羽衣甘藍類受體激酶FERONIA基因克隆、表達及與相互作用蛋白分析

荀寶茹 秦洪濤 馬 蕊 郭楠楓 劉運平 吳 瑩 藍興國

（東北鹽堿植被恢復與重建教育部重點實驗室，東北林業(yè)大學，哈爾濱 150040）

在開花植物中，柱頭能特異地識別本物種的花粉而拒絕其他遠源花粉和真菌孢子等的萌發(fā)，這一過程極為復雜，花粉和柱頭的精準識別決定授粉事件的成功完成［1-2］。柱頭作為雌蕊授粉的受感面，當花粉落到柱頭后，會迅速啟動一條基本反應途徑，花粉經(jīng)過黏附、水合、萌發(fā)最終生長出花粉管，穿過花柱，進入子房，一直到達胚珠并完成受精，此過程受到多種關鍵分子調控［3-5］。自然界中，許多開花植物進化出一種自交不親和性遺傳機制，排斥自身花粉，接受異花花粉，以避免近親繁殖，促進雜種優(yōu)勢［6-8］。在十字花科（Brassicaceae）中，自交不親和性（SI）遺傳機制受S位點控制［9］，雄性S位點決定因子為SP11/SCR，雌性S位點 決 定因子為SRK［10］。SP11/SCR 和SRK 之間相互作用能夠誘導SRK 自磷酸化，觸發(fā)下游信號級聯(lián)反應，導致自身花粉被排斥［11］。M-位點蛋白激酶MLPK 和具有E3泛素連接酶活性的臂重復蛋白ARC1 已 被 鑒 定 為SRK 直 接 下 游 效 應 因 子［12-14］。SRK 磷酸化后激活下游效應因子ARC1，使其泛素化 進 而 降 解 親 和 因 子Exo70A1［15］、GLO1［16］和PLD1［17］，導致SI反應。

一些類受體激酶RLKs 在雌雄相互作用中已被鑒定，具有感知信號分子的功能［18-19］。FERONIA（FER）屬于類受體激酶CrRLKL1家族，在植物生長、發(fā)育、激素信號轉導、生物和非生物脅迫等多種生物過程發(fā)揮著重要調控作用［20-25］。FER 的功能缺失會導致雄性不育、根毛、下胚軸、葉片、種皮等細胞伸長、根系發(fā)育及對病原菌應答等缺陷［26-31］。FER-Rac/Rop 信號能夠調控NADPH 氧化酶產(chǎn)生活性氧（ROS），導致結球白菜（Brassica rapa）SI 反應［6］。類受體激酶CrRLKL1 家族另一個成員ANJEA（ANJ），也在柱頭中高度表達［28，32］。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中，花粉外被蛋白（PCP-B）和快速堿化因子（RALF23/33）競爭性與ANJ-FER 復合物結合，導致柱頭中ROS下降，促進花粉水合、萌發(fā)［33］。自交不親和花粉或種間花粉與柱頭SRK 結合，能夠招募FER，激活SI 柱頭中FER 介導的ROS 產(chǎn)生信號轉導途徑，以排斥不親和花粉［6，26，34-36］，SRK 和FER 整合了種內(nèi)和種間生殖屏障的潛在機制，可為十字花科作物遠緣育種提供可行性途徑［37］。

目前FER 在羽衣甘藍（Brassica oleraceavar.acephala）授粉早期事件及其潛在靶向效應因子等方面研究非常少。本研究從羽衣甘藍柱頭中成功克隆得到BoFER基因，對其氨基酸序列、組織特異性和授粉后不同時間的表達模式進行分析，并鑒定其與已報道的SI 因子互作關系，以期進一步了解BoFER 可能發(fā)揮的功能，為深入解析BoFER 在生殖發(fā)育過程中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

羽衣甘藍自交不親和系（S13-bS13-b）與親和系（S45S45）種植于東北林業(yè)大學花卉生物工程研究所（45°72′53″N，126°62′92″E）。分別用來自S45S45株系和自身（S13-bS13-b）的花粉對去雄后的S13-bS13-b株系成熟柱頭進行親和及不親和授粉，收集親和及不親和授粉后0、30、60 min的雌蕊，同時采集S13-bS13-b株系萼片、花瓣、柱頭、花柱及子房等樣本，隨后用液氮立即冷凍樣本，于冰箱中-80 ℃存儲。

1.2 羽衣甘藍BoFER基因克隆

根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫提供的甘藍基因組序列，設計BoFER基因的CDS 序列特異性引物BoFERCDS-F 和BoFER-CDS-R，用于BoFER基因CDS 區(qū)的克隆。在BoFER 激酶結構域（KD）序列兩端設計特異性引物BoFER-KD-F 和BoFER-KD-R，用于BoFER 激酶域的克隆，引物均由華大基因合成（見表1）。通過E.Z.N.A.? Plant RNA Kit（OMEGA）試劑盒提取S13-bS13-b柱頭總RNA，利用TranScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super-Mix（TransGen）試劑盒獲得柱頭cDNA。參考李陽等［38］的方法進行載體構建，利用LATaqDNA 聚合酶（TaKaRa）克隆基因，使用E.Z.N.A.?Gel Extraction Kit（OMEGA）試劑盒回收PCR 擴增產(chǎn)物，并將回收產(chǎn)物連接到pMD19-T 載體連接，熱激法轉化到大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α中，涂于相應抗性平板上，挑取單克隆，進行菌液PCR，符合目的片段大小的菌液送至華大基因進行測序，利用TIANprep Mini Plasmid Kit（TIANGEN）試劑盒提取測序結果正確的菌液質粒。

表1 引物信息Table 1 Primer sequences information

1.3 BoFER的生物信息學分析

參照栗赫銘等［39］提供的生物信息學方法，通過ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）預測蛋白分子量及理論等電點等。使用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）進 行 結 構 域 分析。通過NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行氨基酸序列分析。

1.4 qRT-PCR表達分析

利用E.Z.N.A.? Plant RNA Kit（OMEGA）試劑盒提取親和及不親和授粉后不同時間雌蕊，以及S13-bS13-b株系雄蕊、花萼、花瓣、柱頭、花柱及子房總RNA，使用TranScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（TransGen）合成cDNA。參照李晗等［40］的方法進行qRT-PCR，使用Trans-Start?Top Green qPCR SuperMix（TRANS）試劑盒配制20 μL 反應體系如下：TransStart Top Green qPCR SuperMix（2X） 10 μL，cDNA 1 μL，BoFER基因上游特異性引物0.4 μL，下游特異性引物0.4 μL（引物序列見表1），ddH2O 8.2 μL，通過LightCyker480Ⅱ（Roche）儀器進行目的基因qRT-PCR 分析，程序設置：94 ℃預變性 30 s，94 ℃變性5 s，58 ℃退火30 s，40 個循環(huán)，每個循環(huán)結束后采集熒光信號，所有循環(huán)結束后繪制熔解曲線。每個樣品進行3 次技術重復。BoACTIN基因作為內(nèi)參基因［41］，通過比值分析方法計算目的基因相對表達量。

1.5 BoFER相互作用蛋白分析

將BoFER-KD 的序列構建到pGADT7（激活域，AD）表達載體上（見表1）。將BoSRK13-b-KD、Bo-MLPK 及Bo-ARC1 的ORF 序 列 構 建 到pGBKT7（DNA 結合域，BD）表達載體上，根據(jù)酵母轉化手冊將重組的AD 和BD 質粒共轉化到酵母菌株Y2HGold 中，共轉化質粒組合（見表2）。將酵母轉化子涂布到SD/-Leu-Trp 缺陷型平板上進行培養(yǎng)2～3 d。挑取單個酵母菌落加入到含5 mL SD/-Leu-Trp 缺陷型液體培養(yǎng)基中，220 r·min-1培養(yǎng)1 d 后，取5 μL 培養(yǎng)液滴加在SD/-Leu-Trp 和SD/-Leu-Trp-His+x-α-gal 缺陷型平板上進行培養(yǎng)。利用含有3-氨基-1，2，4-三唑（3-AT）的SD/-Leu-Trp-His缺陷型平板對自激活試驗進行驗證。

表2 BoFER酵母共轉化質粒組合Table 2 Combination of BoFER yeast co-transformation plasmids

2 結果與分析

2.1 BoFER基因的克隆

以羽衣甘藍S13-bS13-b株系柱頭cDNA 為模板，通過RT-PCR 克隆得到BoFER（見圖1），通過測序結果發(fā)現(xiàn)BoFER大小為2 682 bp，編碼893 個氨基酸（見圖2）。BoFER蛋白分子質量大小為97.25 kDa，等電點為5.89。通過SMART 數(shù)據(jù)庫分析，BoFER蛋白結構域主要由信號肽區(qū)域、Malectin-like 區(qū)域、跨膜螺旋區(qū)域、Ser/Thr激酶結構域及低成分復雜區(qū)組成（見圖3）。從NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索出油菜（Brassica napus）、白菜（B.rapa）、擬南芥的FER 氨基酸序列，與BoFER 進行序列相似度分析發(fā)現(xiàn)，與油菜BnFER 序列相似度達98.5%，與白菜BrFER序列相似度達96.5%，與擬南芥AtFER序列相似度達81.3%，且BoFER 激酶結構域及Ser/Thr 激酶結合位點高度保守（見圖4）。

圖1 羽衣甘藍BoFER的RT-PCR擴增結果Fig.1 Results of RT-PCR amplification product of BoFER

圖2 BoFER核苷酸及氨基酸序列Fig.2 The nucleotide and amino acid sequences of BoFER

2.2 BoFER基因的組織特異性表達分析

對羽衣甘藍S13-bS13-b株系的萼片、花瓣、花藥、柱頭、花柱及子房中的BoFER的表達量進行qRTPCR 分析。結果表明，BoFER在被測組織中均有表達，在柱頭中表達水平最高，顯著高于在其他被測組織中的表達水平，在花藥中表達水平最低（見圖5）。

圖5 BoFER在花器官中表達分析***.P＜0.001.Fig.5 BoFER expression analysis in floral organ

2.3 BoFER 基因在親和及不親和授粉過程中的表達模式分析

對S13-bS13-b株系進行親和及不親和授粉，選取親和及不親和授粉后0、30、60 min 的雌蕊，對BoFER的表達量進行qRT-PCR 分析。結果表明，BoFER在親和及不親和授粉后的各檢測時間點均有表達，在不親和授粉后表達水平逐漸升高，在不親和授粉后60 min 表達水平達到最高（見圖6A），BoFER在親和授粉后表達水平逐漸下降，在親和授粉后60 min表達水平達到最低（見圖6B）。

2.4 BoFER相互作用蛋白鑒定

利用酵母雙雜交分析FER 激酶結構域（BoFER-KD）與十字花科植物中自交不親和相關因子的相互作用，構建酵母表達載體pGADT7-BoFER-KD 與pGBKT7-SRK13-b-KD、pGBKT7-MLPK及pGBKT7-ARC1。將被檢測質粒組合pGADT7-BoFER-KD 與pGBKT7-SRK13-b-KD、pGBKT7-MLPK及pGBKT7-ARC1 分別共轉化至Y2HGold 酵母感受態(tài)細胞中，通過SD/-Trp-Leu 和SD/-Trp-Leu-His+x-α-gal+3mM 3-AT 缺陷型培養(yǎng)基平板中菌落生長狀態(tài)，鑒定目的蛋白間相互作用情況。結果發(fā)現(xiàn)在SD/-Trp-Leu二缺平板上，陽性對照、陰性對照以及共轉化酵母生長良好，在SD/-Trp-Leu-His+x-αgal+3mM 3-AT 缺陷型培養(yǎng)基平板中，陽性對照生長且變藍，陰性對照沒有生長，pGADT7-BoFERKD 與pGBKT7-SRK13-b-KD 的組合生長且變藍，pGADT7-BoFER-KD 與pGBKT7-MLPK 和pGBKT7-ARC1 的組合沒有生長（見圖7）。這些結果表明，BoFER-KD 與BoSRK13-b-KD 存在相互作用，BoFERKD與BoMLPK、BoARC1不存在相互作用。

圖7 BoFER與BoSRK相互作用分析Fig.7 Protein interaction analysis between BoFER and BoSRK

3 討論

本研究從羽衣甘藍自交不親和系（S13-bS13-b）中分離出BoFER基因。其開放閱讀框大小為2 682 bp，編碼含有893 個氨基酸殘基的蛋白質。BoFER 蛋白由信號肽結構域、Malectin-like 結構域、跨膜螺旋結構域、Ser/Thr 激酶結構域及低成分復雜區(qū)組成。對BoFER 氨基酸序列進行比對分析發(fā)現(xiàn)，與油菜BnFER 序列相似度達98.5%，與白菜BrFER序列相似度達96.5%，與擬南芥AtFER序列相似度81.3%，這表明BoFER序列高度保守。

分析羽衣甘藍BoFER的組織表達特性發(fā)現(xiàn)其在萼片、花瓣、花藥、柱頭、花柱及子房組織中均有表達，且在柱頭中的表達量要顯著高于在其他花器官中的表達量，這個結果表明BoFER可能在柱頭中發(fā)揮著重要作用。Duan等［34］發(fā)現(xiàn)擬南芥FER是花粉管穿透柱頭乳突細胞，最終進入配子體完成生殖過程的重要調控因子。本研究進一步對羽衣甘藍BoFER在授粉過程中的表達模式進行研究，結果顯示BoFER在親和及不親和授粉后的各時間點均有表達，在不親和授粉后表達水平逐漸升高，而在親和授粉后其表達水平逐漸下降，表明BoFER可能在羽衣甘藍親和授粉及不親和授粉中發(fā)揮作用。Zhang 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，在白菜中，對BrFER的研究也有類似的表達特性，BrFER的表達水平下降，能夠打破自交不親和反應，促進親和授粉花粉管的生長。說明BoFER可能在授粉中發(fā)揮重要作用。

為了進一步研究BoFER 在自交不親和中的作用，通過酵母雙雜交技術研究了BoFER-KD 與已知自交不親和相關因子的相互作用關系，發(fā)現(xiàn)BoFER-KD 與BoMLPK、BoARC1 不存在相互作用，與BoSRK13-b-KD 存在相互作用，表明BoFER 可能通過與BoSRK13-b的相互作用來參與自交不親和反應。在白菜中也發(fā)現(xiàn)了BrFER1-KD與BrSRK46-KD的相互作用關系，BrSRK 通過招募BrFER，增加柱頭中ROS 含量，排斥自身花粉，也排斥種間花粉［37］。

本研究中對羽衣甘藍BoFER基因進行克隆，序列分析及蛋白結構分析，同時分析了該基因的組織表達特異性和在授粉過程中的表達模式，并通過酵母雙雜交鑒定BoFER 與其他自交不親和相關因子的相互作用。不僅豐富了對蕓薹屬植物BoFER 的認識，而且為進一步探討B(tài)oFER 與BoSRK13-b間的相互作用以及BoFER 的生物學功能奠定了基礎。這將為更好地開發(fā)植物授粉過程所依賴的信號轉導途徑提供線索，為未來作物育種提供重要的分子育種策略。