陳雪清,李志強(qiáng),吳雨龍,張崇昊,張?jiān)词?

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生理生化重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室,南京 210095;2.南京曉莊學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院,南京 211171)

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)作為重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng),在全身或各器官的局部調(diào)節(jié)多種機(jī)體功能,如在全身或血液循環(huán)中主要參與調(diào)控血壓、維持心血管功能穩(wěn)態(tài)、電解質(zhì)和體液平衡等;而在局部或組織中則以調(diào)節(jié)多種器官的功能為主,如心、肝、腎以及肺等。經(jīng)典RAS諸多成分已被證實(shí)存在于胃腸道中,并對(duì)體液、電解質(zhì)、葡萄糖和肽的分泌及吸收、胃腸蠕動(dòng)和腸系膜血液循環(huán)等一系列過(guò)程產(chǎn)生功能性影響[1]。近年來(lái),研究發(fā)現(xiàn),RAS新的調(diào)控因子——血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)可促進(jìn)腸黏膜吸收消化多肽,維持腸道微生態(tài)平衡[2-3];ACE2的水解產(chǎn)物Ang(1-7)可通過(guò)降低MAPK和NF-κB信號(hào)通路的活性抑制炎癥性腸病(IBD)的發(fā)展[4],這表明,RAS相關(guān)成分特別是ACE2在維護(hù)腸道健康方面具有積極作用。

ACE2作為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)的同系物,是RAS發(fā)揮作用的主要成員。自2000年首次發(fā)現(xiàn)以來(lái),多項(xiàng)研究結(jié)果表明,ACE2在抗組織炎癥損傷方面展現(xiàn)出巨大潛力,其主要通過(guò)降解Ang Ⅱ產(chǎn)生Ang(1-7),參與血壓調(diào)節(jié)、人體水鹽代謝平衡和抗組織纖維化等過(guò)程,具有顯著的抗炎抗纖維化功能[5-7]。作為RAS中新的ACE2-Ang(1-7)-MasR通路的核心酶,ACE2一方面作為抗炎蛋白降解Ang Ⅱ以緩解或抵抗Ang Ⅱ介導(dǎo)的炎癥反應(yīng);另一方面通過(guò)其下游產(chǎn)物Ang(1-7)激活MasR發(fā)揮抗炎作用[8]。這表明RAS具有雙重調(diào)節(jié)功能,既能通過(guò)ACE-Ang Ⅱ-AT1R途徑發(fā)揮收縮血管、損傷黏膜的作用,又能通過(guò)ACE2-Ang(1-7)-MasR途徑發(fā)揮擴(kuò)張血管、抑制炎癥等抗損傷的作用[9]。另外,空腸是豬營(yíng)養(yǎng)吸收的主要腸段,以腹瀉為主要癥狀的腸道炎性病變極大破壞了腸道屏障,嚴(yán)重影響生豬的生長(zhǎng)發(fā)育。目前,ACE2的研究主要集中在人和嚙齒類(lèi)動(dòng)物,關(guān)于豬腸道健康的研究不多,特別是通過(guò)調(diào)控ACE2影響RAS的平衡來(lái)探究其與腸道穩(wěn)態(tài)的關(guān)系更是缺乏。本研究以臨床上出現(xiàn)腹瀉癥狀的保育豬的空腸為研究對(duì)象,通過(guò)組織病理學(xué)及對(duì)空腸組織相關(guān)炎性因子檢測(cè)明確由于臨床中普遍出現(xiàn)的腹瀉癥狀而導(dǎo)致的空腸炎癥性損傷,同時(shí)觀察此情況下其空腸局部RAS相關(guān)組分特別是ACE2的表達(dá)變化,探究RAS與腹瀉豬空腸炎癥的相互關(guān)系,從而為腸道局部ACE2的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑和儀器 4%多聚甲醛(南京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司);3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB,江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司);Trizol試劑盒(日本TaKaRa公司);RNA抑制劑(美國(guó)Promega公司);PVDF膜(美國(guó)Millipore公司);豬血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、豬血管緊張素1-7(Ang 1-7)、豬腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素(IL-10)ELISA試劑盒(南京奧青生物技術(shù)有限公司)等。

石蠟切片機(jī)(RM2235,德國(guó)徠卡公司);顯微鏡(BH-2,日本奧林巴斯株式會(huì)社);高速冷凍離心機(jī)(Mikro-22R,德國(guó)Andreas公司);核酸蛋白測(cè)定儀(BioPhotometer D30,德國(guó)Eppendorf公司);PCR儀(Tpersonral,美國(guó)Biometra公司);電泳儀及半干轉(zhuǎn)印儀(Power pac300,美國(guó)BIO-RAD公司);全自動(dòng)發(fā)光成像系統(tǒng)(Tanon-5200 Multi,上海天能科技有限公司)等。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集 試驗(yàn)所需動(dòng)物樣本來(lái)源于江蘇梅林公司華明豬場(chǎng)40～50日齡保育蘇姜母豬。挑選健康和臨床表現(xiàn)出嚴(yán)重腹瀉癥狀的保育豬分組分欄并進(jìn)行隔離飼養(yǎng),每組6只,共兩組,期間自由采食和飲水。分別對(duì)健康保育豬和患有嚴(yán)重水樣腹瀉癥狀且瀕臨死亡的保育豬頸部放血處死。截取空腸組織并用0.9%氯化鈉溶液漂洗,將其中一部分迅速移入液氮中,于-80 ℃保存;另一部分(空腸前、后段)被截取為0.5 cm3左右的組織塊并移入4%多聚甲醛,室溫保存。

1.2 方法

1.2.1 臨床腹瀉保育豬空腸組織中相關(guān)炎性因子含量的測(cè)定 ELISA法檢測(cè)腹瀉保育豬以及正常保育豬空腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-10和Ang II、Ang(1-7)的含量。首先稱(chēng)取100 mg空腸組織于1 mL預(yù)冷裂解液中勻漿,4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min,取上清。按照ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)含量變化,根據(jù)所測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品OD450 nm值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得出樣品濃度(TNF-α、IL-1β、IL-10單位:ng·mL-1;Ang II、Ang(1-7)單位:pg·mL-1),并對(duì)最終數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.2 臨床腹瀉保育豬空腸組織病理學(xué)切片制作 首先用4%多聚甲醛固定豬的空腸組織樣品,然后將組織樣品于固定液中固定24 h或更久,接著取出組織樣品分別在固定液、80%酒精、90%酒精、95%酒精和無(wú)水乙醇條件下依次梯度脫水,將其放入二甲苯中浸泡并進(jìn)行浸蠟包埋處理,包埋好的組織冷卻后切片(3 μm)并做標(biāo)記進(jìn)行HE染色,最后用中性樹(shù)膠做封閉處理,于顯微鏡下觀察。

1.2.3 臨床腹瀉保育豬空腸組織ACE2、MasR基因的RT-qPCR檢測(cè)

1.2.3.1 空腸組織總RNA的提取:取臨床表現(xiàn)出腹瀉癥狀的保育豬及正常保育豬的空腸組織約100 mg,徹底勻漿,采用Trizol一步法抽提以上腸段組織的總RNA,以紫外比色法測(cè)定總RNA的濃度和純度。

1.2.3.2 反轉(zhuǎn)錄:根據(jù)測(cè)得空腸組織的總RNA濃度,用DEPC水統(tǒng)一濃度至500 ng·mL-1。選擇完整性好且A260 nm/A280 nm/為1.8～2.0的RNA,采用二步法反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.3.3 目的基因引物設(shè)計(jì):根據(jù)GenBank上公布的豬ACE2、Mas受體及β-Actin內(nèi)參基因序列,用Primer Premier 5軟件自行設(shè)計(jì)引物(表1),由南京擎科生物科技有限公司合成。

表1 目的基因及β-Actin引物序列

1.2.3.4 Real-time PCR檢測(cè):以β-Actin為內(nèi)參,采用熒光定量PCR SYBR Green染料對(duì)ACE2、Mas受體基因進(jìn)行相對(duì)定量分析。反應(yīng)條件為95 ℃ 預(yù)變性 2 min;95 ℃ 變性5 s,60 ℃ 退火30 s,72 ℃ 延伸30 s,共40個(gè)循環(huán),利用相對(duì)定量ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.2.4 臨床腹瀉保育豬空腸組織RAS相關(guān)組分的變化

1.2.4.1 空腸組織中RAS相關(guān)組分蛋白表達(dá)的Western blot分析:稱(chēng)取100 mg仔豬空腸組織于1 mL裂解液中勻漿,離心取上清,按照“試劑A∶試劑B=50∶1的比例”配制 BCA工作液,酶標(biāo)儀測(cè)定A562nm,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出蛋白濃度。以120 V,90 min的條件SDS-PAGE電泳,以1.5 mA·cm-2、90 min的條件轉(zhuǎn)印,5%脫脂奶粉液中封閉2 h,先后孵育一抗(ACE2∶1∶3 000;MasR/ACE/AT1R∶1∶2 000;4 ℃過(guò)夜)和二抗(室溫2 h),抗體孵育按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,避光條件下滴加AB顯色液顯色5 min并拍照,以GAPDH作內(nèi)參,目的條帶與其相比得到相對(duì)量。

2 結(jié) 果

2.1 臨床腹瀉保育豬空腸組織中相關(guān)炎性因子的變化

相關(guān)炎性因子檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。與正常豬相比,表現(xiàn)臨床腹瀉癥狀的保育豬空腸組織中促炎性因子TNF-α、IL-1β的含量顯著升高(P<0.05);其空腸組織中抗炎性因子IL-10有下降的趨勢(shì),但無(wú)顯著性。

2.2 臨床腹瀉保育豬空腸組織形態(tài)學(xué)變化

空腸組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果如圖2所示。相比于臨床腹瀉豬,正常豬空腸組織結(jié)構(gòu)相對(duì)完整,腺體正常。表現(xiàn)臨床腹瀉癥狀的保育豬空腸組織不完整,腸絨毛壞死脫落(4×視野,圖2A),腸腺上皮細(xì)胞增生(10×視野,圖2A),腸絨毛內(nèi)部結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞(40×視野,圖2A)。當(dāng)發(fā)生嚴(yán)重腹瀉時(shí),保育豬空腸可見(jiàn)水樣黏液,腸腺濃染(4×視野,圖2B),空腸結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞,腸絨毛腫脹(10×視野,圖2B),并伴有大量出血點(diǎn)(40×視野,圖2B)。

A. 腹瀉豬空腸;B. 重度腹瀉豬空腸;C. 正常豬空腸。掃描文章首頁(yè)OSID碼可查看彩圖A. Jejunum of piglets with diarrhea; B. Jejunum of piglets with severe diarrhea; C. Normal piglet jejunum. The color pictures can be found by scanning the OSID code on the front page of the article

與正常豬相比,*表示差異顯著(P<0.05)Compared with normal piglets, * indicated that the difference was significant (P<0.05) 圖1 空腸組織中炎性因子的含量(n=6)Fig.1 Contents of inflammatory factors in pig jejunal tissues (n=6)

2.3 臨床腹瀉保育豬空腸組織中ACE2、MasR mRNA表達(dá)

ACE2是RAS系統(tǒng)中關(guān)鍵的調(diào)控因子,其發(fā)揮作用主要依賴(lài)于下游Ang(1-7)和Mas受體,探究發(fā)生腸道炎癥的空腸組織中ACE2與Mas受體變化對(duì)于后續(xù)研究尤為重要。結(jié)果如圖3所示。與正常保育豬相比,表現(xiàn)臨床腹瀉癥狀的保育豬空腸組織ACE2 mRNA水平下調(diào),但無(wú)顯著性(P>0.05);ACE2下游受體MasRmRNA水平相比于正常豬極顯著下降(P<0.01)。

與正常豬相比,**表示差異極顯著(P<0.01)Compared with normal piglets,** indicate that the difference was very significant (P<0.01)

2.4 臨床腹瀉保育豬空腸組織中RAS相關(guān)組分含量及蛋白的表達(dá)

2.4.1 臨床腹瀉保育豬空腸組織中Ang II、Ang(1-7)含量的變化 結(jié)果如圖4所示。與正常豬相比,表現(xiàn)臨床腹瀉癥狀的保育豬空腸組織中Ang Ⅱ 含量升高,而Ang(1-7)含量降低。

圖4 空腸組織中Ang Ⅱ和Ang(1-7)含量(n=6)Fig.4 Contents of Ang Ⅱ and Ang (1-7) in jejunal tissues (n=6)

2.4.2 臨床腹瀉保育豬空腸組織中ACE2、MasR、ACE和AT1R蛋白的表達(dá) Western blot結(jié)果如圖5A、B所示。灰度分析發(fā)現(xiàn):表現(xiàn)臨床腹瀉癥狀的保育豬空腸組織中ACE2蛋白水平顯著低于正常豬(P<0.05)(圖5C),Mas受體蛋白水平極顯著低于正常豬(P<0.01)(圖5D),蛋白水平結(jié)果與mRNA結(jié)果一致,這說(shuō)明在腸道炎癥狀態(tài)下ACE2水平的表達(dá)下調(diào),其下游受體Mas表達(dá)下調(diào)。為了探究豬腹瀉性腸道炎癥與RAS經(jīng)典軸的關(guān)系,繼續(xù)檢測(cè)另一條軸ACE和AT1R的蛋白表達(dá),結(jié)果如圖5E、F所示。ACE和AT1R蛋白在臨床腹瀉保育豬空腸組織中的表達(dá)均極顯著高于正常豬(P<0.01)。

與正常豬相比,*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01)Compared with normal piglets, * indicate that the difference was significant (P<0.05),** indicate that the difference was very significant (P<0.01)

2.4.3 臨床腹瀉保育豬空腸組織中ACE2/ACE蛋白表達(dá)比值分析 RAS中ACE-Ang Ⅱ-AT1R軸與ACE2-Ang(1-7)-MasR軸發(fā)揮兩種截然不同的作用。本研究分別將正常與表現(xiàn)臨床腹瀉癥狀的豬空腸組織中ACE2與ACE蛋白表達(dá)進(jìn)行比較分析,發(fā)現(xiàn)在正常豬中ACE2/ACE比值大于1(圖6),說(shuō)明此時(shí)ACE2表達(dá)占優(yōu)勢(shì),ACE表達(dá)占劣勢(shì),ACE2-Ang(1-7)-Mas軸發(fā)揮主要的作用。而在表現(xiàn)臨床腹瀉癥狀的保育豬中,ACE2/ACE比值小于1,說(shuō)明此時(shí)ACE2表達(dá)占劣勢(shì),ACE表達(dá)占優(yōu)勢(shì),符合炎癥發(fā)生時(shí)ACE出現(xiàn)上調(diào)的趨勢(shì),且此時(shí)ACE-Ang Ⅱ-AT1軸發(fā)揮主要作用。

圖6 ACE2/ACE比值分析(n=6)Fig.6 Ratio analysis of ACE2/ACE (n=6)

3 討 論

我國(guó)不僅是農(nóng)業(yè)大國(guó),同時(shí)也是世界養(yǎng)豬生產(chǎn)的第一大國(guó),無(wú)論是生豬養(yǎng)殖規(guī)模還是豬肉消費(fèi)量均居世界第一。尤其是近年來(lái),我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)在技術(shù)水平,規(guī)?；潭?動(dòng)物福利研究等方面均取得一定的進(jìn)展,但仍面臨諸多挑戰(zhàn)。隨著集約化養(yǎng)殖模式的發(fā)展與流行,各種細(xì)菌性、病毒性疾病嚴(yán)重危害生豬養(yǎng)殖業(yè)。其中保育豬需要經(jīng)過(guò)仔豬斷奶后變料至育肥階段,在這一階段豬自身消化系統(tǒng)發(fā)育尚未完全成熟且對(duì)環(huán)境適應(yīng)性較差,加之?dāng)嗄?、變溫、換舍和換料等應(yīng)激,極易誘發(fā)消化道疾病,引發(fā)生豬不同程度的感染,最終導(dǎo)致仔豬出現(xiàn)以腹瀉為主要癥狀的慢性腸道炎癥,影響仔豬生長(zhǎng)存活率和集約化養(yǎng)殖的整體效益[10]。腹瀉是多種疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有的共同現(xiàn)象,由于腸黏膜屏障損傷以及炎癥介質(zhì)過(guò)度釋放等直接介導(dǎo)腸道炎性損傷的發(fā)生,通常表現(xiàn)為腹瀉,精神沉郁,個(gè)體弱小,嚴(yán)重時(shí)甚至死亡[11-12]。本文以臨床上出現(xiàn)腹瀉癥狀的保育豬為研究對(duì)象,通過(guò)分析其空腸組織病理學(xué)變化及相關(guān)炎性因子的表達(dá),證實(shí)臨床中表現(xiàn)出的腹瀉癥狀最終能夠誘發(fā)嚴(yán)重的空腸組織病變,主要表現(xiàn)在腸絨毛壞死脫落,腸腺上皮細(xì)胞大量增生,腸內(nèi)伴有出血點(diǎn),炎癥因子大量釋放,空腸結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞。這極大地威脅了保育豬的生長(zhǎng)發(fā)育。

一直以來(lái),腎素-血管緊張素系統(tǒng)都在血壓調(diào)節(jié),水鹽代謝等發(fā)面發(fā)揮重要作用。自2012年Hashimoto等[13]發(fā)現(xiàn)ACE2對(duì)抑制腸道炎癥、維持腸道穩(wěn)態(tài)、保護(hù)腸道健康等方面同樣具有積極的影響后便開(kāi)啟了ACE2在腸道炎癥方面的新篇章。Yisireyili等[14]發(fā)現(xiàn)腸道炎癥過(guò)程中ACE2具有抗炎且促進(jìn)氨基酸代謝吸收的功能。Garg等[15]發(fā)現(xiàn)在腸炎患者體內(nèi),RAS經(jīng)典成員(ACE、Ang Ⅱ、AT1)的含量與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異,而新成員ACE2、Ang(1-7)的表達(dá)上調(diào),且Ang(1-7)的表達(dá)水平與血小板和白細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān),提示ACE2和Ang(1-7)具有作為腸道炎癥的生物標(biāo)志物的潛力。

ACE2作為RAS中的關(guān)鍵酶及中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的穩(wěn)定劑,對(duì)控制腸道炎癥具有重要作用。越來(lái)越多的研究表明 ACE2對(duì)腸道炎癥反應(yīng)具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用,主要通過(guò)水解Ang II,生成Ang (1-7),從而減少細(xì)胞因子的釋放、組織損傷及纖維化,并與Mas受體結(jié)合發(fā)揮抗炎和抗增殖的作用[16]。本研究通過(guò)仔豬腹瀉性空腸炎癥變化也發(fā)現(xiàn),由ACE-Ang II-AT1R軸與ACE2-Ang(1-7)-MasR軸構(gòu)成的RAS平衡被打破,腹瀉誘發(fā)空腸炎性損傷,并激活A(yù)CE-Ang II-AT1R軸。此時(shí),空腸內(nèi)負(fù)責(zé)水解Ang II并維持其平衡的ACE2受到抑制,過(guò)量的Ang II被釋放出來(lái),沒(méi)有足夠的Ang(1-7)與下游Mas受體結(jié)合,這進(jìn)一步導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加劇。

目前,ACE2的研究多局限于人和嚙齒類(lèi)動(dòng)物,在豬上的研究相對(duì)遲緩,最早是Yang等[17]研究發(fā)現(xiàn),B0AT1與ACE2可通過(guò)特殊的調(diào)控機(jī)制在仔豬完整的小腸隱窩-絨毛軸表達(dá),B0AT1基因通過(guò)完整的隱窩-絨毛軸在上皮轉(zhuǎn)錄以及與ACE2在頂點(diǎn)膜上的共表達(dá)導(dǎo)致腸段Na+-中性氨基酸吸收活性增強(qiáng),這對(duì)促進(jìn)腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收,維護(hù)腸道健康具有積極影響。本研究發(fā)現(xiàn)腹瀉可導(dǎo)致保育豬腸道增生性炎癥以及腸內(nèi)Ang II過(guò)表達(dá),會(huì)加速炎癥反應(yīng)的發(fā)生,RAS相關(guān)組分均處于激活狀態(tài),ACE介導(dǎo)的ACE-Ang II-AT1R軸處于優(yōu)勢(shì),而ACE2及其下游介導(dǎo)的ACE2-Ang(1-7)-MasR軸處于劣勢(shì)。因此,作者認(rèn)為ACE2作為ACE的拮抗劑發(fā)揮抑制腸道炎癥的功能。另外,根據(jù)已有的研究結(jié)果可以推測(cè)ACE2是腸道微生態(tài)穩(wěn)定、氨基酸平衡、先天免疫以及腸道炎癥易感性的關(guān)鍵調(diào)控因子,可能參與并維持腸道的微生態(tài)平衡,對(duì)維持腸道穩(wěn)態(tài)具有積極的作用,這方面的研究值得開(kāi)展。但就目前檢索的結(jié)果來(lái)看,ACE2在胃腸道方面的研究結(jié)果還不是很多,特別是在豬上的研究較少,由于豬消化道如仔豬腹瀉、育肥豬增生性腸炎等疾病一直都是養(yǎng)豬業(yè)主要解決的問(wèn)題,因此,還需要進(jìn)行更深入的研究。

4 結(jié) 論

臨床腹瀉保育豬空腸組織局部RAS被激活,ACE-Ang II-AT1R軸的活性遠(yuǎn)高于ACE2-Ang(1-7)-MasR軸,ACE2抗炎性損傷作用處于劣勢(shì)。