吳冰，季霖，徐雅雯，唐泰山，楊龍圣，何召慶，范紅結(jié)，藺輝星*

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2. 南京海關(guān)動植物與食品檢測中心，江蘇 南京 210019；3. 兆豐華生物科技(南京)有限公司，江蘇 南京 211102)

豬流行性腹瀉(PED)是一種急性腸道傳染病，主要表現(xiàn)為急性水樣腹瀉、嘔吐和死亡，對新生仔豬的致死率較高[1-3]。其病原豬流行性腹瀉病毒(PEDV)是單股正鏈RNA病毒，屬于套式病毒目冠狀病毒科α冠狀病毒屬[4]。病毒屬胞內(nèi)寄生物，依靠宿主細(xì)胞代謝來完成其復(fù)制。病毒感染可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞代謝途徑發(fā)生顯著的變化，主要包括中心碳代謝、脂肪酸合成和谷氨酰胺分解代謝等[5]。盡管病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞代謝變化在某種程度上存在相似之處，但每種病毒可能需要其獨(dú)特的代謝變化才能完成其生命周期[5]。例如，甲型流感病毒H1N1、登革熱病毒(DENV)、諾如病毒(NV)和卡波西肉瘤皰疹病毒(KSHV)主要誘導(dǎo)糖酵解變化[6-9]；而丙型肝炎病毒(HCV)和痘苗病毒(VACV)主要激活谷氨酰胺分解代謝變化[8，10]。據(jù)報(bào)道，某些冠狀病毒如新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)可通過增強(qiáng)宿主細(xì)胞的糖酵解來促進(jìn)自身復(fù)制[11-12]，但PEDV感染對細(xì)胞代謝的影響則報(bào)道較少。本研究擬檢測PEDV感染對細(xì)胞糖酵解的影響，并驗(yàn)證糖酵解變化對PEDV復(fù)制的影響，研究結(jié)果將有助于闡明PEDV的感染機(jī)制，并為冠狀病毒病的綜合防控提供參考。

A. HK2基因轉(zhuǎn)錄水平；B. HK2蛋白表達(dá)水平；Mock為未感染IPEC-J2細(xì)胞樣品；* P<0.05，** P<0.01，下同。

A.PEDV N基因轉(zhuǎn)錄水平；B.PEDV N蛋白表達(dá)水平；Control為PEDV感染IPEC-J2細(xì)胞36 h后收取的細(xì)胞樣品；***P<0.001。

1 材料與方法

1.1 材料

豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-J2和PEDV流行毒株YC2014[13](GenBank：KU252649.1)均由本實(shí)驗(yàn)室保存。PEDV N蛋白單克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存，糖酵解抑制劑2-脫氧-D-葡萄糖(2-DG)購自美國MCE公司，DMEM/F-12培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Gibco公司，RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑PMSF購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，己糖激酶2(HK2)抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司，鼠抗β-actin單克隆抗體購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 PEDV感染后細(xì)胞糖酵解的變化

1.2.1 病毒的細(xì)胞感染

IPEC-J2細(xì)胞在12孔板中培養(yǎng)約24 h長成單層細(xì)胞，以感染復(fù)數(shù)(MOI)為1將PEDV YC2014毒株感染細(xì)胞，孵育1 h后棄去病毒液并加入維持液。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)

PEDV感染IPEC-J2細(xì)胞后36 h將細(xì)胞板置于超低溫冰箱，反復(fù)凍融3次，收取細(xì)胞裂解液。用TRIzol法提取細(xì)胞裂解液總RNA，然后用試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。將cDNA稀釋至合適濃度后作為模板，qPCR檢測糖酵解關(guān)鍵酶HK2基因的mRNA量，以β-actin為內(nèi)參基因。qPCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)。qPCR所用引物見表1。

表1 引物信息

1.2.3 Western blot分析

PEDV感染IPEC-J2細(xì)胞后36 h，細(xì)胞用PBS清洗3次，每孔加入100 μL蛋白裂解液，冰上作用15 min充分裂解細(xì)胞。將細(xì)胞樣品刮下并收集到1.5 mL離心管中，在4 ℃ 12 000 r/min 離心后吸取上清液，使用BCA法測定蛋白濃度。蛋白經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印至PVDF膜。轉(zhuǎn)印后，用5%脫脂乳封閉2 h，PBST清洗3次。將PVDF膜分別置于脫脂乳稀釋的PEDV N抗體、HK2抗體中4 ℃過夜進(jìn)行孵育。然后PBST清洗3次，將PVDF膜分別置于羊抗鼠IgG-HRP或羊抗兔IgG-HRP中，室溫孵育1 h，PBST清洗3次后加入ECL顯色液，用化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行拍照。

1.3 糖酵解抑制劑對病毒復(fù)制的影響

為了研究糖酵解對PEDV復(fù)制的影響，本試驗(yàn)檢測了糖酵解抑制劑2-DG對PEDV復(fù)制的影響。IPEC-J2細(xì)胞在12孔板中培養(yǎng)24 h，加入含有10 μmol/L 2-DG的培養(yǎng)基，預(yù)處理2 h后棄去培養(yǎng)基，以MOI為1將PEDV YC2014毒株感染細(xì)胞，孵育1 h后棄去病毒液，然后加入含有10 μmol/L 2-DG的維持液。在感染后36 h收取樣品，通過qPCR以及Western blot檢測病毒復(fù)制的變化。

1.4 不同葡萄糖濃度對病毒復(fù)制的影響

為探究葡萄糖濃度適度升高是否有利于PEDV的復(fù)制，本試驗(yàn)檢測了正常濃度(5.5 mmol/L)和高濃度(11.1 mmol/L和22.2 mmol/L)葡萄糖條件下PEDV復(fù)制的情況。IPEC-J2細(xì)胞在12孔板中培養(yǎng)24 h，以MOI為1將PEDV YC2014毒株感染細(xì)胞，孵育1 h后棄去病毒液并加入含有正常濃度和高濃度葡萄糖的維持液進(jìn)行培養(yǎng)。于感染后36 h收取樣品，通過qPCR以及Western blot檢測病毒復(fù)制變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

使用GraphPad Prism 8.0分析所有數(shù)據(jù)。組間的差異如下所示：P<0.05表示差異顯著，P<0.01和P<0.001表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 PEDV感染增強(qiáng)IPEC-J2細(xì)胞糖酵解

實(shí)驗(yàn)室前期的非靶向代謝組學(xué)數(shù)據(jù)顯示，與對照組IPEC-J2細(xì)胞樣品相比，PEDV感染的IPEC-J2細(xì)胞中糖酵解產(chǎn)物乳酸的含量顯著增加，并且通過乳酸含量檢測試劑盒驗(yàn)證了該結(jié)果。為了確定PEDV感染后IPEC-J2細(xì)胞中糖酵解的變化，收取PEDV感染后36 h的IPEC-J2細(xì)胞樣品，通過qPCR檢測了HK2的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果如圖1A顯示，與對照組IPEC-J2細(xì)胞樣品相比，PEDV感染顯著增強(qiáng)了HK2的轉(zhuǎn)錄(P<0.05)。通過Western blot分析PEDV感染組和對照組的糖酵解限速酶HK2的表達(dá)，結(jié)果如圖1B所示，與對照組IPEC-J2細(xì)胞樣品相比，PEDV感染顯著增加HK2的表達(dá)(P<0.01)，表明PEDV感染增強(qiáng)了IPEC-J2細(xì)胞的糖酵解。

2.2 糖酵解抑制劑對PEDV復(fù)制的影響

本研究進(jìn)一步檢測了使用糖酵解抑制劑來抑制糖酵解是否會對PEDV的復(fù)制產(chǎn)生影響。己糖激酶是糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，2-DG是一種葡萄糖類似物，可競爭性抑制己糖激酶以抑制糖酵解。使用qPCR檢測對照組與2-DG處理組PEDV N基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果如圖2A所示，與對照組PEDV感染的IPEC-J2細(xì)胞相比，2-DG處理顯著抑制了PEDV N基因的轉(zhuǎn)錄(P<0.001)。使用Western blot檢測對照組和2-DG處理組的PEDV N蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如圖2B所示，與對照組PEDV感染的IPEC-J2細(xì)胞相比，2-DG處理顯著降低了PEDV N蛋白的表達(dá)水平(P<0.01)，即PEDV復(fù)制受到了抑制。上述結(jié)果表明，糖酵解是PEDV復(fù)制過程中所需的關(guān)鍵代謝途徑之一。

2.3 不同葡萄糖濃度對PEDV復(fù)制的影響

由于前期研究發(fā)現(xiàn)PEDV感染會導(dǎo)致培養(yǎng)基中葡萄糖消耗增加，本試驗(yàn)探究了在細(xì)胞維持液中適度增加葡萄糖濃度是否可促進(jìn)PEDV的復(fù)制。在病毒感染后使用含有正常濃度(5.5 mmol/L)和高濃度(11.1 mmol/L和22.2 mmol/L)葡萄糖的維持液進(jìn)行培養(yǎng)，36 h后提取細(xì)胞蛋白進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果如圖3所示，高濃度葡萄糖條件下病毒復(fù)制顯著增加。

圖3 不同葡萄糖濃度對PEDV復(fù)制的影響

3 討論

病毒需要依賴細(xì)胞代謝來為病毒復(fù)制提供能量和生物大分子。許多病毒可增強(qiáng)細(xì)胞糖酵解，如人巨細(xì)胞病毒(HCMV)和SARS-CoV-2感染可激活細(xì)胞糖酵解，而抑制細(xì)胞糖酵解可抑制HCMV和SARS-CoV-2的復(fù)制[11，14-16]。糖酵解可促進(jìn)細(xì)胞脂質(zhì)的生物合成，從而促進(jìn)病毒的復(fù)制[17]。DENV感染可激活糖酵解促進(jìn)脂質(zhì)的生物合成[18]。HCMV通過糖酵解為脂肪酸合酶(FAS)的生物合成提供原料[19-20]。本實(shí)驗(yàn)室在前期的代謝組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，PEDV感染IPEC-J2細(xì)胞后36 h，細(xì)胞中乳酸的量顯著升高。由于乳酸是細(xì)胞糖酵解的產(chǎn)物，乳酸濃度的升高可反映細(xì)胞糖酵解的增強(qiáng)。HK2是糖酵解過程中的第一個(gè)限速酶，是糖酵解的關(guān)鍵代謝酶之一[21-22]。本研究結(jié)果表明，PEDV感染導(dǎo)致HK2表達(dá)水平的升高，而抑制細(xì)胞糖酵解后，PEDV的復(fù)制也受到了抑制?？梢姡m度抑制細(xì)胞糖酵解有利于防控PEDV感染。

病毒感染對細(xì)胞糖酵解的調(diào)控機(jī)制各不相同。腺病毒通過其E4ORF1蛋白與上皮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子Myc結(jié)合，激活糖酵解相關(guān)基因，使糖酵解相關(guān)酶的表達(dá)量升高，最終使糖酵解增強(qiáng)[23]。甲病毒可通過其非結(jié)構(gòu)蛋白3(Nsp3)中的YXXM基序激活PI3K/AKT信號通路，從而增強(qiáng)細(xì)胞糖酵解[24]。SARS-CoV-2的非結(jié)構(gòu)蛋白6(Nsp6)與宿主細(xì)胞中的MGA/MAX復(fù)合物相互作用從而介導(dǎo)糖酵解的增強(qiáng)[25]。PEDV感染通過何種途徑來增強(qiáng)宿主細(xì)胞的糖酵解有待進(jìn)一步研究。