戴傳函,劉龍飛,李超鵬

0引言

視網膜是中樞神經系統(tǒng)中一種高度活躍的組織,具有較高的氧耗和代謝需求[1],這些營養(yǎng)物質及其代謝產物都通過視網膜血管系統(tǒng)運輸。血管生成是內皮細胞在血管生成誘導劑和抑制劑的引導下增殖和形成新血管的過程,是血管生理性發(fā)育和病理性新生血管形成的關鍵環(huán)節(jié)[2]。血管生成紊亂會破壞氧氣和營養(yǎng)物質的輸送,導致代謝供需失衡,進而干擾神經視網膜功能。在一些視網膜疾病中,如糖尿病視網膜病變、視網膜靜脈阻塞、早產兒視網膜病變等,新生血管的形成加劇了視力的喪失。雖然玻璃體腔注射抗血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)藥物是治療視網膜新生血管的突破性療法,但仍然存在局限性[3],因此迫切需要探索更有效的治療視網膜新生血管的方法。小膠質細胞是視網膜中主要的單核巨噬細胞,被認為是一把雙刃劍,因為其不僅具有免疫保護作用,也有啟動和加強炎癥反應,促進細胞凋亡等功能[4]。多項研究表明,小膠質細胞在視網膜血管生成中扮演著重要角色,針對小膠質細胞的干預措施可能有助于減輕新生血管形成,從而保護患者的視力[5-6]。

1視網膜小膠質細胞概述

1.1視網膜小膠質細胞定植目前認為視網膜小膠質細胞是由卵黃囊祖細胞分化而來。生理狀態(tài)下,小膠質細胞主要定位于視網膜內層,如神經節(jié)細胞層(GCL)、內叢狀層(IPL)和外叢狀層(OPL)。然而,病理條件下,活化的小膠質細胞會遷移到外核層(ONL)、色素上皮層(RPE)和視網膜下間隙[7]。Huang等[8]利用PLX5622抑制集落刺激因子1受體,成功清除了小鼠視網膜中幾乎所有的內源性小膠質細胞,進而發(fā)現(xiàn)了兩種小膠質細胞的再生方式:(1)外生小膠質細胞通過視神經進入視盤,由視網膜中心向視網膜周邊再充盈;(2)來自睫狀體/虹膜的小膠質細胞填充方式與上述方向相反。此外,重新定植的小膠質細胞在形態(tài)和功能方面與內源性小膠質細胞相似,這可能是受到了視網膜組織環(huán)境的影響[9]。

1.2視網膜小膠質細胞分類視網膜中不同的小膠質細胞亞群呈現(xiàn)出不同的特征。靜息狀態(tài)下,分枝狀小膠質細胞監(jiān)測神經元功能狀態(tài)和視網膜內微環(huán)境,并迅速對微環(huán)境變化做出反應。一旦受到炎癥、缺氧或氧化應激等病理刺激,小膠質細胞會改變其表型,呈現(xiàn)出阿米巴樣激活狀態(tài),并能迅速遷移到損傷部位,該過程被稱為小膠質細胞極化[10]。根據其功能差異,小膠質細胞被分為兩種極化狀態(tài),即促炎型(M1型)和抗炎型(M2型)。M1型和M2型小膠質細胞之間的區(qū)別有些模糊,但通常認為,小膠質細胞可被脂多糖或γ-干擾素刺激轉化為M1型,進而分泌腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白細胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、IL-12、IL-23等促炎因子及趨化因子,并高表達NADPH氧化酶(NOX)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、CD40和主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex,MHC)-Ⅱ等。而M2型小膠質細胞通常由IL-4或IL-13誘導產生,并高表達IL-4、IL-10、IL-13和轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)等抗炎因子及Ⅰ型精氨酸酶(Arg-1)、甘露糖受體(CD206)等[11]。在適當時期進行小膠質細胞的M1/M2表型轉換可能對視網膜病變的治療有所幫助。

隨著對生物標志物的探索,越來越多的學者認為視網膜小膠質細胞的分類不應局限于極化狀態(tài)下的M1型或M2型[12]。不同部位、不同亞群的小膠質細胞可能具有不同功能。生理狀態(tài)下,IL-34陽性和陰性的小膠質細胞分別定位于內層和外層視網膜,而在神經元變性時,這兩種小膠質細胞均遷移到RPE[13]。Liu等[14]指出,在病理性視網膜血管生成過程中,表達胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)的小膠質細胞亞群位于新生血管周圍。越來越多的證據表明,不同的小膠質細胞亞群可能存在高度的轉錄、形態(tài)、分布和功能差異,因此對小膠質細胞進行合理的分類就顯得尤為重要。

2小膠質細胞在視網膜血管發(fā)育及生理狀態(tài)下的作用

血管生成是指在血管生成因子和內皮細胞的共同作用下,在現(xiàn)有毛細血管基礎上形成新血管的過程。在VEGF、IGF-1和Notch家族受體及其配體的作用下,血管內皮細胞生長出絲狀偽足并成為尖端細胞,增強了增殖和遷移能力[15]。視網膜血管發(fā)育過程中,小膠質細胞與視網膜血管的數(shù)量呈正相關。小膠質細胞的分支接觸內皮柄細胞和尖端細胞上的絲狀偽足,引導尖端細胞明確新生血管的方向。當使用氯磷酸二鈉脂質體清除小膠質細胞時,會導致視網膜發(fā)育中的血管密度下降,而通過玻璃體腔注射外源性小膠質細胞,則可以改善由于小膠質細胞耗竭引起的血管密度和面積的降低[16],這表明小膠質細胞在鄰近視網膜血管系統(tǒng)中具有不可或缺的作用。生理狀態(tài)下,小膠質細胞通過分支與視網膜血管接觸,分泌營養(yǎng)因子和血管生成因子,并同時控制周細胞和內皮細胞的凋亡,及時清除冗余血管碎片,對維持視網膜血管平衡具有重要意義[17]。

3病理狀態(tài)下小膠質細胞對視網膜血管生成的影響

小膠質細胞參與視網膜病理性新生血管的形成。病理性新生血管與正常視網膜血管最大的不同是缺乏緊密連接,這會導致血管中的血漿滲漏到周圍組織中。若滲漏到玻璃體中,會造成玻璃體降解、視網膜牽拉,甚至導致視網膜脫離,從而對視力造成嚴重損害[18]。Ding等[19]通過使用脂多糖誘導小膠質細胞活化,發(fā)現(xiàn)VEGF-A和血小板衍生因子-BB(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)的表達水平上調,進而促進血管生成?；罨男∧z質細胞輔助新生血管形成并引導其異常定位,從而加速疾病進展。因此,深入研究病理狀態(tài)下小膠質細胞的特征可能成為預防和治療視網膜血管病變的關鍵。

4小膠質細胞在視網膜新生血管中的潛在靶點

目前,視網膜新生血管的主要治療方法包括玻璃體切割手術、視網膜激光光凝及玻璃體腔注射抗VEGF藥物。然而,手術和激光光凝會對視網膜造成損傷,而抗VEGF藥物的療效有限[3],甚至可能抑制正常血管和神經元的生長[20],加速視網膜纖維化[21]。因此,尋找治療視網膜新生血管的新方法顯得至關重要。近年來,研究者對小膠質細胞在視網膜疾病中的作用越來越重視[22-23],下文總結小膠質細胞在視網膜新生血管中的已知靶點。

4.1活化的小膠質細胞通過釋放炎癥因子促進血管生成炎癥是機體對損傷刺激的非特異性反應,可通過多種途徑調節(jié)血管生成。在氧誘導視網膜病變(oxygen-induced retinopathy,OIR)小鼠模型中,異常新生血管的形成與小膠質細胞TNF-α表達的升高相一致,且TNF-α可能是通過誘導血管生成因子如IL-8、VEGF和成纖維細胞生長因子-2(fibroblast growth factor-2,FGF-2)的產生發(fā)揮作用[24-25]。Fas受體屬于TNF受體超家族,小膠質細胞是Fas配體(FasL)的主要來源,其分泌的FasL通過激活血管上的Fas介導血管生成,該過程依賴于Src家族激酶(SFK)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)信號通路[26]。研究發(fā)現(xiàn),抑制miR-30a-5p可以增強小膠質細胞與內皮細胞之間的FasL-Fas聯(lián)系,促進內皮細胞凋亡和清除,減少病理性新生血管,并促進生理性血管生成[27]。FasL-Fas的相互作用已被證明是異常血管生成的重要機制。此外,小膠質細胞中孤兒核受體RORγ的激活導致小膠質細胞分泌IL-17a增加,從而上調鄰近細胞中VEGF的產生并促進新生血管形成[28]。

神經炎癥與血管生成密切相關。然而,炎癥具有兩面性,在炎癥的早期階段,激活的小膠質細胞可以清除受損細胞,維持視網膜的穩(wěn)態(tài),但持續(xù)的慢性炎癥會導致小膠質細胞失去控制,分泌炎癥因子攻擊自身細胞,加劇視網膜血管生成。因此,根據疾病的發(fā)展階段,調控小膠質細胞炎癥因子的生成與釋放,可能對視網膜新生血管起抑制作用。

4.2小膠質細胞通過腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)調節(jié)血管收縮和血管生成腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)是經典的調節(jié)血壓和體液穩(wěn)態(tài)的系統(tǒng)。此外,RAAS還能調節(jié)VEGF的釋放,參與血管生成,影響血管通透性。血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)的常見受體是血管緊張素Ⅰ型受體(AT1R)、Ⅱ型受體(AT2R)和Mas受體(MasR),Ang Ⅱ與不同受體結合會產生不同的功能作用。視網膜小膠質細胞中存在RAAS,當外源性Ang Ⅱ與小膠質細胞表面的AT1R結合時,通過RhoA/Rho激酶通路刺激NOX的激活[29],促進活性氧(ROS)的產生,從而增加血管通透性和新生血管形成[30]。在過表達腎素和Ang Ⅱ的REN-2轉基因大鼠和OIR大鼠模型中,視網膜小膠質細胞密度明顯增加。抑制RAAS則會減少小膠質細胞的活化,進而調節(jié)血管生成。AT1R拮抗劑纈沙坦和鹽皮質激素受體拮抗劑螺內酯可有效抑制體外缺氧條件下小膠質細胞分泌VEGF、CCL5和γ-干擾素[31],在OIR大鼠的體內實驗得出了同樣的結論,即非甾體鹽皮質激素受體拮抗劑非奈利酮可降低小膠質細胞密度、血管滲漏和新生血管形成[32]。因此,我們認為小膠質細胞中的RAAS促進了視網膜的血管生成。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)的非經典途徑包括AT2R、ACE2、Ang1-7和MasR等。其中,血管緊張素轉換酶2(ACE2)能水解Ang Ⅰ和Ang Ⅱ生成Ang1-7,而Ang1-7能與MasR結合。MasR缺陷小鼠的血管生成速度較野生型小鼠慢,并且血管周圍小膠質細胞和尖端細胞絲狀偽足數(shù)量明顯減少。當用MasR激動劑AVE0991處理時,分離的小膠質細胞的IL-10、Notch1、Delta樣配體4(Dll4)和Jagged 1蛋白(Jag1)mRNA表達水平升高,而這些基因介導小膠質細胞與內皮細胞的相互作用[33],表明MasR通路的激活對于視網膜小膠質細胞募集和血管生成至關重要。另有研究表明,非經典途徑可部分拮抗經典腎素-血管緊張素系統(tǒng)的作用[34]。AT2R通過激活蛋白磷酸酶2A(PP2A)阻止蛋白激酶C的活化,以抑制NOX激活、ROS生成及隨后的促炎小膠質細胞激活。同時,其還促進小膠質細胞向抗炎型轉化,其作用可被AT2R激動劑CGP42112A增強及AT2R拮抗劑PD123319減弱[35]。此外,PD123319刺激可導致VEGF表達上調,從而促進內皮細胞的增殖和遷移能力。相反,CGP42112A可以選擇性地抑制VEGF驅動的血管形成[36]。類似地,Ang Ⅱ通過NF-κB誘導G補綴FHA域血管生成因子1(AGGF1)的表達,進而誘導血管的發(fā)育和生成。AT1R拮抗劑氯沙坦可以抑制Ang Ⅱ引起的AGGF1上調,而PD123319則進一步增加了Ang Ⅱ引起的AGGF1上調[37]。上述研究結果表明AT2R可能通過多種信號通路抑制血管的生成。

根據以上研究結果,分析認為RAAS及ACE2/Ang1-7/MasR信號通路會使小膠質細胞轉化為促炎表型,并促進血管生成,而非經典ACE/Ang Ⅱ/AT2R信號通路則與抗炎和抗血管生成有關。

4.3小膠質細胞來源的外泌體具有影響血管生成的能力外泌體的研究有30余年歷史,其是細胞分泌的一種細胞外囊泡,含有與母細胞相關的生物分子,如蛋白質、核酸等,參與調節(jié)重要的生理和病理活動[38]。小膠質細胞來源的外泌體可以影響視網膜血管生成。研究發(fā)現(xiàn),通過將體外培養(yǎng)的BV2小膠質細胞來源的外泌體注射到OIR小鼠的玻璃體腔,可以降低VEGF和TGF-β的表達,并且顯著減少視網膜新生血管簇面積[39]。然而,M1型小膠質細胞來源的外泌體能夠通過IRF1/miR-155-5p/SOCS1軸,促進靜息態(tài)小膠質細胞的活化,并增強其促血管生成能力[40]。因此,不同狀態(tài)下的小膠質細胞來源的外泌體產生的生物學效應截然不同,這可能與外泌體中各組分的表達差異有關。外泌體可能是新生血管潛在的治療靶點,具有較高的臨床應用潛力。

4.4小膠質細胞中的代謝產物可能在促進病理性血管生成中發(fā)揮重要作用視網膜是代謝最活躍的組織之一,若視網膜組織代謝紊亂,將導致并加重視網膜病變。Liu等[41]發(fā)現(xiàn),與病理性新生血管相鄰的小膠質細胞的糖酵解能力增強,并將這些小膠質細胞定義為病理性視網膜血管生成相關糖酵解小膠質細胞(PRAGMs)。高糖酵解小膠質細胞會產生大量的乙酰輔酶A,導致組蛋白乙?；蚉RAGMs相關基因上調,從而重新編程小膠質細胞成為促血管生成的表型。在OIR模型中,敲除糖酵解的重要激活劑果糖-2,6-二磷酸酶3(PFKFB3)后,小膠質細胞無法促進內皮細胞增殖及病理性新生血管形成。此外,缺氧會使小膠質細胞乳酸分泌增高,促進YY1的乳酸化,進而上調FGF-2的表達,刺激視網膜新生血管。同樣地,通過靶向抑制乳酸/p300/YY1乳酸化/FGF-2通路,可減少血管生成[42]。上述研究揭示了糖酵解產物作為小膠質細胞和內皮細胞相互激活的起始物,在視網膜血管生成微環(huán)境中起著關鍵作用,并表明針對這些代謝通路可能有效地治療病理性視網膜血管生成。

4.5小膠質細胞中RIP3、Spp1、Gal3在促進血管生成中發(fā)揮重要作用視網膜小膠質細胞不僅可以通過炎癥因子、外泌體和代謝產物影響新生血管的形成,還會通過其他信號通路影響血管生成。小膠質細胞受到缺氧刺激后,會激活RIP1/RIP3/MLKL信號通路,導致小膠質細胞發(fā)生程序性壞死,壞死的小膠質細胞會產生并釋放FGF-2,從而刺激視網膜新生血管形成。當敲低受體相互作用蛋白3(RIP3)或抑制程序性壞死時,小膠質細胞可以顯著減少FGF-2的表達,有效緩解血管生成,并且阻斷FGF-2,與抗VEGF具有協(xié)同作用[43]。抑制小膠質細胞中RIP3介導的程序性壞死可能會抑制FGF-2等血管生成因子的釋放,從而抑制新生血管的形成。

Bai等[44]通過單細胞RNA測序發(fā)現(xiàn),分泌型磷酸蛋白1(Spp1)是OIR小鼠小膠質細胞中上調最多的基因。這種上調可能是由低氧誘導因子-1介導的缺氧和NF-κB介導的炎癥刺激導致的。而Spp1的分泌增加通過內皮細胞的Kit/Akt/mTOR信號通路促進小膠質細胞與內皮細胞之間的通訊,從而加重異常血管的形成。進一步研究發(fā)現(xiàn)通過玻璃體腔注射Spp1抗體可減少病理性新生血管的形成并改善視功能。該研究結果表明,小膠質細胞分泌Spp1可能通過激活內皮細胞的Kit/Akt/mTOR信號通路促進血管新生。

半乳糖凝集素3(galectin3,Gal3)在活化的小膠質細胞中生成和釋放增加,且與Jag1競爭性結合,從而抑制Notch信號通路,增強內皮血管代謝,促進病理性血管生成[45]。同樣地,缺氧狀態(tài)下,小膠質細胞中的可溶性半乳糖凝集素3結合蛋白(LGALS3BP)顯著增加,通過PI3K/AKT通路誘導基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-9、MMP-2和VEGF-A等血管生成相關因子的上調,進而促進視網膜血管生成。當沉默LGALS3BP后,小膠質細胞的促血管生成能力和血管生成相關因子的表達受到抑制[46]。上述研究結果提示Gal3和LGALS3BP在視網膜小膠質細胞促進血管生成中起著重要作用,可能成為治療視網膜新生血管的有效靶點。

4.6小膠質細胞中的TGF-β1/TβRⅡ、PPARα、Tsp-1有助于維持血管微環(huán)境穩(wěn)態(tài)視網膜小膠質細胞不僅在促進病理性血管生成方面發(fā)揮關鍵作用,也對維持血管穩(wěn)態(tài)起到有益貢獻。多功能細胞因子TGF-β在調節(jié)視網膜血管內皮細胞和血-視網膜屏障的穩(wěn)定性中起著至關重要的作用[47]。研究發(fā)現(xiàn),破壞小膠質細胞中的TGF-β信號傳導會導致白細胞淤積增加和IGF-1表達增加,從而加重視網膜新生血管的形成[48]。TGF-βⅡ型受體(TβRⅡ)在視網膜小膠質細胞中高表達,TβRⅡ缺失會引起視網膜結構和功能的嚴重病變,如周細胞分化和視網膜毛細血管缺乏,從而導致微動脈瘤、出血、小膠質細胞活化和視網膜新生血管形成[49]。因此,小膠質細胞中的TGF-β1/TβRⅡ信號通路能夠有效降低小膠質細胞的活化程度,并對視網膜血管內皮細胞起到保護作用。然而,也有研究指出,小膠質細胞表達的TGF-β1與血管重構密切相關。Kindlin3與小膠質細胞的極化有關,當敲除Kindlin3時,肌球蛋白的高收縮性促使ERK磷酸化,進一步刺激TGF-β1過度表達,從而導致血管生成[50]。因此,TGF-β信號通路可能同時具有促血管生成和抗血管生成活性,這可能與不同信號通路和疾病進程的差異有關,針對抑制或激活TGF-β通路的相反療法也被提出[51]。

在OIR小鼠模型中,視網膜小膠質細胞中的過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)明顯減少,并通過調節(jié)mtDNA釋放,上調cGAS-STING信號通路。研究發(fā)現(xiàn),敲除或藥物抑制STING可減少視網膜新生血管的形成并緩解視網膜血管滲漏[52]。PPARα激動劑Y-0452能夠提高PPARα的表達水平,從而顯著抑制視網膜毛細血管內皮細胞遷移和血管形成,改善血管滲漏并減少視網膜細胞死亡[53]。因此,小膠質細胞中的PPARα可能對視網膜起保護和抗血管生成作用。

通過比較OIR小鼠視網膜小膠質細胞與脊髓抗血管生成小膠質細胞的單細胞RNA測序數(shù)據,Luo等[54]發(fā)現(xiàn)血小板反應蛋白-1(Tsp-1)可能在抗血管生成中起到有益作用,進一步研究證實該作用通過兩個途徑實現(xiàn):(1)Tsp-1能夠直接影響視網膜內皮細胞的遷移和管腔形成能力;(2)高表達Tsp-1的小膠質細胞的外泌體中miR-27a-5p的豐度降低,從而維持內皮細胞中Smad3的表達,減弱視網膜新生血管。上述研究結果表明,視網膜小膠質細胞的Tsp-1在抗血管生成中發(fā)揮重要作用,并涉及不同的途徑。

以上研究揭示了視網膜小膠質細胞不僅促進了病理性血管生成,而且在維持血管穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著功能。此外,這些研究還揭示了抗血管生成的一些機制,為治療病理性新生血管提供了新的方法。

5小結

目前,臨床上治療視網膜新生血管的方法仍然存在局限性。調節(jié)小膠質細胞使其轉向具有神經和血管保護作用的亞型,可以控制視網膜新生血管的形成。近年來,隨著單細胞RNA測序技術的廣泛應用,研究者對相關機制的探索不斷深入。視網膜小膠質細胞可能通過產生和釋放細胞因子、外泌體和代謝產物等調節(jié)病理性新生血管的形成,但其具體的分子機制尚未完全闡明,且其療效還需進一步驗證。通過更深入地了解小膠質細胞在血管發(fā)育和新生血管生成中的關鍵作用,有望為預防和治療視網膜新生血管性疾病提供新的思路。