何曉明，田小艷，王東東，劉桂武，李春梅，葉敏慧

(溫氏食品集團股份有限公司，廣東 云浮 527400)

輪狀病毒(rotavirus，RV)隸屬呼腸孤病毒科，是各種幼齡動物非細菌性腹瀉的主要病原之一[1]。在我國，豬輪狀病毒(porcine rotavirus，PoRV)感染非常普遍，PoRV感染后，使仔豬機體免疫力急劇下降，從而誘發(fā)多種腹瀉病原混合感染，導(dǎo)致仔豬死亡率上升或生長緩慢、停滯[2]。豬輪狀病毒的基因組是由11個獨立片段的雙股正鏈RNA(dsRNA)組成。分別編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1～VP4，VP6和VP7)和6種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1～NSP6)，其中，第11節(jié)段有的編碼2種蛋白(NSP5和NSP6)[3]。PoRV的11個基因之間均易發(fā)生重配事件[4]。病毒粒子有3層衣殼，呈20面體對稱，最外層為VP7和VP4，VP7和VP4的特異性可將輪狀病毒分為2個血清型，分別是G型(VP7)和P型(VP4)[5]，且G型與P型之間會產(chǎn)生不同的組合，不同組合型的PoRV毒株誘導(dǎo)的交叉保護性低[6]。根據(jù)2013年分類方法，以及外衣殼蛋白VP4、VP7和VP6基因序列，將輪狀病毒分為G、P和I基因型[7]。輪狀病毒基因群、基因型多樣，且不同國家和地區(qū)流行類別不同。目前，在人和動物PoRV中已鑒定出35種G基因型、50種P基因型[8]和18種I基因型。

本研究擬對2021—2022年采自廣東、廣西、江西、湖南、云南和貴州6個省份的規(guī)?；i場腹瀉樣品進行PoRV檢測，對陽性場樣品進行VP4和VP7基因測序，采用生物信息學(xué)軟件進行氨基酸序列分析和系統(tǒng)進化分析，了解豬群PoRV的感染情況和流行趨勢，豐富PoRV分子流行病學(xué)資料，為有效防控PoRV提供科學(xué)依據(jù)，為新型疫苗研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料樣品

2021—2022年來自廣東、廣西、江西、湖南、云南和貴州6省規(guī)?；i場送檢的腹瀉樣品，共計86個豬場，6 472份樣品。按1∶1體積比加入無菌PBS并震蕩混勻，反復(fù)凍融3次，4 ℃ 5 000 r/min離心5 min，取上清液置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

核酸提取試劑盒購自杭州博日科技股份有限公司，HiScript?Ⅱ One Step RT-PCR Kit、DL2000 plus DNA Marker購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.3 引物設(shè)計

用于檢測豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)，豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)，PoRV，豬德爾塔冠狀病毒(porcine deltcoronavirus，PDCoV)和豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus，SADS-CoV)的引物均參照文獻[9-10]合成。同時，根據(jù)GenBank上登錄的PoRV VP7和VP4基因序列分別設(shè)計VP7、VP4基因特異性擴增引物。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物信息見表1。

表1 引物信息

1.4 臨床樣品RT-PCR檢測

吸取備用檢測樣品300 μL，使用博日抽提試劑盒及配套核酸提取儀，按操作說明書進行操作，提取的核酸于-20 ℃保存。使用HiScript?Ⅱ One Step RT-PCR Kit進行配置反應(yīng)體系，2×PCR Master Mix 12.5 μL，One Step Enzyme Mix 1.25 mL，20 μmol/L上下游引物各0.5 μL，RNA 5 μL，RNase-free ddH2O 5.25 μL，混合均勻。PCR反應(yīng)條件為：50 ℃ 30 min，94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂凝膠電泳，判定結(jié)果。

1.5 PoRV VP7和VP4基因擴增、測序

對PoRV陽性感染豬場的RT-PCR檢測條帶較亮樣品的核酸進行VP7、VP4基因的擴增，反應(yīng)體系為：2×PCR Master Mix 12.5 μL，One Step Enzyme Mix 1.25 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板5 μL，ddH2O 5.25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.2 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂凝膠電泳，將陽性擴增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.6 PoRV VP7和VP4基因型鑒定及序列分析

將測序獲得的VP7和VP4基因的核苷酸序列在NCBI BLAST在線分析，精準(zhǔn)確定相應(yīng)毒株的基因型，采用Lasergene軟件、MEGA11.0等軟件進行分析。本研究中所使用的82個參考序列 (表2)均從 GenBank 獲得。

表2 參考序列

2 結(jié)果

2.1 腹瀉樣本PoRV的檢測

2021—2022年間，共檢測了86個種豬場的6 472份腹瀉樣品，所有樣品均未檢測到TGEV和SADS-CoV病原。PEDV、PoRV和PDCoV豬場陽性率分別為：11.63%(10/86)、65.12%(56/86)和4.65%(4/86)，樣品陽性率分別為：11.80%(764/6 472)、27.89%(1 805/6 472)和2.92%(189/6 472)，提示PoRV可能是引起這些豬場腹瀉的主要病因。此外，幾種腹瀉病毒還呈現(xiàn)不同程度的混合感染，如PoRV和PEDV的混合感染率為4.57%(296/6 472)，PoRV和PDCoV的混合感染率為0.32%(21/6 472)。

2.2 PoRV VP7基因分型及系統(tǒng)進化分析

將本研究中測序獲得的76株P(guān)oRV VP7基因序列與GenBank中已知G基因型的代表毒株通過MEGA11.0軟件進行遺傳進化分析，結(jié)果顯示(圖1)：共檢測到8種基因型，其中G9為優(yōu)勢基因型(42.10%)，G5、G26、G3、G4、G1、G2和G11 各占26.32%、9.21%、6.58%、6.58%、3.95%、2.63%和2.63%。云南省豬場檢測到除G4型以外的7種基因型，YNLSTC豬場在2年內(nèi)監(jiān)測到3種G型，分別為G1、G3和G5；其余監(jiān)測豬場暫未檢測到不同的G基因型；廣東省豬場檢測到的毒株以G9(11/21)和G5(8/21)為主；江西省豬場檢測到的毒株以G9(9/15)為主；廣西省豬場檢測到的毒株以G9(4/15)為主；湖南省豬場檢測到G9(5/7)和G26(2/7)兩種基因型。由于輪狀病毒各G型毒株之間氨基酸的同源性較低，僅對測序獲得的32株G9優(yōu)勢基因型和9株參考G9基因型的氨基酸進行同源性分析，VP7基因之間氨基酸同源性為72.1%～100%(圖2)。測序所獲得的32株P(guān)[13]基因與GenBank上美國參考毒株RVA-Pig-wt-USA-Indiana119-1-2014-G9同源性僅為72.1%～74.9%。從氨基酸同源性結(jié)果來看，監(jiān)測的豬場目前暫未發(fā)現(xiàn)感染美國流行的G9基因型毒株。江西的JXJGC20210102、JXJGC20221027和廣東的GDHSYEC20221011、GDCWC20221010共4個毒株同其他G9毒株的同源性最高只有89.9%。

△為本研究中的毒株，▲為NCBI中代表毒株；GZ為貴州省毒株，YN為云南省毒株，JX為江西省毒株，HN為湖南省毒株，GX為廣西省毒株，GD為廣東省毒株。下同。

圖2 G9型毒株VP7基因氨基酸同源性性比較

2.3 PoRV VP4基因分型及系統(tǒng)進化分析

將本研究中測序獲得的35株P(guān)oRV VP4基因序列與NCBI中已知P基因型的代表毒株通過MEGA11.0軟件進行遺傳進化分析(圖3)，結(jié)果顯示：共檢測到5種P基因型，以P[13]型為主，占57.14%，其次為P[7]、P[23]、P[3]和P[6]型，占比分別為20%、14.29%、5.71%和2.86%。廣東省豬場檢測到 P[6]、P[7]、P[13]和P[23]共4種基因型，云南省和江西省豬場檢測到P[7]和P[13]2種基因型毒株，廣西省豬場檢測到P[13]和P[23]2種基因型毒株，湖南省豬場檢測到P[3]和P[13]2種基因型毒株，貴州省檢測到P[7]和P[23]2種基因型毒株。由于輪狀病毒各P型毒株之間的同源性較低，僅對20株P(guān)[13]優(yōu)勢基因型和5株參考P[13]基因型的氨基酸進行氨基酸同源性分析，VP4基因之間氨基酸同源性為72.5%～100%(圖4)，測序所獲得的20株P(guān)[13]基因與GenBank上的P[13]型參考毒株RVA-Murine-tc-CHN-SCLS-M-2018同源性在89.3%～97.2%之間，與參考毒株RVA-Pig-wt-BRA-SUI26A-2008同源性在72.5%～76.5%之間，從氨基酸同源性結(jié)果來看，豬場P[13]基因型毒株與鼠源輪狀病毒較高，推測可能是鼠源輪狀病毒通過老鼠感染了豬群。

圖3 基于PoRV VP4序列(810 bp)利用鄰近法構(gòu)建的遺傳進化樹

圖4 P[13]型毒株VP4基因氨基酸同源性比較

2.4 PoRV G/P基因型分型

35份樣本成功鑒定出G/P組合基因型，共包括15種G/P基因型組合，G9P[13](28.57%)為優(yōu)勢組合基因型，其他基因型為G5P[13](11.43%)、G4P[13](8.57%)、G9P[23](8.57%)、 G26P[13](5.71%)、G1P[7](5.71%)、G26P[3](5.71%)、G5P[7](5.71%)、G3P[7](2.86%)、G11P[23](2.86%)、G5P[23](2.86%)、G11P[7](2.86%)、G3P[13](2.86%)、G5P[6](2.86%)和G4P[7](2.86%)，其中G11P[7]為國內(nèi)首次鑒定的基因型組合，PoRV的基因型詳細分布見表3。

表3 豬場PoRV感染基因型的分布

3 討論

本研究通過對2021—2022年貴州、云南、江西、湖南、廣西和廣東6個省共86個規(guī)?；i場的6 472份仔豬腹瀉糞便樣本進行了腹瀉相關(guān)病毒檢測，PoRV、PEDV和PDCoV陽性率分別為27.89%、11.80%和2.92%，豬場陽性率分別為65.12%、11.63%和4.65%；PoRV和PEDV的混合感染率為4.57%，PoRV和PDCoV的混合感染率為0.32%。本研究結(jié)果表明PoRV在不用地區(qū)豬場中感染嚴(yán)重且分布廣泛，有必要繼續(xù)加強對不同豬場PoRV的監(jiān)測，為PoRV感染的防控提供了重要的科學(xué)依據(jù)。

VP7和VP4分別決定輪狀病毒的G型和P型，且G型與P型之間會產(chǎn)生不同的組合，不同組合型的輪狀病毒毒株誘導(dǎo)的交叉保護性低[3，5]。目前PoRV在全球范圍內(nèi)廣泛流行，基因型多樣，加強對PoRV不同G/P基因型的監(jiān)測和研究，對了解PoRV的遺傳進化和疫苗研究非常重要。在本研究中，G9和G5為流行G基因型，分別占分型毒株的42.11%和26.32%；P[13]、P[7]和P[23]為流行P基因型，分別占分型毒株的57.14%、20%和14.29%，其中P[13]型PoRV最具多樣性和復(fù)雜性；優(yōu)勢G/P組合基因型為G9P[13]，占分型樣本的28.57%。其中廣東和云南的組合基因型最為復(fù)雜，存在6種不同的基因型組合，推測原因可能是廣東和云南豬場PoRV感染率升高的同時，PoRV流行基因型之間重組頻率也在逐漸增高，后期應(yīng)加強對廣東、云南地區(qū)豬群PoRV分子流行病學(xué)的監(jiān)測，重視對豬群輪狀病毒的防控與管理。本研究還在云南地區(qū)檢測出了G11P[7]，該組合基因型首次在國內(nèi)出現(xiàn)。周群等[11]對2017—2019年四川省豬A群輪狀病毒分子流行病學(xué)進行調(diào)查，揭示G9型和P[13]型為分別為優(yōu)勢G基因型和P基因型，G9P[23]為優(yōu)勢組合基因型。本研究結(jié)果也表明G9和P[13]型為主要的基因型，與周群等[11]的監(jiān)測結(jié)果一致，但優(yōu)勢組合基因型為G9P[13]，與2017—2019年四川地區(qū)優(yōu)勢基因型不同。

豬輪狀病毒流行率不斷增加，遺傳多樣性越來越復(fù)雜。因此，分子流行病學(xué)方面的研究應(yīng)該不斷更新，有助于更好地了解PoRV的流行病學(xué)特征，對PoRV感染的防控具有重大指導(dǎo)意義，也為新型疫苗候選株的篩選提供了參考。