天然碳水化合物正在被研究和開發(fā)中,如已進(jìn)行臨床評估的QS-21皂苷類佐劑。然而,基于碳水化合物的佐劑是如何發(fā)揮增強(qiáng)免疫應(yīng)答的機(jī)制尚不完全清楚。因此,為了更好地研發(fā)新型佐劑,加快新疫苗的開發(fā),本綜述對基于碳水化合物佐劑的作用機(jī)制相關(guān)的研究進(jìn)行總結(jié)梳理,以期為佐劑的進(jìn)一步研究提供參考。

1 基于碳水化合物的佐劑概述

基于碳水化合物的佐劑是安全且具有生物相容性的化合物,開發(fā)的疫苗特別適用于一些對鋁佐劑無良好效果的胞內(nèi)病原體[6],原因在于碳水化合物在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的信號傳導(dǎo)作用,有很高的安全性和耐受性,在機(jī)體中既能發(fā)揮良好免疫效果又不會造成嚴(yán)重的病理損傷。同時(shí),因?yàn)樘妓衔锊幌皲X佐劑那樣容易在體內(nèi)蓄積,很容易被代謝和排出體外,所以避免了因佐劑而導(dǎo)致免疫激活時(shí)間過長的負(fù)面影響[5]。此外,碳水化合物也顯示出比鋁佐劑具有更少的副作用,如過敏反應(yīng)[7]和肉芽腫的形成。基于碳水化合物的佐劑有許多不同的形式和來源,如基于多糖、脂多糖、皂苷的佐劑和來源于分枝桿菌的碳水化合物佐劑。每一種基于碳水化合物的佐劑都有其獨(dú)特的物理、化學(xué)和免疫特性,可為疫苗的設(shè)計(jì)提供廣泛的選擇。

2 基于多糖的佐劑

多糖一般來源于多種生物體的合成代謝產(chǎn)物,包括植物、動物和微生物(真菌和細(xì)菌)。這些多糖不僅在結(jié)構(gòu)和能量儲存方面具有重要的生物學(xué)功能,而且還可與宿主免疫系統(tǒng)相互作用,調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答,因此,它們也被歸類為免疫調(diào)節(jié)劑或生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑[8]。許多能與模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)結(jié)合并刺激免疫系統(tǒng)的多糖,如α-葡聚糖、β-葡聚糖、殼聚糖等,都具有作為免疫佐劑的潛力。

2.1 α-葡聚糖

葡聚糖是植物或微生物衍生的多糖,由重復(fù)的D-葡萄糖單元通過糖苷鍵連接而成。α-葡聚糖幾乎存在于所有的生命領(lǐng)域,這些由α-1,4和α-1,6分支形成的葡萄糖鏈?zhǔn)羌?xì)胞中最重要的儲存型碳水化合物。由于α-葡聚糖是儲存型碳水化合物,通常不像β-葡聚糖那樣被認(rèn)為是生物活性分子。但根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,許多α-葡聚糖也可作為調(diào)節(jié)劑在免疫應(yīng)答中起著重要作用。最近的研究正在努力闡明α-葡聚糖發(fā)揮其免疫刺激作用的機(jī)制[9]。

常見的α-葡聚糖構(gòu)型是α-1,3、α-1,4和α-1,6。在細(xì)菌、真菌和酵母這些生物體中,α-1,3葡聚糖對于其細(xì)胞壁功能和與宿主的相互作用至關(guān)重要。在致病物種中,如在莢膜組織胞漿菌中,其α-葡聚糖可以調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答,并促進(jìn)免疫細(xì)胞內(nèi)酵母的存活[10];結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁中相關(guān)的α-葡聚糖可介導(dǎo)與單核細(xì)胞的相互作用,干擾單核細(xì)胞的分化,并允許細(xì)菌在潛伏期和再激活期間逃避先天和獲得性免疫應(yīng)答[11]。

雖然關(guān)于α-葡聚糖在調(diào)節(jié)微生物免疫應(yīng)答方面的描述有很多,但關(guān)于α-葡聚糖是如何發(fā)揮免疫刺激特性的報(bào)道卻不多。目前可知的是,α-葡聚糖可識別C型凝集素受體(C-type lectin receptor, CLR)中的DC-SIGN,導(dǎo)致NF-κB的活化,刺激巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)分泌具有免疫抑制作用的IL-10[12-13]。此外,還有文獻(xiàn)報(bào)道α-葡聚糖可被TLR2識別,然后激活髓樣分化因子(myeloid differentiation primary response gene 88, MyD88)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α或α-葡聚糖也可被CD14受體識別,然后誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α[12]。

通過對α-葡聚糖的不斷研究,發(fā)現(xiàn)其可引起免疫應(yīng)答,但關(guān)于α-葡聚糖是通過何種途徑發(fā)揮免疫刺激性的作用機(jī)制目前仍不完全清楚,還需進(jìn)一步研究闡明。

2.2 β-葡聚糖

β-葡聚糖是構(gòu)成真菌、植物、酵母、藻類和一些細(xì)菌細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)成分且具有多種生物活性,并在藥物和保健品中有廣泛的應(yīng)用。目前已知β-葡聚糖的連接構(gòu)型有β-1,3、β-1,4和β-1,6,但只有β-1,3連接的D-葡萄糖主鏈分子具有免疫調(diào)節(jié)和刺激活性[14],所以常被用作研究抗感染疫苗的佐劑和抗腫瘤免疫治療的免疫調(diào)節(jié)劑。當(dāng)β-葡聚糖作為免疫調(diào)節(jié)劑或佐劑時(shí),可被一系列受體[如Dectin-1、補(bǔ)體受體3(complement receptor 3, CR3)、CD5、乳糖神經(jīng)酰胺等]發(fā)現(xiàn)、識別[15]。

2.2.1 Dectin-1受體識別β-葡聚糖的作用機(jī)制 Dectin-1是種一經(jīng)過充分研究的CLRs,負(fù)責(zé)識別β-葡聚糖,在抗真菌感染中發(fā)揮重要作用[16]。雖然目前對其識別機(jī)制的研究較多,但尚未獲得全面的識別機(jī)制。已知的是β-葡聚糖可被CLR中的Dectin-1識別并結(jié)合,結(jié)合的Dectin-1通過雙“LXXY”結(jié)構(gòu)激活激活下游Syk通路,而后通過CARD9或NIK觸發(fā)NF-κB,產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-2、TNF-α、IL-6和IL-10導(dǎo)致T細(xì)胞和B細(xì)胞增殖;還會產(chǎn)生IL-21、IL-23使Th1、Th17反應(yīng)增加;同時(shí)Dectin-1也可通過RAF-1途徑直接觸發(fā)NF-κB通路[15],如圖1所示。

β-葡聚糖通過結(jié)合CR3的α亞基(CD11R3)來激活Src家族激酶,從而直接磷酸化FAK激酶,觸發(fā)不同的途徑,如遷移、細(xì)胞因子和ROS產(chǎn)生。除了CR3通路外,β-葡聚糖還可與Dectin-1結(jié)合,通過“LXXY”結(jié)構(gòu)激活Syk,然后通過CARD9或NIK途徑觸發(fā)NF-κB,產(chǎn)生IL-10、IL-2、IL-23、IL-6和TNF,導(dǎo)致T和B細(xì)胞增殖。Dectin-1也可直接激活Raf-1觸發(fā)NF-κB,使T細(xì)胞和B細(xì)胞增殖β-glucan activates Src family kinases by binding to the alpha subunit of CR3 (CD11R3), which directly phosphorylates FAK kinases and triggers different pathways such as migration, cytokine and ROS production. In addition to the CR3 pathway, β-glucan can also bind to Dectin-1 and activate Syk through the "LXXY" structure, which then triggers NF-κB via the CARD9 or NIK pathways, producing IL-10, IL-2, IL-23, IL-6 and TNF, leading to T and B cell proliferation. Dectin-1 also activates Raf-1 directly to trigger NF-κB, resulting in T and B cell proliferation

2.2.2 補(bǔ)體受體3識別β-葡聚糖的作用機(jī)制 CR3也被稱為膜攻擊復(fù)合體,主要表達(dá)于骨髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞[17]。CR3是由αMβ2(CD11b /CD18)兩種跨膜蛋白組成的二聚體整合素,可通過αM識別并結(jié)合β-葡聚糖類[18]。αMβ2整合素有3種主要構(gòu)象,只有第3種延長-開放構(gòu)象與補(bǔ)體片段iC3b具有較高的親和力。β-葡聚糖可以通過一個凝集素結(jié)構(gòu)域與αM結(jié)合,導(dǎo)致整合素的構(gòu)象變?yōu)檠娱L-開放,從而與iC3b高親和力結(jié)合,啟動CR3信號通路[19],如圖1所示。

但在不同物種和細(xì)胞中,β-葡聚糖在CR3信號通路中發(fā)揮作用的機(jī)制也有區(qū)別。比如在豬中性粒細(xì)胞中β-葡聚糖只與CR3結(jié)合。β-葡聚糖通過結(jié)合Src家族激酶的α亞基(CD11R3)激活Src家族激酶。Src激酶(LYN、HCK、FGR)直接磷酸化局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK),引發(fā)不同的途徑,如遷移、細(xì)胞因子和活性氧產(chǎn)生。Src激酶還可以磷酸化存在于細(xì)胞內(nèi)的Dectin-1的Hemitam結(jié)構(gòu)域或作為適配器蛋白(DAP12, FCRγ)ITAM基序中的酪氨酸,或含F(xiàn)AK在內(nèi)的許多底物。在巨噬細(xì)胞中,β-葡聚糖信號傳導(dǎo)更為復(fù)雜。除了這種CR3信號通路外,有研究者認(rèn)為在豬巨噬細(xì)胞中,Dectin-1和其他假定的β-葡聚糖受體,如清除受體CD36和SCARF1,也負(fù)責(zé)識別β-葡聚糖[20]。

2.2.3 其他受體和β-葡聚糖結(jié)合的作用機(jī)制 β-葡聚糖也可被CD5、乳糖酰神經(jīng)酰胺、清道夫受體等受體識別,不僅在免疫細(xì)胞(如NK細(xì)胞)表面表達(dá),而且在許多非免疫細(xì)胞(如內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞)上也有表達(dá)[15]。Vera等[21]發(fā)現(xiàn)真菌細(xì)胞的聚集效應(yīng)是通過CD5與真菌的β-葡聚糖結(jié)合來介導(dǎo)的。Yang等[22]發(fā)現(xiàn)羧甲基β-葡聚糖可通過上調(diào)內(nèi)毒素來刺激巨噬細(xì)胞上的清道夫受體表達(dá),從而減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),保護(hù)小鼠免受內(nèi)毒素血癥的影響。Tsikitis等[23]發(fā)現(xiàn)乳糖酰神經(jīng)酰胺與β-葡聚糖結(jié)合增強(qiáng)了中性粒細(xì)胞遷移,這可能在癌癥的治療中發(fā)揮重要作用。

雖然β-葡聚糖的免疫調(diào)節(jié)功能早有報(bào)道,但對其免疫調(diào)節(jié)、佐劑作用及其與受體相互作用的研究仍處于初級階段[24]。此外,雖然β-葡聚糖的佐劑作用被普遍接受,但也有一些研究報(bào)道了相反的結(jié)果和結(jié)論。如在一項(xiàng)研究中,當(dāng)將β-葡聚糖或β-葡聚糖顆粒佐劑與流感疫苗一起用于小鼠時(shí),抗體滴度或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答并沒有增強(qiáng)[25]。不一致結(jié)果的出現(xiàn)使得研究者需要對以β-葡聚糖為基礎(chǔ)的疫苗佐劑進(jìn)行更精細(xì)的動物試驗(yàn),以獲得令人信服的數(shù)據(jù)。此外,還需要進(jìn)一步研究β-葡聚糖對各物種中免疫細(xì)胞(如DC、巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞)受體的不同結(jié)合作用及其機(jī)制。

2.3 殼聚糖

殼聚糖是甲殼動物外殼、真菌細(xì)胞壁和昆蟲中提取的幾丁質(zhì)的脫乙酰產(chǎn)物[26]。殼聚糖是一種線性多糖,由葡萄糖胺和N-乙酰葡萄糖胺組成,通過β-(1→4)糖苷鍵連接[27]。同時(shí)殼聚糖作為一種陽離子多糖,由于其抗炎、增強(qiáng)免疫、低敏感性、生物相容性等特性受到了越來越多的關(guān)注,是作為佐劑的理想材料之一。

2.3.1 殼聚糖的作用機(jī)制 早在20世紀(jì)80年代,Suzuki等[28]就證實(shí)殼聚糖具有佐劑的特性。通過對殼聚糖的研究發(fā)現(xiàn),殼聚糖可介導(dǎo)炎性小體激活從而引起細(xì)胞免疫。Bueter等[29]發(fā)現(xiàn)殼聚糖可激活巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和DC中的NLRP3炎性小體,使IL-1β分泌增加。此外,還有研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖還可以通過cGAS-STING途徑增加Ⅰ型干擾素產(chǎn)生,以促進(jìn)DC成熟。Carroll等[30]報(bào)道殼聚糖暴露可造成線粒體應(yīng)激,從而導(dǎo)致線粒體活性氧產(chǎn)生與線粒體DNA一起釋放到細(xì)胞質(zhì)中,繼而激活cGAS-STING途徑,誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生,激活DC。成熟的DC可促進(jìn)Th1反應(yīng),從而促使Th1細(xì)胞分泌IFN-γ,漿細(xì)胞分泌免疫球蛋白IgG2c共同發(fā)揮免疫作用,如圖2所示。

殼聚糖通過cGAS-STING途徑誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素(INF)的產(chǎn)生,進(jìn)一步使DC成熟促進(jìn)Th1細(xì)胞、漿細(xì)胞分泌IFN-γ和IgG2c共同發(fā)揮免疫應(yīng)答。殼聚糖還可激活DC中的NLRP3炎性小體使IL-1β的分泌增加,發(fā)揮免疫應(yīng)答Chitosan induces type I interferon (INF) production via the cGAS-STING pathway, further enabling DC maturation to promote the secretion of IFN-γ and IgG2c by Th1 cells and plasma cells together to exert an immune response. Chitosan also activates NLRP3 inflammatory vesicles in DCs to increase IL-1β secretion and exert an immune response

2.3.2 季銨化殼聚糖的作用機(jī)制 由于殼聚糖不良的水溶性,限制了其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。為了提高殼聚糖的溶解性和生物活性,通常將殼聚糖改性成羧甲基殼聚糖、季銨化殼聚糖、羥丙基殼聚糖等衍生物。其中殼聚糖季銨化是殼聚糖的一種陽離子生物聚合物,是殼聚糖的理想衍生物。

季銨化殼聚糖有較好的溶解度,克服了殼聚糖難溶解這一缺點(diǎn)。同時(shí)季銨化殼聚糖也可作為佐劑,具有免疫增強(qiáng)劑和遞送系統(tǒng)這2種佐劑模式。首先,作為免疫增強(qiáng)劑,季銨化殼聚糖可以通過激活先天免疫Toll樣受體(Toll-like receptors, TLR)誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。其次,作為包裹抗原的遞送系統(tǒng),季銨化殼聚糖主要起到保護(hù)抗原,并將抗原靶向給抗原提呈細(xì)胞(APC)的作用[31]。

2.3.3 基于殼聚糖的納米顆粒 由于殼聚糖不僅可以用作免疫增強(qiáng)劑,還可以用作遞送系統(tǒng)。所以常將殼聚糖制作成納米微球來遞送抗原。作為納米微球的殼聚糖可以和帶負(fù)電的抗原結(jié)合,以儲存和減緩抗原釋放并激活A(yù)PC,使Th1/Th2反應(yīng)更加平衡[32]。同時(shí)基于殼聚糖的納米顆粒還可以提供抗原保護(hù),防止酶降解,從而提高生物利用度,延長循環(huán)時(shí)間和抗原半衰期[33]?；跉ぞ厶堑募{米顆粒表現(xiàn)出的良好佐劑作用,為疫苗領(lǐng)域提供了一種有前景的佐劑形式[34]。

雖然FDA已批準(zhǔn)殼聚糖在食品和藥物中使用,但殼聚糖或其衍生物尚未被FDA批準(zhǔn)用于疫苗配方。作為一種天然產(chǎn)物,其脫乙酰度、分子量、納米粒徑大小、溶解度、黏度、純度等因素高度影響抗原釋放、免疫反應(yīng)、釋放時(shí)間、識別和攝取。雖然這些因素大多數(shù)都已在小鼠中進(jìn)行了測試,但要更廣泛地使用還需要在非嚙齒動物(豬、山羊等)上將殼聚糖、殼聚糖衍生物和殼聚糖納米顆粒進(jìn)行充分的動物安全性和有效性研究。

3 基于脂多糖的佐劑

脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外壁的組成成分,是天然免疫系統(tǒng)的強(qiáng)激活劑。將脂多糖及其衍生物添加到疫苗中可起到佐劑的作用。目前,關(guān)于LPS的研究也是極為廣泛的,尤其是其發(fā)揮促炎功能的作用機(jī)制。

3.1 LPS的作用機(jī)制

LPS進(jìn)入機(jī)體后與LPS結(jié)合蛋白(LBP)結(jié)合形成LBP-LPS復(fù)合物,然后與TLR4-MD2復(fù)合物結(jié)合并傳遞信號進(jìn)入胞內(nèi),激活MyD88,而后與IL-1R相關(guān)蛋白激酶(interleukin-1 receptor-associated kinase, IRAK)結(jié)合,并把信號傳給腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TNF receptor associated factor 6, TRAF6),使之活化,活化的TRAF6會激活相應(yīng)的NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)兩條通路。通過這兩條通路,最終引起IL-1、IL-6、TNF-α和NO等的釋放,引起炎癥反應(yīng)。此外,LPS還可以通過TIRAP/Mal途徑激活RNA依賴性蛋白激酶(double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR)和干擾素調(diào)節(jié)因子-3(interferon regulatory factor 3, IRF3)發(fā)出信號。并且LPS除了與TLR4結(jié)合外,其他細(xì)胞表面分子也可感知LPS,如巨噬細(xì)胞清道夫受體和CD11b/CD18[35]。同時(shí),據(jù)研究發(fā)現(xiàn),LPS還可被巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的C型凝集素(MINCLE)識別。

雖然脂多糖具有免疫刺激性,但天然的脂多糖具有一定的內(nèi)毒素活性。為降低脂多糖在疫苗中的內(nèi)毒素活性,研究人員開發(fā)研究了其衍生物。

3.2 單磷基脂質(zhì)A

脂多糖由脂質(zhì)A、核心多糖和O-多糖側(cè)鏈三部分組成[36]。脂質(zhì)A是LPS的疏水結(jié)構(gòu)域,可將LPS錨定在細(xì)菌細(xì)胞膜上,也是LPS識別人類先天免疫系統(tǒng)的主要表位[37]。脂質(zhì)A是LPS最具免疫活性的成分,研究人員對脂質(zhì)A的結(jié)構(gòu)進(jìn)行化學(xué)修飾得到了單磷基脂質(zhì)A(monophosphoryl lipid A, MPL)。

MPL不僅降低了內(nèi)毒素活性,還保留了LPS的佐劑特性。并且MPL也是繼明礬后被允許添加在疫苗中的佐劑。目前MPL是AS01和AS04佐劑的組成部分,被應(yīng)用于水痘帶狀皰疹疫苗Shingrix[38]和HBV疫苗Fendrix中。MPL作為LPS的衍生物,其發(fā)揮免疫應(yīng)答的機(jī)制與LPS相似。MPL也可激活TLR4與TLR4-MD2復(fù)合物結(jié)合,從而激活免疫細(xì)胞釋放炎癥因子。MPL在DC中除引發(fā)NF-κB和MAPK兩條通路誘導(dǎo)促炎因子的釋放外,也可刺激DC導(dǎo)致明顯的依賴mTOR的葡萄糖代謝激活,誘導(dǎo)IL10和CCL2的產(chǎn)生[39]。上述研究說明深入了解MPL激活DC的機(jī)制將提高對其佐劑特性的認(rèn)識,并有助于這種有前途佐劑的未來發(fā)展和安全應(yīng)用。

4 基于皂苷的佐劑

皂苷是來源于植物的天然產(chǎn)物,由一個親脂性三萜核心和一個或多個寡糖鏈組成,具有一系列的生物活性。目前作為疫苗佐劑使用的皂苷多是從藜屬植物中提取的。皂苷提取物有很多種,如QS-7、QS-17/18和QS-21。但最常用的皂苷提取物就是QS-21,因?yàn)樗艽碳h2體液和Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答。

4.1 QS-21的作用機(jī)制

雖然QS-21佐劑在臨床試驗(yàn)中經(jīng)常被用于各種傳染病和癌癥疫苗,但人們對其作用機(jī)制仍了解甚少。有人提出假說認(rèn)為,QS-21可能通過其碳水化合物結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞表面凝集素結(jié)合,從而促進(jìn)抗原被APC識別,而后導(dǎo)致特定的細(xì)胞因子譜增強(qiáng)T和(或)B細(xì)胞的反應(yīng)[40]。

隨后,Marciani[41]又提出了一種有效的作用機(jī)制,即QS-21作用于DC和T細(xì)胞。外源蛋白抗原和QS-21通過膽固醇依賴的內(nèi)吞作用進(jìn)入DC后被早期的核內(nèi)體吞噬,并且蛋白抗原在后期核內(nèi)體中被裂解,隨后在QS-21的作用下核內(nèi)體膜被破壞,裂解的蛋白抗原可以通過蛋白酶體途徑在胞質(zhì)中進(jìn)一步加工成更小的肽片段;加工好的肽片段進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER),再通過高爾基體遷移到細(xì)胞表面,最后與MHC-Ⅰ相關(guān)的T細(xì)胞受體(T cell receptor, TCR)結(jié)合被遞呈給CD8+T細(xì)胞。在CD8+T細(xì)胞上,QS-21上的醛基與T細(xì)胞表面受體(如CD2)的氨基基團(tuán)形成亞胺,向T細(xì)胞傳遞共刺激信號。這個信號在MAPK酪氨酸磷酸化水平上與TCR介導(dǎo)的信號融合,結(jié)合細(xì)胞K+-Na+轉(zhuǎn)運(yùn)的變化,刺激T細(xì)胞激活偏向于Th1反應(yīng),并產(chǎn)生Th1型細(xì)胞因子[42]。

同時(shí),許多研究又探討了在小鼠APCs中,將QS-21與TLR4激動劑MPLA聯(lián)合使用,會激活NLRP3炎性小體并引起Caspase-1依賴性促炎細(xì)胞因子IL-1β/IL-18的釋放。而細(xì)胞因子IL-1β/IL-18可分別促進(jìn)Th17細(xì)胞成熟或驅(qū)動INF-γ介導(dǎo)的Th1應(yīng)答[43]。

4.2 皂苷衍生物

盡管QS-21已被用于許多疫苗的臨床研究,但天然QS-21存在的一些缺陷,如其化學(xué)不穩(wěn)定性、劑量限制毒性和對作用機(jī)制的了解不足等,限制了其廣泛的臨床應(yīng)用。為了克服這些缺陷,人們通過化學(xué)合成的方法對天然產(chǎn)物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾,制備了近50種皂苷類似物[40]。同時(shí)基于QS-21的化學(xué)探針(放射性標(biāo)記和熒光合成變體)已用于體內(nèi)生物分布和熒光成像研究,并探索其作用機(jī)制。

5 分枝桿菌碳水化合物佐劑

5.1 脂阿拉伯甘露聚糖

脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)是分枝桿菌細(xì)胞壁的主要糖脂成分,由一個酰基化磷脂酰肌醇錨定物、糖基化的甘露聚糖主干和一個阿拉伯甘露聚糖分支組成[45]。據(jù)研究發(fā)現(xiàn),LAM在感染期間是宿主免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)劑。所以在某些情況下,LAM會當(dāng)佐劑使用。作為佐劑的LAM可影響宿主的免疫應(yīng)答,故闡明LAM在宿主中的免疫受體與作用機(jī)制是非常重要的。

目前研究發(fā)現(xiàn),LAM可以與APC的TLR2和CLRs中的Dectin-2、甘露糖受體、SIGNR3和DC-SIGN相互作用[46],從而促進(jìn)促炎細(xì)胞因子(TNF、IL-12)的產(chǎn)生[47]。然而,甘露糖加帽的LAM(Man-LAM)不僅可以增強(qiáng)免疫刺激應(yīng)答,誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子分泌,還可以誘導(dǎo)具有免疫抑制性的細(xì)胞因子(IL-10)的產(chǎn)生[48]。LAM的兩面性體現(xiàn)了碳水化合物在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中的復(fù)雜性。

5.2 海藻糖-6,6′-二霉菌酸酯

海藻糖-6,6′-二霉菌酸酯(TDM)具有極強(qiáng)的佐劑活性。它與兩種CLRs,巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的C型凝集素(Mincle)和巨噬細(xì)胞C型凝集素(MCL)結(jié)合可誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和細(xì)胞免疫應(yīng)答[49]。Werninghaus 等[50]研究發(fā)現(xiàn),TDM在Mtb疫苗中是通過Syk-Card9-Bcl10-Malt1途徑來傳導(dǎo)信號,從而激活巨噬細(xì)胞和DC以誘導(dǎo)Th1和Th17細(xì)胞反應(yīng)。然而,TDM的高反應(yīng)性使其不適合用于人類疫苗,所以開發(fā)了具有更短?；湣⒆魟┬Я︻愃坪投拘愿〉暮铣蒑incle配體——海藻糖-6,6-二山崳酸酯(TDB)。TDB作為佐劑CAF01的組成部分,目前已在多種疫苗中有所研究,如在結(jié)核病疫苗中CAF01與Ag85B、ESAT-6、Rv2660融合蛋白設(shè)計(jì)出了疫苗H56/CAF01;與Ag85B、ESAT-6的融合蛋白設(shè)計(jì)出了疫苗H1/CAF01[51-52],這兩種疫苗免疫后均可產(chǎn)生CD4+T細(xì)胞反應(yīng)。

5.3 肽聚糖

肽聚糖(PG)是圍繞在革蘭陽性菌和革蘭陰性菌細(xì)胞質(zhì)膜周圍的保護(hù)層,但在革蘭陽性菌中要厚得多。胞壁酰二肽(MDP)是分枝桿菌PG的天然成分,具有佐劑活性。MDP可與細(xì)胞內(nèi)受體NOD2結(jié)合[53],導(dǎo)致NF-κB和MAPK活化并誘導(dǎo)促炎反應(yīng)。由于NOD是增強(qiáng)先天免疫應(yīng)答和針對癌細(xì)胞免疫應(yīng)答有希望的靶標(biāo)[54],所以MDP及其類似物多年來被廣泛用于癌癥疫苗佐劑。不幸的是,在大多數(shù)情況下,MDP分子及其合成的類似物都被證明有嚴(yán)重的副作用。因此,尋找毒性小和更有效的MDP類似物作為抗癌劑和疫苗佐劑具有重要意義。

6 討論與展望

基于碳水化合物的佐劑與明礬相比,它們具有副作用少,可激活體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的優(yōu)點(diǎn),并且還能夠幫助產(chǎn)生針對胞內(nèi)病原體的免疫應(yīng)答。在本文中,作者總結(jié)了關(guān)于基于碳水化合物佐劑及其衍生物在免疫增強(qiáng)機(jī)制方面的研究,以及簡單介紹了它們在預(yù)防傳染病疫苗中的一些應(yīng)用,見表1。雖然目前對許多佐劑確切作用機(jī)制的認(rèn)識還存在空白,如基于皂苷的佐劑,但可以通過研究進(jìn)一步加深對基于碳水化合物佐劑的作用機(jī)制的理解,并采用化學(xué)合成的方法和開發(fā)新的化學(xué)工具來加強(qiáng)對基于碳水化合物佐劑分子作用機(jī)制的認(rèn)識,從而為設(shè)計(jì)更合理、更有效和更安全的佐劑提供科學(xué)依據(jù),為人類和動物傳染病新型疫苗的創(chuàng)制提供參考。

表1 基于碳水化合物佐劑作用機(jī)制總結(jié)