多粘類芽孢桿菌的研究進(jìn)展

竇龍濤,胡基華,劉春燕,曲曉軍,姜 威,閆更軒,張淑梅

(1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所,哈爾濱 150010; 2.黑龍江省科學(xué)院,哈爾濱 150001)

多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa,P.polymyxa)是一類可產(chǎn)內(nèi)生孢子的多功能革蘭氏陽性細(xì)菌,普遍存在于土壤、植物體表及根際,在海洋沉積物中[1]也有分布,其芽孢對(duì)輻射、熱、干燥、極端pH值及有毒化學(xué)物有很強(qiáng)的抵抗能力,休眠狀態(tài)下可以長期保持活力,而芽孢具有繁殖速度快、營養(yǎng)要求簡單及易于在植物根圍定殖的特點(diǎn)[2]。P.polymyxa經(jīng)歷了一系列分類學(xué)上的變化,于1880年首次被發(fā)現(xiàn)后稱為Clostridiumpolymyxa[3],1989年因其桿狀細(xì)胞而更名為多粘芽孢桿菌。1993年,Ash等通過PCR探針實(shí)驗(yàn)對(duì)16S rRNA的比較序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),這類菌與典型的芽孢桿菌存在明顯的差異性,將11個(gè)種從芽孢桿菌屬內(nèi)分離,劃為類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)[4]。多粘類芽孢桿菌作為類芽孢桿菌的模式菌,環(huán)保安全,具有廣闊的應(yīng)用前景,美國環(huán)保署(Environmental Protection Agency)將其列入可作商用的微生物之一[5]。除了在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用外,還應(yīng)用于醫(yī)藥及工業(yè)等領(lǐng)域,其發(fā)酵產(chǎn)生的多粘菌素在應(yīng)用上已較為成熟。近年來,生物技術(shù)飛速發(fā)展,研究工具與研究方法逐漸完善,為多粘類芽孢桿菌的相關(guān)研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 多粘類芽孢桿菌代謝活性物質(zhì)研究

多粘類芽孢桿菌能夠產(chǎn)生豐富的具有生物活性的代謝物質(zhì),誘導(dǎo)寄主植物抗病,防治病害。這些活性物質(zhì)按結(jié)構(gòu)分類大多為多肽、多糖、蛋白質(zhì),還有核苷類似物、醇醛酸及吡嗪類等物質(zhì)[6]。

1.1 多肽類

多粘類芽孢桿菌產(chǎn)生的小分子結(jié)構(gòu)的肽類抗生素是通過非核糖體代謝途徑合成的[7],可分為兩類：一類能夠很好地抑制細(xì)菌生長,包括多粘菌素、環(huán)桿菌素、喬利肽菌素等;另一類對(duì)真菌與革蘭氏陽性細(xì)菌都有抗菌活性,包括多肽菌素、谷纈菌素、殺鐮孢菌素等[8]。

多粘菌素是一種重要的環(huán)寡肽類抗生素,于1947年首次從P.polymyxa中分離出來[9],是質(zhì)量約為1200 Da的小脂肽分子,特點(diǎn)是具有一個(gè)聚陽離子肽環(huán),一個(gè)短的突出肽附著在疏水的脂肪酸尾上[10],目前已經(jīng)分離和表征了15種以上的多粘菌素,其中最突出的是多粘菌素B與多粘菌素E(也稱為粘菌素)[11- 12]。多粘菌素B與粘菌素的不同之處在于肽環(huán)中的一個(gè)氨基酸殘基,其中D-苯丙氨酸被粘菌素中的D-亮氨酸殘基取代[13-14]。作為膜靶向抗生素,所有的多粘菌素肽都具有相似的殺菌活性,對(duì)革蘭氏陰性菌及少數(shù)革蘭氏陽性菌都有效[15- 16]。多粘菌素通過破壞膜完整性引起細(xì)胞損傷,導(dǎo)致細(xì)胞死亡。多粘菌素及其相關(guān)物質(zhì)一直被廣泛用于臨床治療,直到20世紀(jì)80年代,其腎毒性導(dǎo)致使用量下降[17]。后來,由于臨床多耐藥革蘭氏陰性菌的出現(xiàn),多粘菌素又再次被重視。目前已嘗試對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行一定程度的化學(xué)修飾降低毒性。此外,劑量的變化、配方的修改在很大程度上降低了毒性水平。

殺鐮孢菌素是多粘類芽孢桿菌產(chǎn)生的重要的抗真菌脂肽抗生素[18]。從多粘類芽孢桿菌菌株中分離并鑒定了多種殺鐮孢菌素,各類殺鐮孢菌素在體外對(duì)革蘭氏陽性菌和鐮刀菌屬均表現(xiàn)出抗菌活性。殺鐮孢菌素對(duì)細(xì)胞膜有不利影響,會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)離子的損失[19]。Tsai等[20]通過先進(jìn)的質(zhì)譜及網(wǎng)絡(luò)分析,將P.polymyxaTP3產(chǎn)生的殺鐮孢菌素型化合物有效地揭示出來,推測(cè)其在拮抗灰霉病菌中發(fā)揮作用。

1.2 多糖類

胞外多糖(EPS)是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分,近年來,作為一種生物材料來源越來越受到人們的關(guān)注。微生物胞外多糖與動(dòng)植物多糖相比,具有增黏性、耐鹽性及抗溫性等優(yōu)點(diǎn)。研究表明,P.polymyxa胞外多糖具有抗炎、抗氧化、抗凝血、抗腫瘤等作用[6,21-22]。Wang等[23]研究發(fā)現(xiàn),從P.polymyxaPYQ1中分離純化出的胞外多糖,可提高過氧化氫酶活性并維持膜完整性,對(duì)UVC誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。Liu等[24]將P.polymyxaEJS-3的果聚糖型胞外多糖分別酰化、磷酸化及芐化,提高了其衍生物的還原能力,增強(qiáng)了其對(duì)超氧自由基及羥基自由基的清除活性。劉俊等[25]證明,胞外多糖可增強(qiáng)小鼠的免疫功能,Mokaddem等[26]研究發(fā)現(xiàn),P.polymyxaCHL0102產(chǎn)生的多糖可從水溶液中去除鎘,進(jìn)而達(dá)到凈化水質(zhì)的目的。Raza等[27]研究表明,P.polymyxaSQR-21的EPS顯示出良好的超氧化物清除、絮凝及金屬螯合活性,對(duì)脂質(zhì)過氧化與還原活性有抑制作用。此外,P.polymyxa產(chǎn)胞外多糖在農(nóng)藥助劑方面具有助懸浮及熱保護(hù)作用[28]。

1.3 蛋白質(zhì)類

多粘類芽孢桿菌能產(chǎn)生多種大分子拮抗蛋白,主要包括一些水解酶類,如木聚糖酶、蛋白酶及纖維素酶等[29],它們能使宿主菌的核細(xì)胞壁特異性降解,進(jìn)而抑制宿主菌生長。Ran等[30]從P.polymyxa7F1中純化出一種新型抗真菌蛋白并成功表達(dá),該蛋白能有效防治植物枯萎病。金美芳[31]利用硫酸銨和凝膠層析法檢測(cè)到多粘類芽孢桿菌S960中相對(duì)分子量約為66.2 kDa的活性蛋白,該蛋白具有抑制尖孢鐮刀菌生長的作用。姚烏蘭[32]從P.polymyxaWY110發(fā)酵液中分離得到的P2蛋白對(duì)稻瘟病菌具有良好的拮抗作用。徐玲等[33]從P.polymyxaHY96-2分離檢測(cè)到分子量<5 kDa混合物蛋白可有效抑制蕃茄青枯病菌。陳雪麗等[34-35]從P.polymyxaBRF-1分離純化分子量為35.4 kDa的蛋白,可抑制黃瓜尖孢鐮刀病菌。Kavitha等[36]從P.polymyxaVLB 16分離鑒定出分子量為37 kDa的蛋白,對(duì)稻瘟病菌、絲核菌具有良好的抑制作用。鄧陽[37]從P.polymyxaJSa-9分離出分子量為71.9 kDa的抗菌蛋白,具有廣譜抑菌活性,能夠有效抑制大腸桿菌、藤黃微球菌、點(diǎn)青霉等病原菌的活性。

表1 幾種多粘類芽孢桿菌抗菌蛋白分子量及抑制病原菌種類

1.4 其他活性物質(zhì)

多粘類芽孢桿菌還能產(chǎn)出其他具有較高價(jià)值的代謝產(chǎn)物。Khan等[38]發(fā)現(xiàn)從百合鱗莖中分離得到的P.polymyxaSK1中含有有機(jī)酸、吲哚-3 -乙酸(IAA)等植物激素,可促進(jìn)植物生長。Tupinamba[39]等發(fā)現(xiàn),由P.polymyxaSCE2合成的吩嗪-1-羧酸(PCA)對(duì)不同真菌毒素、真菌菌株具有潛在的拮抗活性,還具有醫(yī)用殺菌及抗腫瘤等作用。對(duì)多粘類芽孢桿菌代謝產(chǎn)物的化學(xué)成分進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),其中一種異黃酮類物質(zhì)(金雀異黃素)具有抗炎癥、抗氧化及促進(jìn)細(xì)胞凋亡等作用[40]。此外,多粘類芽孢桿菌還能產(chǎn)生絮凝劑、表面活性劑、植物激素等活性物質(zhì)。

2 多粘類芽孢桿菌的基因研究

基因測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展促使微生物測(cè)序數(shù)據(jù)不斷豐富,加速了對(duì)多粘類芽孢桿菌相關(guān)分子機(jī)制的研究[41]。2010年,Kim等[42]報(bào)道了P.polymyxaE681的完整基因組序列,基于序列調(diào)查和生化分析提出生長素可能是通過吲哚-3-丙酮酸途徑合成的。Jeong等[43]報(bào)道了P.polymyxaATCC 842T的基因草圖,提出其基因組包含一系列用于抗生素和水解酶的生物合成基因。Mahmoud等[44]從大麻籽油中分離出P.polymyxaHOB6,對(duì)其基因組進(jìn)行了測(cè)序及注釋,揭示了其編碼抗菌羊毛硫肽與非核糖體肽的生物合成途徑的能力。Soni等[45]對(duì)P.polymyxaHK4進(jìn)行基因組測(cè)序,揭示了HK4的內(nèi)在益生菌前景,為畜牧業(yè)及工業(yè)提供了一種可行的抗生素。Luo等[46]報(bào)道了P.polymyxaHY96-2的完整基因組序列,并與多種多粘類芽孢桿菌菌株進(jìn)行了比較基因組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)其都具有通過定殖(生物膜形成)、拮抗(抗生素產(chǎn)生)和誘導(dǎo)抗性(系統(tǒng)抗性誘導(dǎo)劑產(chǎn)生)機(jī)制控制植物病害的能力。Mamphogoro等[47]報(bào)道了P.polymyxaSRT9.1的全基因組序列,它由6 754 470 bp和7878個(gè)編碼序列組成,平均G+C含量為45%,該菌株具有開發(fā)為農(nóng)業(yè)生物防治劑的潛力。

隨著研究的深入,越來越多的多粘類芽孢桿菌基因組被完全測(cè)序,目前NCBI GenBank中提供了57株多粘菌的全基因組,典型的多粘類芽孢桿菌菌株E681(5.2 Mb)[42]、SRT9.1(6.75 Mb)[47]、SC2(5.7 Mb)[48]、M1、HY96-2、ATCC842(5.89 Mb)、CR1[49]、CF05[50]等全基因組序列均已錄入GenBank。最近對(duì)14株多粘菌的全基因組[51](即核心基因組加上可有可無的基因組)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)了9345個(gè)基因。其中3194個(gè)屬于副基因組,3063個(gè)在所有研究菌株中共享,平均每個(gè)菌株有220個(gè)特有的基因[3]。Zhou[52]等發(fā)現(xiàn),與固氮相關(guān)的NIF簇基因僅存在于某些菌株中,這一發(fā)現(xiàn)表明固氮能力在多粘類芽孢桿菌中不穩(wěn)定,對(duì)多粘類芽孢桿菌中抗生素基因簇的分析發(fā)現(xiàn),這些基因在核心基因組和附屬基因組中都存在。這一觀察表明,生存環(huán)境的差異導(dǎo)致部分菌株喪失了合成抗生素的能力。目前對(duì)多粘類芽孢桿菌的泛基因組學(xué)分析將有助于理解生物防治及促進(jìn)植物生長的機(jī)制,這也將促進(jìn)多粘類芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)上的使用。

3 多粘類芽孢桿菌的應(yīng)用研究

隨著生物技術(shù)的發(fā)展,多粘類芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)、工業(yè)及醫(yī)藥等領(lǐng)域均表現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

3.1 農(nóng)業(yè)應(yīng)用研究

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,多粘類芽孢桿菌的作用主要體現(xiàn)在促生作用及生物防治兩個(gè)方面。P.polymyxa是一種很有前途的植物根際促生菌(plantgrowth-promotingrhizobacteria,PGPR),與多種寄主植物相關(guān),包括重要的農(nóng)藝植物[53]。多粘類芽孢桿菌有多種促生機(jī)制,如固氮、分泌植物激素、溶解礦物磷酸鹽、誘導(dǎo)植物抗性等方式。Anand等[54]發(fā)現(xiàn),P.polymyxaP2b-2R通過固氮促進(jìn)了松樹幼苗的生長,幼苗生物量增加了1倍。Sun等[55]研究表明,P.polymyxaSC2及其自發(fā)突變體SC2-M1可通過直接分泌IAA促進(jìn)植物生長。Abdallah等[56]對(duì)從棉花根際土壤中分離出的P.polymyxaSx3進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),Sx3能固氮、增溶磷酸鹽并產(chǎn)生吲哚乙酸,從而促進(jìn)水稻生長。Abdel等[57]發(fā)現(xiàn),多粘類芽孢桿菌可通過提高抗氧化防御系統(tǒng)、改善色素及礦質(zhì)營養(yǎng)素、減少根和莖中Cu的積累等方式減輕銅脅迫,進(jìn)而促進(jìn)玉米植株生長。以P.polymyxaSQR-21為研究對(duì)象,發(fā)現(xiàn)它可以通過改變根蛋白組成來促進(jìn)寄主植物的生長[58]。

生物防治是一種生態(tài)友好、安全、可持續(xù)的植物感染控制方法。Yi等[59]從P.polymyxaY-1的發(fā)酵液中分離出的代謝物能有效防治水稻細(xì)菌性病害,該研究結(jié)果將為開發(fā)治療水稻細(xì)菌性病害的新型微生物農(nóng)藥提供重要參考。Zhai等[60]研究表明,P.polymyxaHX-140菌株能產(chǎn)生纖維素酶、β-1,3-葡聚糖酶、蛋白酶及抗真菌揮發(fā)性有機(jī)化合物,在防治黃瓜枯萎病及其他真菌病害方面具有重要潛力。以P.polymyxaNMA1017為研究對(duì)象,發(fā)現(xiàn)它不僅能抑制細(xì)菌生長,還能抑制植物根系中的真菌及卵菌[61]。在P.polymyxaY-1中首次分離出多粘菌素B1和E2,可防治水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae,Xoo)及水稻細(xì)菌性條斑病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola,Xoc)[62]。

除了生物防治及促生長作用,P.polymyxa還能提高農(nóng)作物品質(zhì)。研究表明,多粘類芽孢桿菌能夠通過提高某些植物光合作用速率的方式增加其有機(jī)物積累[63]。宿燕明等[64]以油菜為研究對(duì)象,發(fā)現(xiàn)多粘類芽孢桿菌能使油菜中的硝酸鹽含量降低。

3.2 工業(yè)應(yīng)用研究

多粘類芽孢桿菌能在不需要基因改造的情況下生產(chǎn)高純度的2,3-丁二醇[65],其衍生物可用于制備合成橡膠、防凍劑、溶劑、塑料、防腐劑、藥物、化妝品、乳液、生物防腐劑、生產(chǎn)酶制劑、分離赤鐵礦、黃鐵礦及黃銅礦等,還可用來處理廢物與自來水及發(fā)酵食物。Alagawany等[66]將P.polymyxaLM31添加到日本鵪鶉的飼料中,結(jié)果顯示,其提高了抗氧化及抗菌活性,對(duì)鵪鶉生長、血液及腸道細(xì)菌群均有影響。以P.polymyxa20185為研究對(duì)象,對(duì)其產(chǎn)堿性果膠酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化[67],奠定了其在棉紡織預(yù)處理、造紙、咖啡及茶發(fā)酵等方面的工業(yè)化應(yīng)用基礎(chǔ)。李衛(wèi)芬等[68]通過分析P.polymyxa產(chǎn)生的β-葡聚糖酶,為該菌在飼料工業(yè)的發(fā)展提供理論指導(dǎo)。趙巖等[69]從P.polymyxaKF-1發(fā)酵液上清中高效分離出果膠裂解酶,為其在果汁工業(yè)及紡織工業(yè)的發(fā)展提供依據(jù)。Bohra等[70]研究發(fā)現(xiàn),P.polymyxaND24能利用甘蔗渣、稻草、玉米淀粉、CMC及微晶纖維素作為唯一的碳源,高效生產(chǎn)纖維素酶。Baikui Wang等[71]研究發(fā)現(xiàn),P.polymyxaBSC10能改善腸道健康,提高飼料利用率,促進(jìn)肉雞生長,該研究可應(yīng)用于養(yǎng)殖工業(yè)。Ariza等[72]研究表明,多粘類芽孢桿菌產(chǎn)生的木葡聚糖酶可通過去除半纖維素多糖來幫助生物質(zhì)降解,促進(jìn)紡織及洗滌劑行業(yè)發(fā)展。在礦工業(yè)領(lǐng)域,Patra等[73]通過多粘類芽孢桿菌培養(yǎng)物中的細(xì)胞及代謝產(chǎn)物的相互作用,從兩種礦物質(zhì)的混合物中分離出了方鉛礦與黃鐵礦。因多粘類芽孢桿菌產(chǎn)生的多糖具有吸附和絮凝作用,還可應(yīng)用于污水處理等環(huán)保工業(yè)。EPS對(duì)生物膜的形成也很重要,可作為生物修復(fù)劑,應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。

3.3 醫(yī)藥應(yīng)用研究

多粘類芽孢桿菌能產(chǎn)生多種抑菌活性物質(zhì),可防治疾病,提升健康水平,被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域。Abdelhamid等[74]研究表明,P.polymyxaOSY-EC能產(chǎn)生青霉素、多粘菌素E及鐮刀菌素,可高效生產(chǎn)廣譜抗菌藥物。多粘類芽孢桿菌菌株還可產(chǎn)生具有不同特征的EPS,對(duì)多粘類芽孢桿菌EJS-3的果聚糖型EPS進(jìn)行體外和體內(nèi)抗氧化活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),粗EPS及其純化部分(EPS-1和EPS-2)均具有中等的過氧化氫清除活性、脂質(zhì)過氧化抑制作用及強(qiáng)亞鐵離子螯合活性,這一發(fā)現(xiàn)可被應(yīng)用于抗氧化劑及抗腫瘤劑的開發(fā)[75]。從P.polymyxaJB115中分離出的β-葡聚糖能夠誘導(dǎo)骨髓來源的樹突狀細(xì)胞(一種有效的抗原呈遞細(xì)胞)的成熟,增強(qiáng)機(jī)體免疫,可用作免疫增強(qiáng)劑的制備[76]。

4 展望

近年來,關(guān)于P.polymyxa的功能及應(yīng)用方面的研究較為深入。它是植物生長促進(jìn)劑,具有促進(jìn)植物養(yǎng)分吸收、控制植物病原體及產(chǎn)生植物激素等作用,但在田間接種P.polymyxa的有效性可能會(huì)受到各種環(huán)境條件的限制,未來需建立其與復(fù)雜土壤生態(tài)系統(tǒng)的聯(lián)系,突破環(huán)境制約。除了農(nóng)業(yè)應(yīng)用,P.polymyxa能生產(chǎn)與醫(yī)學(xué)、工藝制造及生物修復(fù)相關(guān)的多種抗菌劑、酶及胞外多糖,其中一些已經(jīng)商業(yè)化,但P.polymyxa并不是純粹有益的,要充分發(fā)揮它的優(yōu)勢(shì)。此外,P.polymyxa在分子生物學(xué)作用機(jī)制及分子生物學(xué)改造技術(shù)等方面有很大的研究空間,未來相關(guān)的分子領(lǐng)域研究將會(huì)成為研究熱點(diǎn)。