水貂病毒性腸炎桿狀病毒載體滅活疫苗與水貂犬瘟熱活疫苗混合免疫效果評(píng)價(jià)

吳洪超，霍寧寧，丁航天，曹玉姣，陳亞磊，陳云豫，王璐璐，劉玉秀*，田克恭1，*

(1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450000；2. 國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽(yáng) 471003；3. 洛陽(yáng)惠中生物技術(shù)有限公司，河南 洛陽(yáng) 471003；4. 普萊柯生物工程股份有限公司，河南 洛陽(yáng) 471003)

犬瘟熱是由副黏病毒科麻疹病毒屬的犬瘟熱病毒(canine distemper virus，CDV)引起的急性、高度接觸性傳染病[1]。水貂、狐貍、貉等毛皮經(jīng)濟(jì)動(dòng)物和犬對(duì)該病毒易感，本病已廣泛存在于包括我國(guó)在內(nèi)的所有毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖國(guó)家，對(duì)毛皮經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)威脅極大[2]?；疾∷醣憩F(xiàn)為呼吸道、消化道癥狀，還伴隨鼻鏡干燥、足墊增厚、皮屑等癥狀。水貂病毒性腸炎是由水貂腸炎病毒(mink enteritis virus，MEV)感染引起的高度接觸性傳染病，發(fā)病水貂主要表現(xiàn)為精神不振、食欲減退、腹瀉、嘔吐等[3-4]，該病具有較高的發(fā)病率和死亡率[5]。

水貂犬瘟熱和水貂病毒性腸炎是對(duì)水貂危害最大的兩種傳染病[6]，臨床上常以接種疫苗作為主要防控措施，對(duì)于水貂犬瘟熱活疫苗和水貂病毒性腸炎疫苗的免疫，已被列入養(yǎng)殖場(chǎng)的常規(guī)免疫計(jì)劃[7]。臨床上常采用不同時(shí)間接種以上兩種疫苗，或者在同一時(shí)間、不同部位接種疫苗，并且具有良好的免疫效果[8]，但是頻繁抓取或者多次注射，給水貂群造成多次應(yīng)激，導(dǎo)致死淘率增加，同時(shí)也增加了人工成本。然而水貂病毒性腸炎滅活疫苗與水貂犬瘟熱活疫苗混合后同時(shí)免疫，是否出現(xiàn)相互干擾而影響免疫效果，還需比較研究。

為了減少水貂群的應(yīng)激次數(shù)，節(jié)省人工，同時(shí)使疫苗更加符合臨床實(shí)際應(yīng)用，本研究用水貂病毒性腸炎桿狀病毒載體滅活疫苗(簡(jiǎn)稱MEV亞單位疫苗)稀釋水貂犬瘟熱活疫苗(簡(jiǎn)稱CDV活疫苗)，稀釋后室溫靜置不同時(shí)間測(cè)定CDV含量，以及對(duì)水貂免疫，綜合評(píng)價(jià)混合免疫的效果，為這兩種病原的疫苗免疫程序優(yōu)化提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

MEV JL株、CDV HL001株、CDV單克隆抗體、MEV單克隆抗體、Vero細(xì)胞，均由普萊柯生物工程股份有限公司保存；MEV亞單位疫苗和CDV活疫苗，均由洛陽(yáng)惠中生物技術(shù)有限公司制備；CDV膠體金檢測(cè)試紙條購(gòu)自洛陽(yáng)普泰生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；新生牛血清購(gòu)自PAN公司；RT-PCR和PCR相關(guān)試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG購(gòu)自Sigma公司。

4～5月齡健康水貂，均購(gòu)自洛陽(yáng)市周邊水貂養(yǎng)殖場(chǎng)。未接種水貂犬瘟熱疫苗和水貂病毒性腸炎疫苗，采集眼鼻拭子和肛拭子經(jīng)RT-PCR/PCR檢測(cè)，CDV和MEV核酸均為陰性，免疫前采血分離血清，采用血清中和試驗(yàn)測(cè)定CDV抗體為陰性，采用血凝抑制試驗(yàn)測(cè)定MEV抗體為陰性。

1.2 方法

1.2.1 不同稀釋液稀釋CDV活疫苗后病毒含量測(cè)定

將MEV亞單位疫苗充分搖勻，用注射器抽取10 mL注入CDV活疫苗瓶中完全溶解，輕輕混勻。將充分混勻的混合疫苗在室溫(25 ℃)靜置0、2 h分別取樣測(cè)定CDV含量。同時(shí)取CDV活疫苗用稀釋液按同樣方法稀釋，稀釋后的CDV活疫苗在室溫(25 ℃)靜置0、2 h分別取樣，用DMEM培養(yǎng)液做10倍系列稀釋，取10-2、10-3、10-4、10-54個(gè)稀釋度，與Vero細(xì)胞同步接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)稀釋度接種6孔，0.1 mL/孔，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照6孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 d，用冷丙酮固定細(xì)胞，以CDV單克隆抗體為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗鼠IgG為二抗，置熒光顯微鏡下觀察每個(gè)稀釋度出現(xiàn)特異性熒光染色的細(xì)胞孔數(shù)。按Reed-Muench法計(jì)算半數(shù)熒光抗體感染劑量(50% Fluorescent antibody infectious dose，F(xiàn)AID50)。

1.2.2 動(dòng)物分組及免疫

將30只健康水貂，隨機(jī)分為6組，每組5只，分組及免疫試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 動(dòng)物分組及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3 CDV免疫效力評(píng)價(jià)

第1、3、5組水貂，分別在免疫前和免疫后21 d采血，分離血清，按《中國(guó)獸藥典》附注方法測(cè)定CDV中和抗體效價(jià)。免疫后21 d用CDV強(qiáng)毒攻毒，每只滴鼻2 mL、腹腔注射4 mL(105.5FAID50/mL)，攻毒后觀察21 d，每日觀察水貂的臨床表現(xiàn)，包括精神狀態(tài)、食欲、糞便、眼鼻分泌物、鼻鏡、足墊等，攻毒后7～14 d采集眼鼻拭子，用CDV膠體金試紙條檢測(cè)排毒情況。攻毒對(duì)照水貂眼鼻拭子檢測(cè)為CDV陽(yáng)性，且出現(xiàn)精神不振、食欲減退、排稀便或粘便，眼鼻分泌物，鼻鏡干燥或足墊增厚時(shí)，判為發(fā)?。幻庖咚跹郾鞘米訖z測(cè)為CDV陰性，且不出現(xiàn)以上任意臨床表現(xiàn)時(shí)，判為保護(hù)。

攻毒后21 d處死水貂，采集肺臟，經(jīng)10%福爾馬林固定，制備切片，HE染色后顯微鏡下觀察肺臟病理變化，另取制備的切片進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，切片用馬血清封閉后，滴加CDV單克隆抗體，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌后滴加HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌后滴加AEC顯色液顯色，用蘇木精復(fù)染后封片，普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.4 MEV免疫效力評(píng)價(jià)

第2、4、6組水貂，分別在免疫前和免疫后14 d采血，分離血清，按參照文獻(xiàn)[9-10]，并適當(dāng)改進(jìn)來(lái)測(cè)定MEV血凝抑制(HI)效價(jià)。免疫后14 d用MEV強(qiáng)毒攻毒，每只灌胃感染水貂腸炎病毒JL株病毒液15 mL(106.5FAID50/mL)。攻毒后連續(xù)觀察14 d，并記錄水貂的臨床表現(xiàn)，包括精神狀態(tài)、食欲、糞便等。同時(shí)在攻毒前和攻毒后3～7 d采集糞便，測(cè)定糞便中MEV的血凝(HA)效價(jià)。攻毒對(duì)照水貂出現(xiàn)精神不振、食欲減退，排稀便、黏便、血便等腸炎癥狀，糞便中病毒HA效價(jià)不低于1∶128時(shí)，判為發(fā)??；免疫水貂不出現(xiàn)以上任意表現(xiàn)時(shí)，判為保護(hù)。

攻毒后14 d處死水貂，采集小腸，經(jīng)10%福爾馬林固定，制備切片，HE染色后顯微鏡下觀察小腸病理變化，另取制備的切片進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，切片用馬血清封閉后，滴加MEV單克隆抗體，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌后滴加HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌后滴加AEC顯色液顯色，用蘇木精復(fù)染后封片，普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

取采集的糞便樣品作為待檢樣品進(jìn)行血凝試驗(yàn)。在微量血凝反應(yīng)板的1～12孔各加入PBS(0.015 mol/L，pH值6.5)25 μL，取待檢樣品25 μL加入第1孔，混勻，從第1孔吸取混合液25 μL加入第2孔，混勻后吸取25 μL到第3孔，依次2倍系列稀釋至第11孔，棄去25 μL，第12孔為紅細(xì)胞對(duì)照；吸取1%豬紅細(xì)胞懸液加入各孔，每孔25 μL；輕輕振蕩混勻，2～8 ℃作用90 min后觀察結(jié)果；在紅細(xì)胞對(duì)照成立(紅細(xì)胞完全不凝集)的條件下，以使紅細(xì)胞100%凝集的樣品最高稀釋倍數(shù)作為待檢樣品的HA效價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CDV含量測(cè)定

經(jīng)不同稀釋液稀釋的混合疫苗和CDV活疫苗，在室溫(25 ℃)放置0、2 h取樣測(cè)定CDV含量。結(jié)果顯示，復(fù)溶后的混合疫苗和CDV活疫苗放置2 h內(nèi)，CDV含量無(wú)明顯下降，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 CDV含量測(cè)定結(jié)果 FAID50/mL

2.2 CDV免疫效力評(píng)價(jià)

CDV中和抗體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1發(fā)現(xiàn)免疫后21 d，G1和G3組的CDV中和抗體效價(jià)達(dá)到1∶64.6～1∶128.8。表明MEV亞單位疫苗稀釋CDV活疫苗而成的混合疫苗和CDV活疫苗免疫后，均能刺激水貂產(chǎn)生良好的CDV中和抗體。

圖1 水貂血清CDV中和抗體檢測(cè)結(jié)果

免疫后21 d進(jìn)行CDV攻毒，結(jié)果顯示，混合疫苗和CDV活疫苗單獨(dú)免疫組的保護(hù)率均為100%，結(jié)果見(jiàn)表3和圖2。HE染色顯示，G1和G3組水貂的肺臟均未見(jiàn)明顯病理變化，見(jiàn)圖3A、B，對(duì)照組水貂肺臟可見(jiàn)肺泡隔增厚，上皮細(xì)胞增生，大量巨噬細(xì)胞小灶性浸潤(rùn)，見(jiàn)圖3C箭頭所示。免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，G1和G3組水貂的肺臟均為CDV陰性，見(jiàn)圖3D、E，對(duì)照水貂的肺臟為CDV陽(yáng)性，見(jiàn)圖3F。表明MEV亞單位疫苗稀釋CDV活疫苗后，不影響CDV疫苗的免疫效力。

A. G1組水貂未見(jiàn)異常；B. G3組水貂未見(jiàn)異常；C. G5組水貂眼睛黏性分泌物、鼻鏡干燥。

A～C. G1、G3、G5組肺臟HE染色；D～F. G1、G3、G5組肺臟免疫組化檢測(cè)。箭頭表示肺臟病理變化及免疫組化陽(yáng)性處。

表3 CDV免疫效力評(píng)價(jià)結(jié)果

2.3 MEV免疫效力評(píng)價(jià)

MEV HI抗體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4，發(fā)現(xiàn)免疫后14 d，G2和G4組的MEV HI抗體效價(jià)達(dá)到1∶128～1∶1 024。表明MEV亞單位疫苗稀釋CDV活疫苗而成的混合疫苗和MEV亞單位疫苗免疫后，均能刺激水貂產(chǎn)生良好的MEV HI抗體。

圖4 水貂血清MEV HI抗體檢測(cè)結(jié)果

免疫后14 d進(jìn)行MEV攻毒，結(jié)果顯示，混合疫苗和MEV亞單位疫苗免疫水貂的保護(hù)率均為100%，結(jié)果見(jiàn)表4、表5和圖5。HE染色顯示，G2和G4組水貂的空腸均未見(jiàn)明顯病理變化，見(jiàn)圖6A、B，對(duì)照組水貂的空腸可見(jiàn)黏膜上皮細(xì)胞腫脹變性、脫落，見(jiàn)圖6C。免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，G2和G4組水貂的空腸均為MEV陰性，見(jiàn)圖6D、E，對(duì)照水貂的空腸為MEV陽(yáng)性，見(jiàn)圖6F。表明MEV亞單位疫苗稀釋CDV活疫苗后，不影響MEV疫苗的免疫效力。

A、B. G2、G4組水貂糞便未見(jiàn)異常；C、D. G6組水貂排稀便、黏便。

A～C. G2、G4、G6組空腸HE染色；D～F. G2、G4、G6組空腸免疫組化檢測(cè)。箭頭表示空腸病理變化及免疫組化陽(yáng)性處。

表4 MEV免疫效力評(píng)價(jià)結(jié)果

表5 攻毒前后水貂糞便中水貂腸炎病毒HA效價(jià)測(cè)定結(jié)果

3 討論

CDV和MEV是危害水貂養(yǎng)殖業(yè)的兩大病原，給水貂養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大損失[11-15]，主要采用接種疫苗進(jìn)行預(yù)防，目前臨床上已經(jīng)將CDV疫苗、MEV疫苗納入養(yǎng)殖場(chǎng)的常規(guī)免疫程序中。早期免疫程序中，將兩種疫苗在不同時(shí)間接種，或者在同一時(shí)間、不同部位注射，從而達(dá)到防疾病的目的，但是該免疫程序仍有優(yōu)化的空間。

為了減少水貂群的免疫應(yīng)激次數(shù)，降低防疫成本，優(yōu)化水貂群免疫程序，本研究使用MEV亞單位疫苗稀釋CDV活疫苗，混合后在室溫靜置2 h檢測(cè)CDV含量無(wú)明顯下降，為臨床上混合疫苗的使用提供時(shí)間保證。羅國(guó)良等[16]研究顯示水貂細(xì)小病毒性腸炎滅活疫苗稀釋犬瘟熱活疫苗，在25 ℃條件下存放5 h內(nèi)對(duì)CDV含量無(wú)明顯影響，與本文的研究結(jié)果相近。臨床實(shí)際情況下，犬瘟熱活疫苗復(fù)溶后2 h內(nèi)即可用完，本文未檢測(cè)兩種疫苗混合后室溫保存2 h或更長(zhǎng)時(shí)間的CDV含量，但是兩種疫苗混合后2 h內(nèi)CDV含量無(wú)明顯下降，可以滿足臨床使用。

為了評(píng)價(jià)MEV亞單位疫苗和CDV活疫苗混合免疫的效果，本研究篩選CDV抗原、MEV抗原、CDV抗體、MEV抗體均為陰性的健康水貂，進(jìn)行混合疫苗的免疫效果評(píng)價(jià)。CDV和MEV的免疫效力，均采用血清學(xué)方法和免疫攻毒方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果混合使用的效果與MEV亞單位疫苗單獨(dú)使用、CDV活疫苗單獨(dú)使用的效果相當(dāng)，均能誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的抗體效價(jià)。CDV攻毒后免疫水貂未出現(xiàn)犬瘟熱的臨床表現(xiàn)，眼鼻拭子中未檢測(cè)到CDV抗原，剖檢后肺臟未見(jiàn)明顯病理變化，免疫組化檢測(cè)為CDV抗原陰性；MEV攻毒后免疫水貂未出現(xiàn)病毒性腸炎的臨床表現(xiàn)，糞便樣品對(duì)豬紅細(xì)胞的凝集效價(jià)遠(yuǎn)低于對(duì)照組，剖檢后空腸未見(jiàn)明顯病理變化，免疫組化檢測(cè)為MEV陰性，表明混合免疫后可產(chǎn)生對(duì)CDV、MEV良好的保護(hù)效果。

綜上，MEV亞單位疫苗稀釋CDV活疫苗，混合免疫后各組的免疫效力均不受影響，從而為此兩種疫苗的聯(lián)合使用提供試驗(yàn)依據(jù)，為其推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。