畢振威,王文杰,劉雅坤,彭大新

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210014;2.揚(yáng)州大學(xué)江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,揚(yáng)州 225009;3.獸用生物制品(泰州)國泰技術(shù)創(chuàng)新中心,泰州 225300)

A型流感病毒(influenza A virus,IAV)是一種單股、分節(jié)段負(fù)鏈RNA病毒,水禽是其最大的天然儲(chǔ)存庫。該病毒亞型眾多,可突破種間屏障跨物種感染傳播,宿主范圍十分廣泛[1]。H3N8亞型犬流感病毒(canine influenza virus, CIV)來源于馬,而H3N2亞型CIV是由禽流感病毒(avian influenza A virus, AIV)跨宿主傳染至犬形成的,兩種CIV均可在犬間傳播[2]。2006年,我國第一例H3N2 CIV在廣東省被報(bào)道,自此之后,H3N2 CIV在我國江蘇、浙江、遼寧、黑龍江等多地報(bào)道,并一直呈上升趨勢[3-5]。除此之外,多種亞型AIV,如H5N1[6]、H5N2[7]、H9N2[8]和H10N8[9]均被報(bào)道感染犬,犬越來越成為AIV的宿主。不僅如此,豬流感病毒和人的pdmH1N1(pandemic H1N1)流感病毒也可感染犬[10]。不同亞型流感病毒在犬體內(nèi)重組而產(chǎn)生了新病毒,如H3N2 CIV與pdmH1N1的重組毒株[10]。因此,犬可成為流感病毒的“混合容器”。犬在促進(jìn)流感病毒哺乳動(dòng)物適應(yīng)性和產(chǎn)生流感病毒重組毒株方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。因此,犬體內(nèi)的流感病毒具有成為人畜共患傳染病原的風(fēng)險(xiǎn)。

流感病毒跨物種感染,其生命周期的各個(gè)階段均可能受到新宿主的限制。流感病毒RNA聚合酶催化病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄,同時(shí)需要大量宿主因子的參與,而不同物種的宿主因子差異性可能限制病毒RNA聚合酶活性,被認(rèn)為是重要的物種屏障之一。酸性核磷蛋白32A(acidic nuclear phosphoprotein 32A, ANP32A)是ANP32蛋白家族成員,在細(xì)胞中具有多種功能,包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),染色質(zhì)重構(gòu),mRNA輸出、細(xì)胞死亡,蛋白磷酸酶PP2A活性抑制等[11]。酸性核磷蛋白32A(ANP32A)在禽類與哺乳類中存在物種差異,禽類ANP32A比哺乳類多出33個(gè)氨基酸插入,能夠支持AIV的RNA聚合酶活性,而哺乳類ANP32A缺少33個(gè)氨基酸插入,而不能支持AIV的RNA聚合酶活性[12]。AIV感染哺乳動(dòng)物發(fā)生基因突變,如PB2 E627K突變,以適應(yīng)“較短”的哺乳類ANP32A。豬對AIV和哺乳動(dòng)物流感病毒均易感,一直被認(rèn)為是流感病毒的“混合容器”。研究發(fā)現(xiàn),豬ANP32A比禽類也缺少33個(gè)氨基酸插入,但是豬ANP32A能支持AIV的RNA聚合酶活性。與其他哺乳動(dòng)物ANP32A(106I/156P)相比,豬ANP32A是106V/156 S,這兩個(gè)位點(diǎn)的差異使豬ANP32A具有支持AIV的RNA聚合酶活性的功能[13-14]。AIV已經(jīng)跨物種感染犬,那么犬ANP32A(caANP32A)是否也能像豬ANP32A對AIV RNA聚合酶活性有支持作用?目前已有關(guān)于犬ANP32A蛋白對A型流感病毒RNA聚合酶活性影響的報(bào)道[15]。但是ANP32A有不同的剪接變體,對流感病毒RNA聚合酶活性的調(diào)控也存在差異[16]。犬是否存在與已知報(bào)道不同的其它ANP32A形式也未知。

本研究從MDCK細(xì)胞及犬的組織中克隆caANP32A,以期發(fā)現(xiàn)新的caANP32A。利用流感病毒RNA聚合酶雙熒光報(bào)告系統(tǒng)探索新的caANP32A對流感病毒RNA聚合酶活性的影響,分析caANP32A在流感病毒跨物種感染中的作用,為解析CIV的哺乳動(dòng)物的適應(yīng)機(jī)制提供新的理論依據(jù),對于防控CIV具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Trizol購自北京天恩澤基因科技有限公司;基因組DNA提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司;質(zhì)粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒為OMEGA公司產(chǎn)品;蛋白Marker購自擎科生物科技有限公司;鼠源抗Flag標(biāo)簽抗體為Sigma公司產(chǎn)品;兔源抗Myc標(biāo)簽多克隆抗體(R1208-1,杭州華安生物科技有限公司);HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體購自博奧龍生物科技有限公司;A488標(biāo)記的驢抗兔抗體(A488-LKT,A21206)和A546標(biāo)記的驢抗鼠抗體(A546-LKS,A10036)購自Invitrogen公司;DNA高保真酶Mix、同源重組酶、雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司;jetPRIME轉(zhuǎn)染試劑為Polyplus公司產(chǎn)品;NP-40細(xì)胞裂解液、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購自碧云天生物技術(shù)有限公司;EcoRⅠ和XhoⅠ購自NEB公司;DNA Marker購自寶生物技術(shù)工程有限公司(大連)。

1.2 樣品來源、質(zhì)粒及毒株

犬脾、肺、腸組織樣品均取自中華田園犬,由本實(shí)驗(yàn)保存;pCA-Flag-chANP32A-X1、pCA-Flag-chANP32A-X2、pCA-Flag-huANP32A真核表達(dá)質(zhì)粒及H9N2流感病毒[A/chicken/Zhejiang/A2013/2017 (H9N2)]聚合酶活性雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)由畢振威在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)免疫研究所攻讀博士學(xué)位期間構(gòu)建[17];H3N2亞型犬流感病毒[A/Canine/Nanjing/11/2012(H3N2)]由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定[18];以H3N2 CIV流感病毒NA基因?yàn)槟０?按照畢振威的方法[17],構(gòu)建含有人PolⅠ啟動(dòng)子的螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒phuPolⅠ-vNA-Luc;含有海腎熒光素酶報(bào)告基因的內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK均由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存;293 T細(xì)胞、MDCK細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存;H3N2 CIV的RNA聚合酶PB2/PB1/PA以及NP真核表達(dá)質(zhì)粒均構(gòu)建于pCAGGS表達(dá)載體上。

1.3 引物的設(shè)計(jì)及合成

參考GenBank中公布的caANP32A基因ORF序列(NM_001003013)設(shè)計(jì)特異性引物, 并在5′端加上同源臂(下劃線部分),針對caANP32A基因組(NM_001003013)的外顯子4和外顯子5周圍的序列設(shè)計(jì)3對引物,(表1)。引物由生工生物工程有限公司(上海)合成。

表1 引物序列

1.4 組織、細(xì)胞RNA/DNA提取及反轉(zhuǎn)錄

將犬脾、肺及腸組織分別取約0.1 g剪成小塊,或培養(yǎng)收獲MDCK細(xì)胞(1×106個(gè)),按照TRizol法提取RNA,將提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,取0.5～1.0 μg RNA,以隨機(jī)引物按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系與程序:模板RNA 0.5～1 μg、5×gDNA digester Mix 3 μL、RNase-free ddH2O加到15 μL,輕輕混勻,42 ℃孵育2 min,加入4×Hifair?Ⅲ SuperMix plus 5 μL,輕輕混勻,25 ℃ 5 min,55 ℃ 15 min,85 ℃ 5 min。將培養(yǎng)收獲的MDCK細(xì)胞(1×106個(gè))用基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)胞DNA。將反轉(zhuǎn)錄的cDNA產(chǎn)物和提取的DNA置于-20 ℃冰箱凍存。

1.5 caANP32A mRNA和基因的擴(kuò)增及真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,用caANP32A-F和caANP32A-R為引物擴(kuò)增MDCK及犬肺、脾、腸的caANP32A。PCR反應(yīng)體系(50 μL):2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)25 μL、上游引物F和下游引物R各2 μL、DNA模板2 μL、ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 7 min,16 ℃保存。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,用DNA膠純化回收試劑盒回收。將pCAGGS-Flag載體用EcoRⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切,取線性化的載體50 ng,加入5×CE II buffer 4 μL和Exnase 2 μL,補(bǔ)水至20 μL,輕輕混勻,置于37 ℃反應(yīng)30 min,冷卻5 min。取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物加入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞,輕輕混勻,42 ℃作用90 s,加入LB培養(yǎng)基,37 ℃搖床45 min;將培養(yǎng)菌液4 000 r·min-1離心5 min收集菌體,用100 μL LB培養(yǎng)基重懸涂于含氨芐青霉素的LB平板。挑取單個(gè)菌落由南京擎科生物技術(shù)有限公司和通用生物(安徽)股份有限公司測序。以提取的MDCK細(xì)胞的DNA為模板,分別用引物F1/引物R1、引物F2/引物R2、引物F3/引物R3進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件與上述方法相同。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物連接到pMD-19 T simple載體,并進(jìn)行測序。利用DNAStar軟件進(jìn)行氨基酸序列比對。

1.6 激光共聚焦試驗(yàn)

將293 T細(xì)胞接種到激光共聚焦小皿中,于5% CO2和37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。將pCA-Flag-caANP32A與H3N2 CIV RNA聚合酶亞基pCA-Myc-PB2、PB1和PA共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后,吸棄培養(yǎng)基,用PBS洗兩遍,然后用4%多聚甲醛在室溫下固定30 min,并用0.1% Triton-X-100透化15 min,在5%牛血清白蛋白(BSA)中封閉30 min后,將細(xì)胞與鼠源抗Flag抗體及兔源抗Myc抗體37 ℃孵育1 h,用PBS洗滌三次,每次5 min,然后用A488標(biāo)記的驢抗兔抗體和A546標(biāo)記的驢抗鼠抗體作為二抗,在37 ℃孵育1 h。隨后用PBS洗滌三次,細(xì)胞核用DAPI染色15 min,洗滌三次。然后將激光共聚焦小皿置于激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.7 caANP32A對流感病毒RNA聚合酶活性的影響

將293 T細(xì)胞鋪于24孔板中,培養(yǎng)約16 h待細(xì)胞密度達(dá)60%～80%左右,分別將pCA-flag-chANP32A-X1、pCA-flag-caANP32A-1、pCA-flag-caANP32A-2、pCA-flag-huANP32A真核表達(dá)質(zhì)粒與H9N2 AIV、H3N2 CIV的RNA聚合酶亞基和NP基因真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-PA/PB1/PB2/NP以及phuPol Ⅰ-vNA-Luc和pRL-TK共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞。所使用的脂質(zhì)體是jetPRIME,轉(zhuǎn)染體系如下:每孔按PA(0.1 μg)、PB1(0.1 μg)、PB2(0.1 μg)、NP(0.1 μg)、phuPol Ⅰ-vNA-Luc(0.05 μg)和pRL-TK(0.05 μg),以及ANP32A真核表達(dá)質(zhì)粒(0.2 μg)或pCAGGS-Flag空載體(0.2 μg)加入25 μL無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基中充分混合均勻,靜置5 min,然后加入2 μL jetPRIME轉(zhuǎn)染試劑,混勻后于室溫靜置5 min。加入鋪有293 T細(xì)胞的24孔板中的每孔內(nèi),置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染24 h后棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液,參照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒說明書裂解細(xì)胞和取樣,利用多功能熒光檢測儀測定Firefly和Renilla的熒光值,計(jì)算出流感病毒聚合酶的相對活性。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 caANP32A的克隆和序列分析

從MDCK細(xì)胞中用RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增獲得大小在750～1 000 bp之間的目的條帶(圖1A),用同源重組的方法將該目的條帶與pCAGGS-Flag載體連接,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α,挑取10個(gè)陽性單菌落進(jìn)行測序。結(jié)果表明,在MDCK細(xì)胞中擴(kuò)增到兩種不同的序列,分別命名為caANP32A-1和caANP32A-2。caANP32A的大小為762 bp,推導(dǎo)的氨基酸序列為253aa。caANP32A-1的59、147位點(diǎn)處的氨基酸為N、V,而caANP32A-2這兩個(gè)位點(diǎn)處的氨基酸為D、G。將該caANP32A氨基酸序列與禽類ANP32A(chANP32A-X1、chANP32A-X2)及其他哺乳類ANP32A(huANP32A、swANP32A和caANP32A)進(jìn)行比較,結(jié)果本研究擴(kuò)增的caANP32A比之前已經(jīng)報(bào)道的caANP32A以及huANP32A、swANP32A多出4個(gè)氨基酸(176LSLV179),而多出來的4個(gè)氨基酸與chANP32A-X1的177LSLV180一樣(圖1B、圖2)。因此,作者擴(kuò)增和克隆到新的caANP32A。進(jìn)一步地,從犬肺組織中擴(kuò)增到caANP32A-1,從犬脾組織中擴(kuò)增到caANP32A-2,從犬腸組織中擴(kuò)增到caANP32A-1和caANP32A-2。

A.PCR擴(kuò)增結(jié)果(M. DL5000 DNA 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. caANP32A cDNA的原液; 2. caANP32A cDNA的10倍稀釋; 3. caANP32A cDNA的100倍稀釋; 4. 正常MDCK細(xì)胞); B. 測序結(jié)果,黑框?yàn)椤?76LSLV179”對應(yīng)的核苷酸A. Amplification results of PCR(M. DL5000 DNA marker;1.Original solution of caANP32A cDNA; 2.10×dilution of caANP32A cDNA; 3.100×dilution of caANP32A cDNA; 4. Normal MDCK cells); B. Sequencing result, the black box showed the nucleotide corresponding to "176LSLV179"

圖2 不同物種ANP32A氨基酸序列比對Fig.2 Amino acid alignment of ANP32A in different species

2.2 caANP32A部分基因的克隆和測序

禽類ANP32A是由8個(gè)外顯子拼接而成的,雞的內(nèi)含子4含有兩個(gè)3′剪接位點(diǎn)(3′ splice site, 3′ss),這兩個(gè)位點(diǎn)相差12 bp。ChANP32A-X1是由近端的3′ss位點(diǎn)剪接而成,而chANP32A-X2是由遠(yuǎn)端的3′ss位點(diǎn)剪接而成,因此chANP32A-X1比chANP32A-X2多出4個(gè)氨基酸殘基。與禽類相比,哺乳類ANP32A缺少禽類ANP32A的外顯子5(外顯子5由99 bp堿基組成,編碼33個(gè)氨基酸),因此,哺乳類ANP32A是由7個(gè)外顯子剪接而成的。為了檢測新的caANP32A的176LSLV179的來源,設(shè)計(jì)了3對引物對caANP32A外顯子4、外顯子5及其之間的內(nèi)含子4的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖3)。如圖4所示,擴(kuò)增的序列結(jié)果與NCBI中注冊的caANP32A(注冊號(hào):NM_001003013)一致,均查找不到“TTATCTCTAGTG”,因此氨基酸序列“176LSLV179”并不能從caANP32A基因序列中推導(dǎo)獲得,表明這種改變的發(fā)生不是在DNA水平上,因此,作者發(fā)現(xiàn)的新的caANP32A并不是由基因編碼的外顯子mRNA剪接形成的。

藍(lán)色框?yàn)橥怙@子4,綠色框?yàn)橥怙@子5The blue box represents exon 4, and the green box represents exon 5

2.3 caANP32A與H3N2犬流感病毒RNA聚合酶共定位

將pCA-Flag-caANP32A載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,24 h后收獲細(xì)胞,進(jìn)行Western blot,用Flag抗體檢測Flag-caANP32A在細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果顯示,空載體未見陽性反應(yīng)條帶,而pCAGGS-Flag-caANP32A-1、pCAGGS-Flag-caANP32A-2和pCAGGS-Flag-huANP32A在33～43 ku出現(xiàn)特異性條帶,但與Flag-caANP32A的分子量理論值30 ku(caANP32A的分子量理論值為29 ku,Flag標(biāo)簽的分子量理論值為1 ku左右)稍偏大,這可能與caANP32A在細(xì)胞中存在一些翻譯后修飾有關(guān),表明pCAGGS-Flag-caANP32A蛋白在293T細(xì)胞中成功獲得表達(dá)(圖5A)。將Flag-caANP32A與H3N2 CIV的RNA聚合酶Myc-PB2、PB1、PA共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,激光共聚焦結(jié)果顯示,caANP32A和RNA聚合酶在細(xì)胞核中發(fā)生共定位現(xiàn)象(圖5B)。

A. Western blot(1. pCAGGS-Flag空載體;2. pCA-Flag-caANP32A-1真核表達(dá)質(zhì)粒;3. pCA-Flag-caANP32A-2真核表達(dá)質(zhì)粒;4. pCA-Flag-huANP32A真核表達(dá)質(zhì)粒); B. caANP32A與H3N2 CIV RNA聚合酶共定位A. Western blot (1. PCAGGS-Flag empty carrier; 2. pCA-Flag caANP32A-1 eukaryotic expression plasmid; 3. pCA-Flag caANP32A-2 eukaryotic expression plasmid; 4. pCA-Flag huaANP32A eukaryotic expression plasmid); B. Co-location of caANP32A and H3N2 CIV RNA polymerase

2.4 caANP32A對流感病毒RNA聚合酶活性的影響

將chANP32A-1、caANP32A-1、caANP32A-2、huANP32A表達(dá)質(zhì)粒分別與H9N2 AIV、H3N2 CIV的RNA聚合酶PB1/PB2/PA和NP真核表達(dá)質(zhì)粒以及vNA-Luc、pRL-TK真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,24 h后收獲細(xì)胞,檢測流感病毒RNA聚合酶的活性。結(jié)果顯示,過表達(dá)chANP32A-X1均顯著促進(jìn)了H9N2 AIV和H3N2 CIV的RNA聚合酶活性,而過表達(dá)新的caANP32A-1、caANP32A-2和huANP32A均不能促進(jìn)H9N2 AIV和H3N2 CIV的RNA聚合酶活性(圖6)。

3 討 論

禽源ANP32A存在不同的剪接變體,對AIV的RNA聚合酶適應(yīng)性和病毒進(jìn)化的驅(qū)動(dòng)力不同。雞ANP32A是由8個(gè)外顯子拼接而成的,內(nèi)含子4含有兩個(gè)3′的剪接位點(diǎn)(3′ss),這兩個(gè)位點(diǎn)相差12 bp。由內(nèi)含子4近端的3′ss位點(diǎn)剪接形成的外顯子5為99 bp,而由遠(yuǎn)端的3′ss位點(diǎn)剪接而成的外顯子5為87 bp,由此形成了剪接體chANP32A-X1比chANP32A-X2多出4個(gè)氨基酸殘基。而chANP32A-X3在剪接時(shí)缺少外顯子5,比chANP32A-X1少33個(gè)氨基酸插入。人ANP32A基因組缺少轉(zhuǎn)錄外顯子5的基因,因此人ANP32A是由7個(gè)外顯子剪接而成,比chANP32A-X1少33個(gè)氨基酸插入[16]。NCBI中注冊的犬ANP32A很少,且為預(yù)測的序列信息,張媛等[15]克隆到了1個(gè)caANP32A轉(zhuǎn)錄本,與其它哺乳動(dòng)物一樣,比chANP32A-X1少33個(gè)氨基酸插入。本研究從MDCK細(xì)胞和犬組織中克隆出一個(gè)新的caANP32A變體,比已報(bào)道的caANP32A多出4個(gè)氨基酸插入(LSLV),與chANP32A-X1中33個(gè)氨基酸插入的150LSLV168一致。通過對caANP32A基因組測序發(fā)現(xiàn),該序列不能從基因組DNA序列中推導(dǎo)獲得,表明這種改變的發(fā)生不是在DNA水平上,因此,作者發(fā)現(xiàn)的新的caANP32A并不是剪接形成的。RNA編輯是轉(zhuǎn)錄后的RNA在編碼區(qū)發(fā)生堿基的加入,丟失或轉(zhuǎn)換等現(xiàn)象[19]。該新的caANP32A可能是在RNA水平增加了原來DNA模板中不曾編碼的堿基。

2016年,Long等[12]首次揭示了AIV的RNA聚合酶在不同宿主細(xì)胞中的適應(yīng)性與ANP32A的種屬特異性相關(guān)。禽類ANP32A在175 aa位置處插入了額外的33個(gè)氨基酸片段,能支持AIV的RNA聚合酶活性,而哺乳類ANP32A缺少這33 aa片段,限制了AIV的RNA聚合酶活性[12]。33個(gè)氨基酸片段有27aa是ANP32A的(149DRDDKEA-PDSDAEGYVEGLDDEEEDED175)的重復(fù)序列,剩下的為6個(gè)獨(dú)特的氨基酸 (176VLSLVK181),其中176VLSLV180被認(rèn)為SUMO互作基序序列(SUMO interaction motif-like sequence, SIM)[20]。作者前期發(fā)現(xiàn),在huANP32A的175 aa處插入6 aa(176VLSLVK181)能支持AIV的RNA聚合酶活性,盡管活性不及整個(gè)33 aa,而huANP32A加入27aa則不能支持AIV的RNA聚合酶活性,表明33 aa插入的6個(gè)氨基酸(176VLSLV1806aa)在ANP32A支持AIV的RNA聚合酶活性中起著重要的作用[21]。chANP32A-X2由于缺乏6個(gè)aa中的4個(gè)aa(176VLSL179)嚴(yán)重破壞了其對AIV的RNA聚合酶的支持作用[21]。本研究克隆鑒定到一個(gè)新的caANP32A,該caANP32A在175 aa多了6 aa中的4 aa(LSLV片段),但仍然不能促進(jìn)AIV的RNA聚合酶活性。而作者之前發(fā)現(xiàn)huANP32A插入4aa(176VLSL179)也不能促進(jìn)AIV的RNA聚合酶活性?？梢?6個(gè)氨基酸(176VLSLV1806aa)的完整性是chANP32A支持AIV的RNA聚合酶所必需的。

豬對于感染禽和哺乳動(dòng)物的流感病毒均易感,被認(rèn)為是流感病毒的“混合容器”。盡管豬ANP32A比禽類同樣缺少33 aa插入,但與其它哺乳動(dòng)物不同,豬ANP32A能支持AIV的RNA聚合酶活性。與其他哺乳動(dòng)物物種的ANP32A(106I/156P)相比,豬ANP32A為106V/156 S,增強(qiáng)了豬ANP32A和AIV RNA聚合酶之間的相互作用從而支持AIV的RNA聚合酶活性[13-14]。作者發(fā)現(xiàn)的新caANP32A在這兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)未發(fā)生I106V/P156 S突變,也不能支持AIV的RNA聚合酶活性。因此caANP32A對AIV的RNA聚合酶仍然具有物種限制性。

H3N2亞型CIV未發(fā)生PB2 E627K哺乳動(dòng)物適應(yīng)性突變,仍然保持禽流感病毒PB2 627E位點(diǎn)。與chANP32A-X1能促進(jìn)CIV 的RNA聚合酶活性相比,caANP32A則不能,表明caANP32A對CIV仍然具有較強(qiáng)的宿主限制性。這可能是單純的CIV感染并不能引起犬嚴(yán)重的臨床癥狀的重要原因。通過比對發(fā)現(xiàn),caANP32A與huANP32A的核苷酸相似性是94.1%,氨基酸序列相似性為95.2%,存在12個(gè)氨基酸變異,但在293 T細(xì)胞上過表達(dá)caANP32A與huANP32A均不能促進(jìn)CIV的RNA聚合酶活性,表明caANP32A和huANP32A對AIV的RNA聚合酶的限制作用相同。與CIV能感染犬不同,目前并沒有人感染CIV的報(bào)道。除了ANP32A,最近研究發(fā)現(xiàn),huANP32B在促使PB2 E627K突變中起關(guān)鍵的主要作用,而caANP32B則不能,表明AIV在犬和人上發(fā)生哺乳動(dòng)物適應(yīng)性突變不同[22]。另外,犬呼吸道含有IAV使用的兩種唾液酸受體(2,3-和2,6-連接)[23],而人則僅僅含有2,6-連接的唾液酸受體。這些發(fā)現(xiàn)可能解釋CIV尚未感染人的原因。本研究所用的毒株為2012年分離到的,為早期毒株,最新的研究發(fā)現(xiàn),H3N2 CIV具備了人樣受體結(jié)合能力,且在人支氣管上皮細(xì)胞中的復(fù)制能力也逐漸增加,H3N2 CIV對公共衛(wèi)生安全的潛在威脅性增強(qiáng),值得警惕[24]。

4 結(jié) 論

克隆了新的犬物種特異的酸性核磷蛋白32A(caANP32A),在176～179位存在四個(gè)氨基酸LSLV的插入,但新caANP32A對AIV的RNA聚合酶活性仍然有物種限制性,且該新的caANP32A也未增強(qiáng)CIV的RNA聚合酶活性。