李思遠,付新成,袁雪松,毛 立,蔡旭航,孫心如,黃 金,謝玲玲,王 府,周 華,張 琪,李基棕,4*,李 彬,4*

(1.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院,楊凌 712100;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用生物制品工程技術(shù)重點實驗室,南京 210014;3.南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,南京 210095;4.江蘇大學生命科學學院 食品與生物工程學院,鎮(zhèn)江 212013;5.河北省廊坊市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,廊坊 065000;6.貴州省種畜禽種質(zhì)測定中心,貴陽 550018;7.黔西市動物疫病預防控制中心,黔西 551500)

牛冠狀病毒(bovine coronavirus, BCoV)屬于β冠狀病毒,在全球范圍廣泛流行。主要編碼5個結(jié)構(gòu)蛋白,血凝素酯酶(hemagglutinin-esterase,HE)、刺突蛋白(spike protein,S)、包膜蛋白(envelope protein,E)、膜蛋白(membrane,M)和核衣殼蛋白(nucleocapsid,N)。BCoV最初被認為是腸道病毒,可以造成新生犢牛腹瀉[1-2]、牛冬季痢疾,但迄今為止,越來越多的臨床案例表明該病毒可以從呼吸道檢測出并導致各年齡段牛呼吸道癥狀[3-4],因此BCoV也是呼吸道病原的說法越來越頻繁地被提及。BCoV具有很大的跨物種傳播潛力,CoV-OC43被認為與BCoV相近,這兩種病毒均能以9-O乙酰唾液酸作為糖結(jié)合底物[5-6],受人白細胞抗原Ⅰ亞群(human leukocyte antigen,HLA-Ⅰ)影響[5,7-8],所以BCoV常被作于人呼吸道冠狀病毒(人冠狀病毒OC-43、SARS-CoV2、HKU1)的研究模型。除了感染牛以外,在其他動物(如羊駝、羊、長頸鹿等)中也檢出類BCoV,其中更包括了德國的人呼吸道株4403[9-12],具有溢出跨宿主傳播風險。

牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)是全世界牛常見的疾病之一。BVDV可以導致牛生育能力下降、產(chǎn)奶量下降、呼吸道癥狀、腹瀉、流產(chǎn)和產(chǎn)死胎等生殖功能異常[13-14]。在亞洲不同國家報道中,牛星狀病毒(bovine astroviruses, BoAstV)被證明與牛腹瀉有關(guān),但報道的發(fā)病率不一致[15-16]。牛輪狀病毒(bovine rotavirus virus, BRV)是牛腹瀉最常見的原因,能導致顯著的并發(fā)癥和死亡率,在新生犢牛中尤為明顯[17-18]。牛環(huán)曲病毒(bovine torovirus, BToV)主要引起小牛和成年牛腹瀉,還具有雙重組織嗜性,可以在呼吸道中檢出,并導致牛腹瀉,嚴重患病?？芍了劳鯷19-21]。牛諾瓦病毒(bovine norovirus, BoNoV)是引起動物胃腸炎的重要病原[22]。嵌杯病毒科的牛紐布病毒(bovine nebovirus, BoNeV)可導致患病牛小腸絨毛萎縮,引起腹瀉[22-23]。哺乳動物正呼腸孤病毒(mammalian orthoreovirus, MRV)和牛嵴病毒(bovine kobuvirus, BKoV)也被認為是引起牛腹瀉的病原之一[24-25]。

本研究對我國河北省廊坊市以BCoV為主的腹瀉病原進行流行病學調(diào)查,對BCoV遺傳進化分析,為該地這9種病的發(fā)病、流行情況及疫病防控提供科學數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

從我國河北廊坊地區(qū)14個養(yǎng)殖場中采集了323份腹瀉奶牛糞樣。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄酶、Green Taq Mix、2×Phanta Max Master Mix (Dye Plus) 均購自南京諾唯贊生物科技有限公司,瓊脂糖購自北京擎科生物科技有限公司,膠回收試劑盒購自O(shè)mega Bio-Tek公司,磷酸鹽緩沖液(PBS)購自塞維爾生物科技有限公司。

1.3 主要儀器

PCR擴增儀和離心機:德國Eppendorf公司;凝膠成像系統(tǒng):上海天能公司。

1.4 樣品處理

將采集的糞樣每份轉(zhuǎn)移部分至2 mL離心管中,其余凍存至-80 ℃冰箱。每個EP管中加入1 mL 經(jīng)高壓滅菌的PBS溶液進行震蕩充分混勻,離心后棄去沉淀取上清用0.22 mm濾器過濾后流液備用。

1.5 引物合成

參考文獻[26-32]合成BCoV、BVDV、BoAstV、BRV、BToV、BNoV、BoNeV、MRV、BKoV相關(guān)片段的引物(表1、2)。

表1 病毒性腹瀉病原檢測引物信息

表2 BCoV S和HE引物信息

1.6 病毒RNA提取及轉(zhuǎn)錄

參照說明進行提取總RNA后進行反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA凍存于-80 ℃冰箱備用。

1.7 RT-PCR擴增

根據(jù)表1檢測引物,采用20 μL體系:10 μL Mix,0.4 μL 上游引物F,0.4 μL 下游引物R,1 μLcDNA,8.2 μL ddH2O。使用降落PCR方法擴增片段,反應(yīng)程序:預變性95 ℃ 5 min;95 ℃ 15 s,48～55 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,共35個循環(huán);徹底延伸72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,觀察結(jié)果。

根據(jù)S和HE特異性引物擴增BCoV陽性樣品,采用25 μL體系:12.5 μL Mix,1 μL 上游引物F,1 μL 下游引物R,2 μL cDNA,8.5 μL ddH2O。使用降落PCR方法擴增目的片段,程序為:預變性95 ℃ 5 min;95 ℃ 15 s,48～55 ℃ 15 s,72 ℃ 1 min 共35個循環(huán);徹底延伸72 ℃ 10 min。得到產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳,觀察結(jié)果。

1.8 膠回收驗證及進化樹構(gòu)建

按膠回收試劑盒說明書回收目的條帶膠塊,由上海生工生物工程股份有限公司測序,通過測序結(jié)果進行序列比對。同時將提取的RNA送上海探普生物公司進行病毒基因組下一代測序。

使用MEGA 11軟件進行BCoV的HE、S、N、M、E、ORF1a和全序列基因核酸序列比對,并使用最大似然法構(gòu)建進化樹。

2 結(jié) 果

2.1 RT-PCR檢測

在檢測323份樣品中BCoV總體陽性檢出率為14.24% (46/323),BVDV為1.85% (6/323),BRV為57.89% (187/323),BoAstV為0.31% (1/323),BoNeV為10.84% (35/323),BoNoV為4.33% (14/323),MRV為2.48% (8/323),BToV為4.64% (15/323),BKoV為11.76% (38/323)。該地區(qū)BCoV檢出率并不高,而BRV高達57.89%,檢出率最低的是BoAstV,僅有0.31%。各個牛場不同病原陽性檢出率差異較大,BVDV檢出率為0.00%～17.65%,BRV檢出率為0.00%～100%,BCoV 檢出率為0.00%～45.45%,BKoV檢出率為0.00%～42.47%,BNeV檢出率為0.00%～62.50%,BNoV檢出率為0.00%～30.00%,BToV檢出率為0.00%～13.33%,MRV檢出率為0.00%～11.76%,BoAstV檢出率為0.00%～3.33%。其中BRV在每個牛場中均能檢出,在7個奶牛場中檢出率為100.00%。而BCoV也在12個奶牛場中檢出,僅次于BRV。

2.2 混合感染檢測

總共有22種混合感染類型,最多同時感染5種病毒。以BRV和BoNeV混合感染檢出率最高,高達28.95% (22/76),BCoV混合感染比率為 36.84%(28/76) (表3)。

表3 混合感染狀況分析結(jié)果

2.3 BCoV的HE和S基因序列擴增

陽性樣本采用特異性引物擴增HE和S片段,可分段擴增出1株HE和S全長序列,命名為HBLF2302株(圖1)。

M.DL2000 DNA 相對分子質(zhì)量標準; 1. HBLF2302檢測片段;2. HA;3. HB;4. HE;5. S1;6. 35;7. 3536;8. 36;9. 3637;10. S2;11. S3;12. DL5000 DNA 相對分子質(zhì)量標準M.DL2000 DNA maker; 1. HBLF2302 detected segment;2. HA;3. HB;4. HE;5. S1;6. 35;7. 3536;8. 36;9. 3637;10. S2;11. S3;12. DL5000 DNA maker

2.4 BCoV結(jié)構(gòu)蛋白遺傳進化分析

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫及DNAstar 7.0中的Megalign比對,HBLF2302S基因與我國華東地區(qū)MZ711 357.1株相似性最高,達到99.5%。HBLF2302HE基因,與我國西南地區(qū)獲得的MN982 191.1序列相似性最高,可達99.53%,序列中無12個堿基插入。HBLF2302E、M、N基因與我國其它地區(qū)測得的序列相似性均在99.7%以上,差異較小。

從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得的部分序列S序列進行比對,S進化樹結(jié)果表明HBLF2302屬于GⅡb基因型,為國內(nèi)BCoV流行的基因型,值得注意的是,HY24株為我國牦牛源毒株,p95為我國臺灣省于HRT-18細胞上測得,屬于GⅠa基因型。不僅如此BCoV-GX-NN190313和BJ232犬冠狀病毒處于獨立分支,提示國內(nèi)BCoV可能存在新基因型。韓國流行株主要以GⅡa基因型為主,但也出現(xiàn)有GⅡb基因型。表明不同基因型跨地區(qū)傳播的風險在增加。可能存在新基因型的出現(xiàn),有待進一步測序驗證。HE、E、M和N基因在不同基因型中未見有明顯分化,表明在不同基因型中除了S差異較大具有分型價值外,其余四個結(jié)構(gòu)蛋白可能不可作為分型依據(jù)。

2.5 BCoV S蛋白三級結(jié)構(gòu)分析

通過SWISS-MODEL同源建模及PyMDL分析,發(fā)現(xiàn)氨基酸157號區(qū)別于其他參考序列157V和157I,854I較為少見,318號位為獨特突變位點,在HBLF2302株中處于選擇。其中157 T和318V位于S1,854I位于S2。318號位點在HBLF2302上由318I突變?yōu)?18V時,與631C形成氫鍵(圖2)。

A. 318I局部結(jié)構(gòu);B. 318V局部結(jié)構(gòu)A. Local structure of 318I of S; B. Local stucture of 318V of S

2.6 BCoV ORF1a序列及分析

通過氨基酸比對結(jié)果表明,在目前上傳至NCBI中的BCoV中國株的開放閱讀框1a(Open reading frame ORF1a)基因中834、857和889號位為區(qū)別于其它地區(qū)的GⅡb株獨特的位點。在其他序列中834W、857 L和889R號位均為一致,而在中國株中834W為834R,857 L為857 S,而在889R為終止密碼子(圖3)。從遺傳進化樹上可以看出,除了牦牛源MH810 163.1 HY24仍與GⅠa型傳統(tǒng)株處于同一分支外,中國株獨立于同為GⅡb型的日本株和美洲株獨立成簇(圖4)。由此可見,在ORF1a上,同一基因型的BCoV毒株存在一定差異性,并且中國株呈現(xiàn)出獨特特征。

圖3 ORF1a 834、857和889號位氨基酸序列比對結(jié)果Fig.3 Amino acid sequence alignment of ORF1a 834, 857 and 889

圖4 基于BCoV ORF1a的進化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis based on ORF1a of BCoV

2.7 BCoV 全基因遺傳進化分析

根據(jù)同源性分析結(jié)果,HBLF2302與從內(nèi)蒙古地區(qū)獲得的序列OP924 545.1相似性最高,在進化樹上也與OP924 545.1進化距離接近。全基因組序列FJ938 067.1 4408株與基于S基因的進化樹具有差異,在基于S基因進化樹中與GⅠb基因型歸為一簇,而在全基因組序列中與GⅠa基因型歸為一簇(圖5)。

圖5 基于全基因組的BCoV遺傳演化分析Fig.5 Genetic evolution analysis of BCoV based on whole genome

3 討 論

牛群腹瀉的病原多樣,呈現(xiàn)出多重病原混合感染的復雜情況,在臨床中難以證實某種病原與腹瀉的直接相關(guān)性。本研究表明,廊坊地區(qū)BCoV檢出率為14.24%,其他9種腹瀉病原的檢出率為0.52%～57.89%?；旌细腥厩闆r占35.37%。近年來,BCoV流行率有著上升趨勢,不同地區(qū)流行率各有差異,可能存在地方性流行的特點[33-34]。在吉林部分地區(qū)報道牛冠狀病毒陽性檢出率為21.10%[31],云南部分地區(qū)為14.29%[32],在北疆地區(qū)檢出率為0%～38.89%[33],在四川部分地區(qū)為16.80%[34],而在高原地區(qū),腹瀉牛樣本檢出率高達69.05%,患呼吸道疾病的牛群中檢出率為72.45%[35]。由此可見,在不同地區(qū)不同樣本牛冠狀病毒發(fā)病率存在差異,且在腹瀉牛群中檢出率較高。不僅如此,在國外報道中,巴西為68.7%[36],日本為57.7%[37],韓國為39.8%[38],土耳其為21.9%[39],伊朗為7.2%[40],在不同國家腹瀉牛群中檢出率也有所差異。本文中均為腹瀉樣本,牛冠狀病毒的檢出率為14.24%,可能是由于存在多種病原微生物混合感染,非單一因素或病原引起的牛群腹瀉或存在地區(qū)流行趨勢,因此無法確切表明,牛冠狀病毒與腹瀉具有直接關(guān)聯(lián)。

按照目前BCoV的基因型劃分,不同地區(qū)存在著不同基因型的BCoV,美洲、東南亞和東亞流行株(除韓國外)主要為GⅡb,韓國主要為GⅡa,歐洲主要為GⅠb。此外還存少數(shù)以經(jīng)典株為主的為GⅠa和GⅡc基因型。但由于對牛冠狀病毒基因型劃分依據(jù)仍不統(tǒng)一,按目前劃分S基因與全基因序列存在差異。更值得注意的是BCoV全基因組序列差異和變異較小,不同地區(qū)流行的BCoV基因型主要可能是由貿(mào)易原因為主導,因此即使在地處亞洲的土耳其,在S基因上趨向于歐洲的GⅠb基因型。

不僅如此,關(guān)鍵的蛋白的突變和重組可能導致BCoV的易感性增加。S中的S1具有雙受體結(jié)合基序[37],S1的N端結(jié)構(gòu)域與9-O乙酰唾液酸結(jié)合[6],S1的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(receptor-binding domain,RBD)被認為與受體結(jié)合,并且大量選擇位點位于RBD處,可能改變其宿主譜進而導致溢出。本研究獲取S基因的157號位點發(fā)生突變,該突變區(qū)別于157V和157I,318V為獨特突變位點,位于S的NTD端,318號位點的突變改變了側(cè)鏈殘基間相互作用力,是否改變糖嗜性仍需進一步研究。除此之外,本文通過序列比對,發(fā)現(xiàn)在參考序列的中國株及HBLF2302株中的ORF1a上的834、857及889 aa存在獨特突變位點,區(qū)別于其他地區(qū)的GⅡb基因型毒株并在889號位點出現(xiàn)終止密碼子,是否在后續(xù)報道毒株中存在普遍性用于更加細化解析牛冠狀病毒,仍需要大量測得序列來驗證,并進一步分析。

本研究對中國河北地區(qū)牛冠狀病毒及其他病毒性腹瀉病原進行了流行病學調(diào)查,豐富了牛冠狀病毒及其他常見病毒性腹瀉病原的流調(diào)數(shù)據(jù),為進一步研究牛冠狀病毒及牛腹瀉性病原提供了數(shù)據(jù)。

4 結(jié) 論

廊坊地區(qū)牛冠狀病毒檢出率為14.24%與其他不同地區(qū)存在差異,檢出率較低。測得的HBLF2302屬于GⅡb亞型流行株。在ORF1a發(fā)現(xiàn)區(qū)別于中國以外地區(qū)GⅡb型獨特的位點,并在S蛋白NTD端上有獨特突變位點。