劉 斌,王 萌,潘陽(yáng)陽(yáng),王靖雷,徐庚全

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,蘭州 730070)

卵丘細(xì)胞(cumulus cells, CCs)與卵母細(xì)胞(Oocyte)之間雙向的信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)于卵泡內(nèi)微環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定至關(guān)重要,可促進(jìn)原始卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育、卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂、排卵、受精及胚胎發(fā)育[1-2]。卵母細(xì)胞不能直接利用葡萄糖,因此需要CCs通過(guò)多種代謝途徑將葡萄糖轉(zhuǎn)化為能量,并將其輸送給卵母細(xì)胞發(fā)揮作用[3-4]。同時(shí),CCs中的線粒體功能障礙可影響卵巢功能和生殖能力[4-5]。CCs中多功能蛋白聚糖(versican, VCAN)基因表達(dá)水平與早期胚胎形態(tài)發(fā)育呈正相關(guān),可用于卵母細(xì)胞發(fā)育能力以及胚胎形態(tài)評(píng)估[6]。

卵丘擴(kuò)張是一個(gè)重要的生理過(guò)程,是卵母細(xì)胞在體內(nèi)正常發(fā)育的必要條件,在卵丘擴(kuò)張過(guò)程中相關(guān)因子(如透明質(zhì)酸合成酶2(hyaluronate synthase 2, HAS2)、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2, PTGS2)和正五聚蛋白3(pentraxin 3, PTX3))可作為生物標(biāo)記物用于監(jiān)測(cè)卵母細(xì)胞或者胚胎的動(dòng)態(tài)發(fā)育過(guò)程[7-8]。HAS是合成透明質(zhì)酸(hyaluronic acid, HA)的重要底物。CCs在擴(kuò)張過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的透明質(zhì)酸,不僅使卵巢變得具有粘彈性,還促成卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體 (cumulus-oocyte complex, COCs)在排卵期間通過(guò)破裂的卵泡壁逸出,并且有利于向卵母細(xì)胞發(fā)出信號(hào)以恢復(fù)減數(shù)分裂和精子活動(dòng)的微環(huán)境[9-10]。PTGS2,也稱(chēng)為環(huán)加氧酶 2(cyclooxygenase 2, COX2),是前列腺素(PGs) 產(chǎn)生的一種限速酶,在妊娠早期起著至關(guān)重要的作用,包括排卵、受精、著床和蛻膜化[11]。PTX3是排卵前小鼠(Musmusculus) CCs中卵母細(xì)胞上調(diào)最多的基因之一,參與卵丘基質(zhì)的形成[12]。PTGS2與PTX3基因的缺失可導(dǎo)致不育,這與COCs排卵異常導(dǎo)致卵母細(xì)胞受精失敗有關(guān)[11-12]。卵丘擴(kuò)張過(guò)程中,由HAS2、VCAN和PTX3形成富含HA的卵丘細(xì)胞外基質(zhì)[3]。在排卵前黃體生成素激增,誘導(dǎo)卵丘擴(kuò)張相關(guān)基因(HAS2、VCAN和PTX3)的表達(dá),它們分別控制HA和前列腺素等的表達(dá)[13]。

溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA)是一種生物活性化合物,由分泌型磷脂酶A2和溶血磷脂酶D共同作用于膜磷脂產(chǎn)生[14-15]。LPA可以激活6種LPA受體(LPAR1～6),進(jìn)而調(diào)節(jié)各種細(xì)胞活動(dòng),例如細(xì)胞增殖、細(xì)胞保護(hù)和傷口愈合[14-15]。受體(LPAR1～3)介導(dǎo)的LPA信號(hào)在正常卵巢和子宮功能的發(fā)揮、發(fā)情周期的調(diào)節(jié),早期胚胎發(fā)育、胚胎植入,妊娠維持和分娩過(guò)程中發(fā)揮作用[16]。卵巢和子宮中LPA信號(hào)傳導(dǎo)的數(shù)據(jù)表明,LPA可以通過(guò)其對(duì)早期胚胎發(fā)育的影響直接促進(jìn)胚胎與母體之間的相互作用[17-18]。LPA通過(guò)影響卵母細(xì)胞發(fā)育和存活,從而影響卵子的質(zhì)量和數(shù)量[17]。LPA還可以通過(guò)與其受體LPAR3結(jié)合,從而影響胚胎的著床以及胚胎與母體之間的相互信號(hào)交流[17]。

牦牛(bosgrunniens)主要生活在青藏高原及相鄰的高海拔地區(qū)[19-20]。為適應(yīng)高原的惡劣條件,牦牛具有獨(dú)特的形態(tài)和生理、生化特征。由于牦牛生活的地區(qū)環(huán)境惡劣、飼養(yǎng)和管理水平較低,其自然繁殖率較低[19-20]。為了改善牦牛人工繁殖技術(shù)的效率和成功率,提高牦牛繁殖率,研究牦牛生殖功能和卵丘擴(kuò)張具有重要的科學(xué)與生產(chǎn)意義。有研究表明,添加外源性LPA可以提高奶牛卵母細(xì)胞成熟率,降低COCs的凋亡率,維持卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中發(fā)育能力相關(guān)因子的表達(dá),進(jìn)而影響囊胚期的基因表達(dá)譜[21],但其對(duì)YCCs擴(kuò)張相關(guān)因子表達(dá)的影響尚不清楚。因此,本研究以LPA為切入點(diǎn),旨在探討不同濃度LPA對(duì)牦牛卵丘細(xì)胞(yak cumulus cells, YCCs)中卵丘擴(kuò)張因子HAS2、PTGS2和PTX3表達(dá)的影響,以期為進(jìn)一步研究LPA在牦牛生殖方面的功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

研究過(guò)程中所使用的試劑主要有:LPA購(gòu)于Sigma公司(上海);DMEM F12 培養(yǎng)基(DMEM/F-12)、青霉素、鏈霉素、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)均購(gòu)于 Gibco 公司(美國(guó));透明質(zhì)酸酶、胰蛋白酶等均購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司。蛋白免疫印跡試驗(yàn)所用蛋白抗體均購(gòu)于上海艾博抗(Abcam)公司,其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

本研究所使用的儀器主要有:PCR儀(美國(guó),Bio-Rad);SDS-PAGE電泳槽(美國(guó),Rio-Rad公司);恒溫培養(yǎng)箱(日本,松下);超靈敏多功能成像儀(美國(guó),GE Healthcare)。

1.2 試驗(yàn)樣本采集

牦牛卵巢采自位于甘肅臨夏的健康成年(3～4歲)雌牦牛。隨后在含1%青霉素和鏈霉素的無(wú)菌鹽水中清洗干凈后,在25～30 ℃下,4 h內(nèi)將卵巢送至實(shí)驗(yàn)室。

1.3 牦牛卵丘細(xì)胞培養(yǎng)及處理

牦牛卵巢用37 ℃含1%青霉素和鏈霉素的生理鹽水清洗3次。使用18～21號(hào)針頭,從健康的竇狀卵泡中吸出卵泡液后,將其轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中,在倒置顯微鏡下挑選出COCs,體外培養(yǎng)成熟,用0.1%透明質(zhì)酸酶將卵丘細(xì)胞消化至脫落。用完全培養(yǎng)基(含10% FBS、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)基)和透明質(zhì)酸酶,1 500 r·min-1離心5 min棄去上清液。在培養(yǎng)基中離心洗滌兩次后,將細(xì)胞重懸后接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,在37 ℃下、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

取第二代YCCs,以3×106個(gè)·孔-1的密度將YCCs接種于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～70%時(shí),DMEM/F-12饑餓12 h,使細(xì)胞處于同一細(xì)胞周期,然后加入LPA (空白對(duì)照、陰性對(duì)照、5、15、30和50 μmol·L-1)[21-22]培養(yǎng)24 h,收集樣品用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞活性試驗(yàn)

將傳代培養(yǎng)至第二代的YCCs以5×104個(gè)·mL-1的密度接種在4個(gè)96孔板中,每孔100 μL,培養(yǎng)24 h。隨后棄掉培養(yǎng)基,在各孔中加入不同濃度的LPA和DMEM/F-12培養(yǎng)基,4個(gè)96孔板分別于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育12、24、36、48 h后,去除培養(yǎng)液。向每孔中加入100 μL DMEM/F-12培養(yǎng)基,并加入10 μL CCK-8試劑,繼續(xù)培養(yǎng)2 h,450 nm處檢測(cè)各孔吸光度。

1.5 RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)

用微量RNA提取試劑盒提取總RNA,然后使用兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)cDNA。將得到的cDNA擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,驗(yàn)證產(chǎn)物的完整性及引物的特異性。

使用SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR試劑盒,在LightCycler?480 Instrument II上以20 μL的反應(yīng)體系進(jìn)行3次重復(fù)反應(yīng)。使用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)靶基因和參考基因引物序列(表1),RT-qPCR 反應(yīng)體系由 cDNA (1 μL)、引物 (10 pmol·mL-1, 0.8 μL)、SYBR Premix Ex Taq II (10 μL)和 ddH2O (7.4 μL)組成。RT-qPCR條件為95 ℃ 10 min(預(yù)變性),95 ℃ 15 s(DNA變性),55 ℃ 30 s(退火),72 ℃ 18 s(延伸),72 ℃ 10 min(最終延伸),共45個(gè)循環(huán)。使用β-actin作為參考基因,在3個(gè)重復(fù)中量化每個(gè)樣品中的基因表達(dá)水平。采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列信息

1.6 Wstern blot

用PBS清洗六孔板中的CCs,加入蛋白裂解緩沖液,使CCs徹底裂解。然后加入蛋白上樣緩沖液,內(nèi)含十二烷基硫酸鈉(SDS),金屬浴15 min使蛋白變性。變性后的蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。通過(guò)濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉在室溫下封閉蛋白質(zhì)4 h。加入一抗(HAS2(1∶800稀釋);PTGS2(1∶800稀釋);PTX3(1∶500稀釋);β-actin抗體(1∶8 000)稀釋)后,在4 ℃下孵育PVDF膜過(guò)夜,然后進(jìn)行PBST清洗。以Goat Anti-Rabbit IgG/HRP抗體為二抗(稀釋比例1∶8 000)室溫孵育1 h并用PBST清洗。使用電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒曝光,并由Amersham Imager 600拍照。蛋白質(zhì)條帶的IOD值(蛋白質(zhì)表達(dá)水平=目的IOD/內(nèi)部參考IOD)通過(guò)Image-Pro Plus軟件測(cè)量。

1.7 免疫熒光染色檢測(cè)卵丘細(xì)胞擴(kuò)張因子的表達(dá)

細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后,DME/F12培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12 h。基于 Western blot的研究結(jié)果,分別選擇空白對(duì)照組、15 μmol·L-1處理組調(diào)控YCCs 24 h。在室溫下用4%多聚甲醛固定1 h后,使用PBS清洗3次,5 min·次-1。然后用0.2% TritonX-100將YCCs細(xì)胞膜透化8 min。使用PBS清洗3次,5 min·次-1。接下來(lái),用2% BSA封閉1 h。按照1∶200稀釋比例添加HAS2、PTGS2、PTX3的一抗,4 ℃孵育過(guò)夜。使用PBS清洗3遍,5 min·次-1。添加二抗(Alexa Fluor 594標(biāo)記的山羊抗兔IgG , 1∶1 000稀釋) 室溫孵育1 h。使用PBS清洗3遍,5 min·次-1。用DAPI對(duì)細(xì)胞核染色5 min,使用PBS清洗3遍,5 min·次-1。用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 22.0(SPSS Inc,美國(guó))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Graphpad prism 8.0用于制圖。所有數(shù)據(jù)均以“平均值±SD”表示,P<0.05表示差異顯著,P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 牦牛卵丘細(xì)胞體外培養(yǎng)

在YCCs接種培養(yǎng)瓶6 h后,CCs開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)。并且隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,CCs開(kāi)始聚集,細(xì)胞間的間隔逐漸減小。最終,在培養(yǎng)瓶底部形成大小均一,形態(tài)良好的CCs (圖1)。細(xì)胞呈梭型或多邊形。

圖1 體外傳代培養(yǎng)的牦牛卵丘細(xì)胞(10×)Fig.1 In vitro cultured yak cumulus cells at passage (10×)

2.2 LPA對(duì)牦牛卵丘細(xì)胞活性的影響

LPA孵育不同時(shí)間對(duì)牦牛卵丘細(xì)胞活性影響的結(jié)果如圖2所示:當(dāng)孵育時(shí)間為12 h時(shí),與空白對(duì)照組相比,各濃度的LPA對(duì)細(xì)胞活性均有明顯的促進(jìn)作用(P<0.05)。隨著LPA濃度的增加及孵育時(shí)間的延長(zhǎng),LPA對(duì)細(xì)胞活性的促進(jìn)作用均逐漸增強(qiáng)。當(dāng)孵育時(shí)間為24 h時(shí),與空白對(duì)照組相比,各濃度LPA對(duì)細(xì)胞活性的促進(jìn)作用最明顯(P<0.05)。當(dāng)孵育時(shí)間為36 和48 h時(shí),LPA對(duì)細(xì)胞活性的促進(jìn)作用逐漸下降。相比較于對(duì)照組而言,當(dāng)LPA濃度為15 μmol·L-1時(shí),不同孵育時(shí)間中YCCs的活性提升最為顯著(P<0.05)。

A、B、C和D分別為L(zhǎng)PA孵育12、24、36 和48 h對(duì)牦牛卵丘細(xì)胞活性的影響。柱形圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05),下同A, B, C and D show the effects of LPA incubation for 12, 24, 36 and 48 h on the viability of yak cumulus cells. In the bar chart, the different letters indicate significant difference (P<0.05), the same as below

2.3 LPA對(duì)牦牛卵丘擴(kuò)張相關(guān)因子表達(dá)的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示,LPA對(duì)牦牛CCs中卵丘擴(kuò)張相關(guān)因子HAS2、PTGS2、PTX3的表達(dá)在5～50 μmol·L-1范圍內(nèi)表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用。當(dāng)LPA濃度為15 μmol·L-1時(shí),與空白對(duì)照組相比,HAS2、PTGS2、PTX3 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平達(dá)到最高(圖3,P<0.05)。當(dāng)LPA濃度大于15 μmol·L-1時(shí),HAS2、PTGS2、PTX3 mRNA的表達(dá)水平降低,但與空白對(duì)照和陰性對(duì)照組相比仍然差異顯著(P<0.05)。

圖3 不同濃度LPA處理后YCCs中HAS2、PTGS2、PTX3 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平Fig.3 Relative expression levels of HAS2,PTGS2 and PTX3 mRNA in YCCs treated with different concentrations of LPA

2.4 LPA對(duì)YCCs卵丘擴(kuò)張相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot用于檢測(cè)LPA處理后CCs中目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平(圖4)。LPA處理的YCCs中卵丘擴(kuò)張相關(guān)蛋白HAS2、PTGS2、PTX3的表達(dá)在5～50 μmol·L-1范圍內(nèi)表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用。當(dāng)LPA濃度為15 μmol·L-1時(shí),與空白對(duì)照組相比,HAS2、PTGS2、PTX3 蛋白的相對(duì)表達(dá)水平達(dá)到最高(P<0.05)。當(dāng)LPA濃度大于15 μmol·L-1時(shí),HAS2、PTGS2、PTX3 蛋白的表達(dá)水平降低。

A、B、C圖中:上部分為HAS2、PTGS2、PTX3 Western blot條帶圖。從左到右依次為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、5 μmol·L-1、15 μmol·L-1、30 μmol·L-1、50 μmol·L-1處理組。下部分分別表示不同濃度LPA處理后牦牛CCs中HAS2、PTGS2、PTX3蛋白的相對(duì)表達(dá)水平In figure A, B and C: The upper part is divided into HAS2, PTGS2 and PTX3 Western blot strip. From left to right are blank control group, negative control group, 5 μmol·L-1, 15 μmol·L-1, 30 μmol·L-1, 50 μmol·L-1 treatment group. The following sections respectively show the relative expression levels of HAS2, PTGS2 and PTX3 proteins in yak CCs treated with different concentrations of LPA

2.5 免疫熒光染色檢測(cè)牦牛卵丘細(xì)胞中卵丘擴(kuò)張因子相關(guān)蛋白的表達(dá)與分布

分別選擇15 μmol·L-1處理組,即卵丘擴(kuò)張相關(guān)蛋白在Western blot試驗(yàn)中相對(duì)表達(dá)水平最高的一組,以空白組為對(duì)照,檢測(cè)YCCs中卵丘擴(kuò)張相關(guān)蛋白的表達(dá)與分布。免疫熒光結(jié)果顯示(圖5),卵丘擴(kuò)張相關(guān)蛋白HAS2、PTGS2、PTX3均在YCCs中表達(dá),主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),核表達(dá)較弱。而LPA處理后的樣本,卵丘擴(kuò)張相關(guān)蛋白在CCs細(xì)胞質(zhì)中的熒光標(biāo)記顯著增強(qiáng),這說(shuō)明LPA能夠參與卵丘擴(kuò)張因子相關(guān)蛋白的分泌過(guò)程。

紅色熒光為靶蛋白,藍(lán)色熒光為細(xì)胞核。從左往右每一列分別表示目標(biāo)蛋白、細(xì)胞核和疊加圖像。從上往下每一行分別表示HAS2、PTGS2、PTX3空白對(duì)照組與15 μmol·L-1處理組Red fluorescence is target proteins and blue fluorescence is nucleus. Each column from left to right represents the target protein, nucleus, and merge. Each row from top to bottom represents the HAS2, PTGS2, PTX3 blank control group, and 15 μmol·L-1 treatment group, respectively

3 討 論

卵丘擴(kuò)張是卵巢釋放可受精卵的必要條件,對(duì)哺乳動(dòng)物的正常受精至關(guān)重要[23]。卵丘擴(kuò)張可使COCs從卵泡壁松動(dòng)和分離,最終被輸卵管接納。HAS2、PTGS2和PTX3參與調(diào)節(jié)卵丘基質(zhì)功能和卵丘擴(kuò)張過(guò)程,這表明卵丘擴(kuò)張因子可以幫助預(yù)測(cè)卵母細(xì)胞質(zhì)量以及隨后的胚胎發(fā)育過(guò)程[24-25]。小鼠(Musmusculus)敲除LPA3基因后,胚胎植入子宮壁的時(shí)間和間隔受到影響[26],而小鼠敲除LPA1、LPA2、LPA3基因后,精子產(chǎn)量降低,交配活動(dòng)降低,隨后出現(xiàn)與年齡相關(guān)的無(wú)精子癥[27]。這說(shuō)明LPA在雄性和雌性動(dòng)物生殖系統(tǒng)中都發(fā)揮著重要作用,但是它們對(duì)牦牛CCs的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。因此本試驗(yàn)以CCs為研究對(duì)象,探究不同濃度LPA對(duì)卵丘細(xì)胞中HAS2、PTGS2和PTX3表達(dá)的影響,從而為提高牦牛卵母細(xì)胞的質(zhì)量和體外受精(invitrofertilization, IVF)成功率的研究提供理論基礎(chǔ)。

CCs凋亡率與卵母細(xì)胞的成熟、受精及IVF后的妊娠結(jié)局呈負(fù)相關(guān)[28]。在接受IVF過(guò)程之前,如果雌性缺乏CCs,可能會(huì)影響卵巢功能和卵泡發(fā)育,對(duì)胚胎的質(zhì)量和發(fā)育速度產(chǎn)生負(fù)面影響,甚至可能導(dǎo)致切割和胚胎發(fā)育的速度變慢[3-29]。本研究結(jié)果顯示,LPA可以增強(qiáng)CCs中卵丘擴(kuò)張因子HAS2、PTGS2、PTX3的表達(dá),且其作用濃度具有劑量依賴性,最佳濃度為15 μmol·L-1。LPA孵育12、24、36和48 h,對(duì)牦牛卵丘細(xì)胞的活性有著明顯的促進(jìn)作用。卵丘擴(kuò)張過(guò)程中,卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞逐漸增大,并伴隨著細(xì)胞增殖。在牛卵母細(xì)胞體外成熟(invitromaturation, IVM)期間進(jìn)行LPA處理增加了抗凋亡因子(B-cell lymphoma-2,Bcl-2) mRNA的表達(dá)。此外,用LPA處理豬和牛胚胎導(dǎo)致抗凋亡因子Bcl-2 mRNA表達(dá)增加,促凋亡基因Bax和鈣蛋白酶Ⅰ的表達(dá)降低[30-31]。LPA或許也是通過(guò)這種方式促進(jìn)YCCs的活性。LPA能夠刺激細(xì)胞增殖,并且在小鼠中,COCs IVM期間進(jìn)行LPA處理可誘導(dǎo)HA的產(chǎn)生,從而增強(qiáng)卵丘細(xì)胞擴(kuò)增并刺激卵母細(xì)胞成熟。添加成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體抑制劑多靶點(diǎn)受體酪氨酸激酶抑制劑 (SU5402)可以顯著阻斷卵丘擴(kuò)張。添加SU5402還抑制了卵丘擴(kuò)張相關(guān)基因HAS2和PTX3的表達(dá)[32-33]。這說(shuō)明卵丘細(xì)胞活性的變化或許和卵丘擴(kuò)張因子有關(guān)。因此,本研究通過(guò)LPA促進(jìn)卵丘擴(kuò)張相關(guān)基因表達(dá),可能在一定程度上影響卵丘細(xì)胞功能的發(fā)揮以及調(diào)節(jié)牦牛生殖過(guò)程。卵丘擴(kuò)張?jiān)诼涯讣?xì)胞成熟中起著重要作用,與未能擴(kuò)張的卵丘細(xì)胞相關(guān)的卵母細(xì)胞無(wú)法排卵或受精[17]。卵丘細(xì)胞為卵母細(xì)胞提供了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、生存因子、生長(zhǎng)因子以及各種信號(hào)分子,這些物質(zhì)能夠使卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞達(dá)到減數(shù)分裂的能力[34]。有研究表明,PTGS2、HAS2高表達(dá)的卵丘細(xì)胞相比較低表達(dá)水平的卵丘細(xì)胞而言,能產(chǎn)生更高質(zhì)量的卵母細(xì)胞和胚胎[35-36]。小鼠PTGS2、PTX3基因的缺失導(dǎo)致卵丘擴(kuò)張缺陷,排卵受損以及雌性動(dòng)物不孕[3]。這進(jìn)一步說(shuō)明采取一定的措施來(lái)保證卵丘擴(kuò)張基因的正?；蛘吒弑磉_(dá)是有必要的。有研究表明,與未受精或發(fā)育成低質(zhì)量胚胎的卵母細(xì)胞相比,發(fā)育成高質(zhì)量胚胎的卵母細(xì)胞具有更高的HAS2和COX2轉(zhuǎn)錄水平[37]。添加外源性LPA后,奶牛(vitulus) CCs中HAS2、PTGS2、PTX3 mRNA的表達(dá)水平在各處理組間并無(wú)明顯差異[17]。而本研究結(jié)果表明,外源性LPA能夠促進(jìn)它們的表達(dá),并且在15 μmol·L-1促進(jìn)作用最為顯著。這或許是因?yàn)槟膛Ｅc牦牛之間存在種屬差異,以及牦牛在適應(yīng)環(huán)境的過(guò)程中發(fā)生的特異性改變。

先前有研究表明,LPA可以通過(guò)激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶途徑/蛋白激酶B(ERK/Akt)信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)傷口愈合、血液凝固、血壓維持和細(xì)胞過(guò)程,如存活、增殖、分化、遷移、形態(tài)和粘附[38-39]。而ERK1/2信號(hào)通路被激活后,可以進(jìn)一步誘導(dǎo)HAS2、PTGS2、PTX3的表達(dá)[40]。LPA能夠促進(jìn)牦牛生長(zhǎng)分化因子9(growth differentiation factor 9,GDF9)基因的表達(dá),而GDF9已被證實(shí)在卵丘細(xì)胞中能誘導(dǎo)HAS2、PTGS2、PTX3的表達(dá),并最終預(yù)測(cè)卵母細(xì)胞活性[41]。在本研究中,發(fā)現(xiàn)添加LPA顯著增強(qiáng)牦牛卵丘細(xì)胞中HAS2、PTGS2、PTX3的表達(dá),提示外源添加的LPA可能對(duì)牦牛卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程中卵丘擴(kuò)展有作用,其作用機(jī)制可能與激活ERK1/2信號(hào)通路和誘導(dǎo)CDF9表達(dá)有關(guān), 但其具體影響機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究表明,LPA對(duì)YCCs活性具有促進(jìn)作用。當(dāng)孵育時(shí)間為24 h,并且LPA濃度為15 μmol·L-1時(shí),活性提升最為顯著。LPA可以增強(qiáng)CCs中卵丘擴(kuò)張因子HAS2、PTGS2、PTX3的表達(dá),且其作用濃度具有劑量依賴性,最佳濃度為15 μmol·L-1。本研究為闡明LPA促進(jìn)牦牛卵丘細(xì)胞擴(kuò)張的分子機(jī)制提供了理論依據(jù),為進(jìn)一步提高牦牛卵母細(xì)胞的質(zhì)量和體外受精成功率提供理論基礎(chǔ)。