霍元楠,邱美佳,張姣姣,楊煒蓉,王鮮忠*

(1.西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,重慶 400715;2.西華師范大學(xué)生態(tài)研究所,南充 637009)

公豬支持細(xì)胞(sertoli cells,SCs)主要通過(guò)為生殖細(xì)胞提供生理和營(yíng)養(yǎng)支持來(lái)調(diào)節(jié)精子發(fā)生[1],SCs的數(shù)量決定了睪丸的大小和產(chǎn)生精子的能力[2-3]。由于豬陰囊溫度普遍低于正常體溫2～8 ℃,因此公豬對(duì)環(huán)境溫度變化十分敏感,更容易受到高溫影響[4]。有研究發(fā)現(xiàn),熱應(yīng)激導(dǎo)致生精細(xì)胞凋亡[5],其凋亡程度取決于熱應(yīng)激的強(qiáng)度和作用時(shí)間。凋亡對(duì)細(xì)胞最直接的影響會(huì)使細(xì)胞數(shù)量減少[6],熱應(yīng)激通過(guò)導(dǎo)致SCs凋亡,引起生殖細(xì)胞數(shù)量減少[7]。研究熱應(yīng)激條件下SCs的凋亡機(jī)制對(duì)于闡明精子發(fā)生的調(diào)控機(jī)制和提高雄性生殖能力具有重要意義。

精氨酸(arginine,Arg)是一種多功能氨基酸,在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)主要以L(fǎng)-精氨酸的方式存在,能提高生長(zhǎng)和育肥豬的抗氧化能力,減輕熱應(yīng)激的影響[8],并防止脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的綿羊腸上皮細(xì)胞凋亡[9]。一氧化氮(nitric oxide,NO)是由NO合成酶產(chǎn)生的自由基,可催化精氨酸向 L-瓜氨酸的轉(zhuǎn)化[10],精氨酸-一氧化氮(Arg-NO)途徑產(chǎn)生的NO在細(xì)胞凋亡中具有雙重作用[11]。在生理?xiàng)l件下,動(dòng)物體內(nèi)合成的精氨酸量不能滿(mǎn)足動(dòng)物機(jī)體生長(zhǎng)代謝的需要,大多數(shù)動(dòng)物需要從食物中獲取Arg[12]。Arg不僅可作為NO前體,還參與腐胺、精胺和亞精胺的生成[13],其中精胺具有抗氧化與抗衰老能力[14],可作為氧自由基清除劑,保護(hù)核酸等細(xì)胞組分免受氧化損傷,調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡過(guò)程[15]。但目前尚不清楚精氨酸調(diào)節(jié)熱應(yīng)激下支持細(xì)胞凋亡的機(jī)制。外源性精胺通過(guò)減少活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生和抑制PERK-eIF2α通路的激活來(lái)阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[16]。然而,Arg-NO和 Arg-精胺如何調(diào)節(jié)熱應(yīng)激處理支持細(xì)胞的凋亡還需要進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)以體外培養(yǎng)的仔豬睪丸支持細(xì)胞為研究材料,采用試驗(yàn)前期建立的熱應(yīng)激模型,經(jīng)靶向代謝物測(cè)序,篩選出差異氨基酸;通過(guò)添加外源性氨基酸,分析外源性氨基酸是否會(huì)影響熱應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激降低了支持細(xì)胞的精氨酸含量及其相關(guān)代謝物,改變了Arg代謝途徑,增加了SCs的凋亡率,并進(jìn)一步探討了精氨酸和精胺在熱應(yīng)激誘導(dǎo)的支持細(xì)胞凋亡中的作用,以便為緩解熱應(yīng)激的不利影響提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 以來(lái)自重慶市北碚區(qū)東陽(yáng)鎮(zhèn)某豬飼養(yǎng)場(chǎng)3周齡健康雄性仔豬為研究對(duì)象,試驗(yàn)中所有動(dòng)物程序和方法均經(jīng)西南大學(xué)機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、新生小牛血清、青鏈霉素(Gibco公司)。IV型膠原酶、 精氨酸、精胺(Sigma公司)。磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline, PBS)粉末(Biosharp 公司)。苯甲基磺酰氟PMSF、蛋白酶抑制劑(MCE公司)。RIPA裂解液、蛋白預(yù)染maker(Thermo Scientific公司)。BCA試劑盒(葆光生物)。山羊抗兔二抗、熒光型二抗、NO檢測(cè)試劑盒、蛋白上樣緩沖液(上海碧云天生物技術(shù)公司)。Rabbit Anti-iNOS、Rabbit Anti-ODC、Rabbit Anti-FAS(北京博奧森生物技術(shù)公司)。Rabbit Anti-Bcl-2、Rabbit Anti-BAX、Rabbit Anti-ARG1、Rabbit Anti-SSAT1(武漢三鷹生物技術(shù)公司)。凋亡檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。豬精胺ELISA檢測(cè)試劑盒(慧嘉生物)。

1.2 方法

1.2.1 睪丸支持細(xì)胞的分離培養(yǎng)及純度鑒定 在無(wú)菌條件下采集睪丸組織,然后迅速放入預(yù)冷的PBS (按100∶1的比例加入青、鏈霉素混合物),用封口膜將其封口,放入提前加入冰塊的泡沫盒中,在2 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。按照本實(shí)驗(yàn)室前期方法進(jìn)行睪丸支持細(xì)胞的分離與純化。將分離的細(xì)胞置于DMEM/F12培養(yǎng)液中,添加10%胎牛血清,在32 ℃,5% CO2下培養(yǎng)48 h,待培養(yǎng)皿底部細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)至70%～80%后,用支持細(xì)胞特異性的標(biāo)記蛋白GATA-4進(jìn)行純度鑒定,細(xì)胞純度鑒定不低于90%即可用于后續(xù)試驗(yàn)[17-18]。

1.2.2 細(xì)胞的熱處理以及細(xì)胞活性檢測(cè) 純化后的仔豬睪丸原代細(xì)胞培養(yǎng)約24～48 h 后,按照之前實(shí)驗(yàn)室建立的熱應(yīng)激模型對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熱處理(44 ℃,30 min),再進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)[19]。使用CellTiter-LμMiTM穩(wěn)態(tài)發(fā)光細(xì)胞活力測(cè)定試劑盒評(píng)估細(xì)胞活力。將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞板,每孔加入100 μL CellTiter-LμMiTMSteady發(fā)光試劑,振蕩2 min促進(jìn)細(xì)胞裂解。室溫孵育10 min后使用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè),并根據(jù)化學(xué)發(fā)光顯示值計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)活力,記錄試驗(yàn)結(jié)果并進(jìn)行分析。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 使用熒光素異硫氰酸酯(FITC) /PI試劑盒進(jìn)行凋亡分析[20]。將支持細(xì)胞接種于6孔板,于 DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h, 0.05 mmol·L-1精氨酸處理24 h, PBS洗滌,重懸于結(jié)合緩沖液中。將100 μL細(xì)胞與5 μL Annexin V-FITC在25 ℃下孵育20 min,得到的混合物加入5 μL PI和400 μL結(jié)合緩沖液,用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。通過(guò)NovoExpress1.2.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,并將結(jié)果進(jìn)行歸一化處理。

1.2.4 細(xì)胞的代謝物檢測(cè) 通過(guò)添加精氨酸和熱處理后,用0.1 mol·L-1PBS洗滌細(xì)胞。用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞,將細(xì)胞收集于凍干管中。采用超高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離,質(zhì)譜分析采用質(zhì)譜儀在正離子模式下進(jìn)行。使用Multiquant軟件提取色譜峰的峰面積和保留時(shí)間,采用氨基酸及其衍生物的代謝物鑒定標(biāo)準(zhǔn)校正保留時(shí)間,并計(jì)算相應(yīng)代謝物的濃度。

1.2.5 蛋白表達(dá)的檢測(cè) 使用細(xì)胞裂解緩沖液從處理過(guò)的細(xì)胞中提取總蛋白,并用碧云天BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。采用6%～12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。BSA封閉液25 ℃封膜2 h,4 ℃結(jié)合相應(yīng)一抗12 h,然后將膜與山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗在25℃下孵育2 h,配置顯影液后在化學(xué)發(fā)光成像儀上曝光顯影。Quantity One軟件定量蛋白條帶強(qiáng)度。

1.2.6 RNA 提取及定量 RT-PCR 將支持細(xì)胞培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)瓶(4×106個(gè)·瓶-1)中,在32 ℃的培養(yǎng)箱(含5% CO2)中培養(yǎng)48 h,分別用精氨酸或精胺處理并進(jìn)行熱處理。采用Trizol法提取總RNA。然后使用CFX96TMReal-Time System/C1000 TouchTMThermal Cycler進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)。iScriptTM 139 gDNA Clear cDNA Synthesis kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,并使用SYBR Green?Master Mix進(jìn)行1 μg總RNA合成的cDNA進(jìn)行qRT-PCR。使用2-ΔΔCT方法計(jì)算目的基因相對(duì)β-actin表達(dá)量,本試驗(yàn)所用引物信息見(jiàn)表1。

表1 本試驗(yàn)所用引物序列

1.2.7 NO 熒光檢測(cè)以及精胺的檢測(cè) 添加精氨酸、精胺和熱處理后用0.1 mol·L-1PBS洗滌細(xì)胞,然后使用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞2 min, 1 500 r·min-1離心5 min后棄上清。按照DAF-FM DA試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,將1 mL懸浮細(xì)胞與10 μmol·L-1DAF-FM DA混合,在37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育20 min。使用流式細(xì)胞儀測(cè)定每個(gè)樣品的熒光強(qiáng)度。按照豬精胺酶免疫測(cè)定試劑盒的說(shuō)明書(shū),在給定的標(biāo)準(zhǔn)濃度下形成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),最后根據(jù)450 nm處吸光度值測(cè)定試驗(yàn)組精胺濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用GraphPad prism7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,兩組數(shù)據(jù)采用非配對(duì)樣本 Student′st-test進(jìn)行顯著性分析,兩組以上采用單因素方差分析,采用Tukey試驗(yàn)多重比較各組間的差異。如果數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分析,先進(jìn)行正弦轉(zhuǎn)化。試驗(yàn)均設(shè)有3次獨(dú)立重復(fù),*為P<0.05表示差異顯著,**為P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 熱應(yīng)激對(duì)支持細(xì)胞活力和凋亡率的影響

與對(duì)照組相比,熱應(yīng)激后支持細(xì)胞的熒光強(qiáng)度顯著降低了42% (P<0.01,圖1A)。其次,熱應(yīng)激使支持細(xì)胞的凋亡率從3.14%增加到7.36%,增加了134% (P<0.01,圖1B)。這表明,熱應(yīng)激增加了支持細(xì)胞的凋亡率。

A. 熱處理后支持細(xì)胞的活性;B. 熱處理后支持細(xì)胞的凋亡率和凋亡率量化統(tǒng)計(jì)。*. P<0.05;**. P<0.01,下同A. The activity of sertoli cells under heat stress; B. Apoptosis rate and quantitative statistics of apoptosis rate of sertoli cells under heat stress. * . P<0.05; **. P<0.01, the same as below

2.2 熱處理對(duì)精氨酸及精氨酸代謝物的影響

經(jīng)過(guò)熱處理后,支持細(xì)胞中的精氨酸含量降低了54.9% (P<0.01,圖2A)。進(jìn)一步檢測(cè)精氨酸的代謝,發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激后Inos的mRNA水平升高了60%(P<0.01,圖2B),iNOS蛋白水平升高了12% (P<0.01,圖2B),NO含量升高了57% (P<0.01,圖2C),代謝副產(chǎn)物瓜氨酸含量降低了39.8% (P<0.05,圖2 D);代謝產(chǎn)物腐胺和鳥(niǎo)氨酸含量分別提高了103%(P<0.05)和70% (P<0.01,圖2D),但精胺含量無(wú)顯著變化(P>0.05,圖2E)。本研究還檢測(cè)了精氨酸-精胺代謝途徑相關(guān)酶的mRNA水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,熱應(yīng)激后Arg1、Arg2和OdcmRNA水平分別顯著升高了2000%(P<0.01)、180%(P<0.01)和10%(P<0.05)(圖2F)。上述結(jié)果表明,熱應(yīng)激增強(qiáng)了支持細(xì)胞中Arg-NO的代謝途徑,但對(duì)精胺的量無(wú)顯著影響。

2.3 外源性精氨酸降低熱處理后支持細(xì)胞的凋亡率

熱處理后的精氨酸含量相對(duì)于對(duì)照組下降了54.9%(P<0.01,圖3A)。與單純熱應(yīng)激組相比,0.05 mmol·L-1外源性精氨酸處理使熱應(yīng)激組支持細(xì)胞中精氨酸的含量上升了143%(P<0.01,圖3A)。此外,外源精氨酸使熱應(yīng)激條件下支持細(xì)胞的凋亡率降低8% (P<0.01,圖3B),BAX蛋白水平降低32% (P<0.05,圖3C),FAS蛋白水平降低8% (P<0.05,圖3C)。以上結(jié)果表明,外源精氨酸可減少熱應(yīng)激引起的支持細(xì)胞凋亡。

A.精氨酸的變化;B.支持細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率、凋亡量化統(tǒng)計(jì);C.凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)及量化統(tǒng)計(jì)A. Changes in arginine; B. Apoptosis rate and apoptosis quantitative statistics of sertoli cells;C. Expression and quantification of apoptosis-related proteins

2.4 外源性精氨酸改變熱應(yīng)激后支持細(xì)胞的精氨酸代謝

與單純熱應(yīng)激組相比,外源性精氨酸使INOS蛋白水平降低15.3% (P<0.01,圖4A),NO含量降低29.5% (P<0.01,圖4B),而瓜氨酸水平無(wú)顯著變化(P>0.05,圖4C)。與對(duì)照組相比,熱應(yīng)激下,精氨酸-精胺代謝途徑中的關(guān)鍵酶ARG1、ODC和SSAT1的蛋白表達(dá)顯著增加了20.8%、18.3%和400% (P<0.05,圖4D)。與熱應(yīng)激相比,外源性精氨酸使ODC升高了41.5%(P<0.01),ARG1下降了23%(P<0.01),但SSAT1升高不顯著(P>0.05,圖4D),并且鳥(niǎo)氨酸和腐胺含量變化不顯著(P>0.05,圖4E),而精胺含量提高了10.2% (P<0.01,圖4F)。上述結(jié)果表明,外源性精氨酸抑制了ARG-NO途徑,增強(qiáng)了精氨酸-精胺途徑。

A. INOS 蛋白的表達(dá)及蛋白量化統(tǒng)計(jì);B.NO 熒光表達(dá)及統(tǒng)計(jì);C.瓜氨酸含量統(tǒng)計(jì);D. ARG1、SSAT1、ODC 蛋白的表達(dá)及量化統(tǒng)計(jì);E.鳥(niǎo)氨酸代謝物、腐胺代謝物的變化;F.精胺代謝物的變化A. Expression and quantitative statistics of INOS protein; B.NO fluorescence expression and statistics;C.Citrulline content statistics; D. Expression and quantitative statistics of ARG1,SSAT1 and ODC proteins;E. Changes in ornithine metabolites and putrescine metabolites; F. Changes in spermine metabolites

2.5 外源性精胺改變支持細(xì)胞的凋亡和NO含量

5 μmol·L-1精胺使熱應(yīng)激條件下支持細(xì)胞凋亡率降低53.9% (P<0.01,圖5A),BAX蛋白水平顯著降低30.9%(P<0.05,圖5B),BCL-2蛋白水平升高16.8%(P<0.05,圖5B),NO含量降低24.3% (P<0.01,圖5C)。這表明外源性精胺可以降低NO含量,從而減弱熱應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

3 討 論

本試驗(yàn)采用質(zhì)譜多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring,MRM)技術(shù)分析了正常和熱處理?xiàng)l件下支持細(xì)胞中氨基酸代謝物的變化。研究數(shù)據(jù)顯示,支持細(xì)胞熱處理后,精氨酸和精氨酸代謝相關(guān)的物質(zhì)含量發(fā)生了顯著變化,熱應(yīng)激增強(qiáng)了Arg-NO通路。同時(shí)發(fā)現(xiàn),Arg-精胺通路相關(guān)酶的mRNA水平明顯上升,但精胺含量無(wú)顯著變化,這表明熱應(yīng)激下精胺作為抗氧化和抗凋亡物質(zhì),出現(xiàn)大量消耗,防止細(xì)胞的過(guò)度凋亡[21]。外源精氨酸或精胺可降低熱應(yīng)激誘導(dǎo)的支持細(xì)胞中NO水平和凋亡率。這些結(jié)果表明,熱應(yīng)激通過(guò)增強(qiáng)Arg-NO途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,而添加外源精氨酸或精胺加強(qiáng)了精氨酸-精胺通路代謝途徑,抑制了Arg-NO途徑,從而降低了熱處理誘導(dǎo)的支持細(xì)胞凋亡。

熱應(yīng)激對(duì)動(dòng)物泌乳[22]、采食量[23]、免疫功能[24]和生殖功能[25]均有顯著影響,而這些影響與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[26]。研究發(fā)現(xiàn),熱應(yīng)激可以誘導(dǎo)各種細(xì)胞的凋亡,如小鼠顆粒細(xì)胞[27]、小鼠生精細(xì)胞[28]、牛肺細(xì)胞等[29]。本試驗(yàn)基于前期研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),SCs在遭受熱處理(44 ℃ 30 min)后,FAS和線(xiàn)粒體依賴(lài)性細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)升高,這暗示熱處理后通過(guò)內(nèi)源性途徑和外源性途徑誘導(dǎo)支持細(xì)胞發(fā)生凋亡。Xi等[30]發(fā)現(xiàn),熱應(yīng)激(42 ℃ 1 h)可通過(guò)調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2的表達(dá)水平(內(nèi)源性途徑)使成年公豬睪丸發(fā)生凋亡。在本試驗(yàn)中,熱應(yīng)激增加了SCs的凋亡率,這與牛、大鼠和小鼠的42 ℃熱處理1 h或41 ℃熱處理48 h誘導(dǎo)SCs凋亡的結(jié)果相似[31-32]。本試驗(yàn)結(jié)果還顯示,熱應(yīng)激使精氨酸、瓜氨酸含量降低,并提高了腐胺、鳥(niǎo)氨酸和NO含量。NO對(duì)細(xì)胞凋亡具有雙重作用[33],過(guò)量的NO會(huì)引起細(xì)胞凋亡[34]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),熱應(yīng)激誘導(dǎo)SCs中NO含量升高,增強(qiáng)了Arg-NO代謝途徑,進(jìn)而通過(guò)線(xiàn)粒體途徑和FAS途徑誘導(dǎo)睪丸SCs發(fā)生凋亡[35-36]。因此,熱應(yīng)激增強(qiáng)Arg-NO代謝途徑是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率增加的原因。精氨酸可以調(diào)控多種細(xì)胞的凋亡[37],并且對(duì)凋亡的調(diào)節(jié)作用和抗氧化作用與其代謝密切相關(guān)。精氨酸可以通過(guò)上調(diào)抗氧化酶預(yù)防LPS誘導(dǎo)的綿羊上皮細(xì)胞凋亡,也可以通過(guò)抑制NO的產(chǎn)生上調(diào)Bcl-2基因進(jìn)而對(duì)大鼠肝臟缺血再灌注損傷中的壞死和細(xì)胞凋亡提供保護(hù),并且抑制精氨酸-NO途徑可以減輕熱應(yīng)激誘導(dǎo)的豬上皮細(xì)胞凋亡。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),添加外源精氨酸后,Arg-NO代謝物NO含量下降,細(xì)胞凋亡率降低了,這表明精氨酸參與了SCs功能的調(diào)控并且可能和細(xì)胞中的NO水平下降有關(guān)。

鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(ODC)和二胺乙酰轉(zhuǎn)移酶1 (SSAT1)是精胺合成[38]和分解代謝的關(guān)鍵酶[39],共同參與多胺代謝的調(diào)節(jié)[40]。本試驗(yàn)中,熱應(yīng)激后SCs中ODC和SSAT1水平均升高,而精胺的水平?jīng)]有明顯變化,這表明熱應(yīng)激后SCs中精胺的合成和降解速度相當(dāng)。本試驗(yàn)添加外源精胺不僅降低了熱處理組細(xì)胞的凋亡率和NO水平,而且還降低了促凋亡蛋白BAX水平,增加了抗凋亡蛋白BCL-2水平,這表明精胺可能通過(guò)抑制Arg-NO發(fā)揮抗凋亡作用。以上結(jié)果表明,抑制 Arg-NO通路,增強(qiáng)精氨酸-精胺途徑可能是緩解熱應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一種有效方式。

4 結(jié) 論

熱應(yīng)激條件下通過(guò)增強(qiáng)Arg-NO代謝途徑誘導(dǎo)支持細(xì)胞凋亡。外源精氨酸或精胺可增強(qiáng)精氨酸-精胺代謝途徑,抑制Arg-NO途徑,減輕熱處理誘導(dǎo)的支持細(xì)胞凋亡。