田薊苷對大鼠A7R5 血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移、表型轉(zhuǎn)化及Notch1信號通路調(diào)控的影響

李雅琪，馬曉莉，趙云麗，李 靜，袁 勇，王新春*

（1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子 832002； 2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832008）

血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMCs）是主動脈壁中膜的重要細(xì)胞成分［1］，血管損傷后，由收縮型轉(zhuǎn)為合成型，即VSMCs 的表型轉(zhuǎn)化，表型轉(zhuǎn)化的特征體現(xiàn)為細(xì)胞異常增殖和遷移。VSMCs 在動脈內(nèi)膜聚集是動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS） 過程的基礎(chǔ)，在AS 的發(fā)生發(fā)展過程中，VSMCs 表型轉(zhuǎn)化失調(diào)，由血管中膜向內(nèi)膜遷移并過度增殖［2］，分泌更多的細(xì)胞外基質(zhì)和炎癥因子［3］。由此可見，VSMCs 表型轉(zhuǎn)化是動脈粥樣硬化的關(guān)鍵性起始步驟。Notch 信號通路在VSMCs 分化、增殖、遷移及表型轉(zhuǎn)化中是一個關(guān)鍵的“調(diào)節(jié)器”，經(jīng)典的Notch1 信號通路通過激活下游靶基因Hes1、Hes5［4-5］，影響細(xì)胞增殖、凋亡和分化［6］。

田薊苷是新疆特色植物香青蘭DracocephalumMoldavica L.黃酮類化合物中含量最高的活性單體［7］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，田薊苷可調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，減少炎癥介質(zhì)生成，對AS 具有保護(hù)作用［8-10］。VSMCs 在AS 斑塊形成的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，而田薊苷發(fā)揮抗AS 的作用與VSMCs表型轉(zhuǎn)化之間的關(guān)系尚不清楚。因此，本研究采用氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL） 誘導(dǎo)刺激VSMCs 表型轉(zhuǎn)化，探討田薊苷調(diào)控Notch1 信號通路對VSMCs 表型轉(zhuǎn)化的影響，為田薊苷抗AS 提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞 大鼠A7R5 血管平滑肌細(xì)胞，貨號FH0419，購自上海富衡生物科技有限公司。

1.2 藥物 田薊苷（純度大于98%），由新疆藥物研究所提供，稱取5 mg 田薊苷粉末，加入到1 mL DMEM 中，配制成5 mg/mL 母液，給藥時用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基稀釋到所需劑量。γ-分泌酶抑制劑DAPT （美國APExBIO 公司，批號A8200）； 氧化低密度脂蛋白 （ox-LDL，廣州弈源生物科技有限公司，批號YB-002）； 辛伐他汀（北京索萊寶科技有限公司，批號IS0170），臨用時均用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基稀釋至所需劑量。

1.3 試劑 0.1% 結(jié)晶紫水溶液、BCA 蛋白定量試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號G1064、PC0020）； FBS胎牛血清（美國HyClone 公司，批號10100147）； DMEM 高糖液體培養(yǎng)基（美國Gibco 公司，批號11965092）； 0.25%胰酶-EDTA 消化液、ECL 超敏發(fā)光試劑盒、cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific 公司，批號25200-056、P0018A、K1622）； TRIzol 試劑 （美國Invitrogen 公司，批號15596026）； CCK-8 試劑盒（日本DojinDO 公司，批號CK04）； Transwell 聚碳酸酯膜嵌套（美國Corning 公司，批號3422）； QuantiNova SYBR Green PCR Kit （德國QIANGEN 公司，批號208054）； Hes1 兔單克隆抗體、RBPJκ 兔單克隆抗體（英國Abcam 公司，批號ab108937、ab180588）； Notch1 兔單克隆抗體 （美國Cell Signaling Technology 公司，批號3608S）； GAPDH 小鼠單克隆抗體、HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG （北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號10494-1-AP、140193、141987）。

1.4 儀器 Forma II 3110 水套式CO2培養(yǎng)箱、Pico-17 型微量高速離心機(jī) （美國Thermo Fisher Scientific 公司）；CKX53 型常規(guī)倒置顯微鏡 （日本Olympus 公司）； DW-86L100J-80 ℃超低溫冰箱（青島海爾電冰箱有限公司）；M200 Pro 型多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司）； VE-180 型垂直電泳及電轉(zhuǎn)儀（上海天能科技有限公司）； ChemiDoc XRS＋型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）； Rotor-Gene Q型實(shí)時熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （PCR） 儀 （德國QIANGEN 公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將A7R5 血管平滑肌細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、0.1% 青-鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長融合時用0.25%胰酶-EDTA 消化液傳代，傳代后取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 造模及分組 將A7R5 細(xì)胞分為對照組（未加藥物處理，用含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)）、模型組（50 μg/mL ox-LDL 作用24 h 后，等體積含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基作用24 h）、田薊苷組（50 μg/mL ox-LDL 作用24 h 后，10 μg/mL 田薊苷作用24 h）、DAPT組（50 μg/mL ox-LDL 作用24 h 后，10 μmol/L DAPT 作用24 h）、辛伐他汀組（50 μg/mL ox-LDL 作用24 h 后，10 μmol/L 辛伐他汀作用24 h）。

2.3 CCK8 法檢測細(xì)胞活性 將A7R5 細(xì)胞接種到96 孔板中，按照“2.2” 項(xiàng)下分組進(jìn)行處理，分別測定0 （細(xì)胞貼壁后不做任何處理）、24 （給予ox-LDL 造模24 h）、48 h（ox-LDL 造模24 h＋各組藥物24 h） 細(xì)胞活性，每組6 個復(fù)孔。處理結(jié)束后每孔加入含10% CCK-8 試劑的無血清培養(yǎng)基100 μL，在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，在450 nm 波長下測定光密度（OD） 值，細(xì)胞增殖活性與OD 值成正比。

2.4 Transwell 法檢測細(xì)胞遷移數(shù) 將A7R5 細(xì)胞接種于6孔板中，按照“2.2” 項(xiàng)下分組進(jìn)行處理，收集各組細(xì)胞于無血清培養(yǎng)基中，鋪入Transwell 小室的上室中，將小室放入24 孔板，下室加入600 μL 含15% FBS 的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，取出小室，棄去孔中培養(yǎng)液，PBS 浸洗2 次后，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，甲醇固定30 min，適當(dāng)風(fēng)干，0.1%結(jié)晶紫溶液染色40 min，PBS 浸洗3 次后，棉簽輕輕拭去上室水分，將上室的纖維膜撕下，置于載玻片上，封于中性樹膠中，蓋上蓋玻片晾干，于200 倍顯微鏡下隨機(jī)選5 個視野觀察細(xì)胞，拍照，計數(shù)。

2.5 RT-qPCR 法檢測細(xì)胞SM22α、α-SMA、Notch1、Hes1、Hes5、Jagged-1 mRNA 表達(dá) 將A7R5 細(xì)胞接種于6 孔板中，按照“2.2” 項(xiàng)下分組進(jìn)行處理，收集各組細(xì)胞，采用TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，測定其濃度和純度后，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，以GAPDH為內(nèi)參，結(jié)果以2-ΔΔCT法計算目的基因mRNA 相對表達(dá)量。引物由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列

2.6 Western blot 法檢測細(xì)胞Notch1、RBP-Jκ、Hes1 蛋白表達(dá) 將A7R5 細(xì)胞接種于6 孔板中，按照“2.2” 項(xiàng)下分組進(jìn)行處理，棄掉培養(yǎng)基，PBS 洗3 次后，向各組孔中加入150 μL 預(yù)冷的含1%PMSF 的裂解液，冰上裂解15 min，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，取上清得到細(xì)胞總蛋白溶液，BCA 測定蛋白濃度。經(jīng)10% SDS-PAGE 凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，然后分別加入一抗Notch1 （1 ∶1 000）、RBP-Jκ （1 ∶ 1 000）、Hes-1 （1 ∶500）、GAPDH （1 ∶4 000） 4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜4次，加入HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 或抗兔IgG 二抗（1 ∶20 000） 室溫孵育1 h，TBST 洗膜4 次，ECL 化學(xué)發(fā)光液法顯影，通過Image J 1.6.0 軟件對條帶進(jìn)行灰度值分析。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 田薊苷對A7R5 細(xì)胞增殖的影響 與對照組比較，模型組細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)（P＜0.01）； 與模型組比較，田薊苷組、DAPT 組和辛伐他汀組細(xì)胞增殖能力減弱 （P＜0.01），見表2。

表2 田薊苷對A7R5 細(xì)胞增殖的影響（±s，n＝6）

表2 田薊苷對A7R5 細(xì)胞增殖的影響（±s，n＝6）

注： 與對照組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.05。

組別0 h24 h48 h對照組0.574±0.010.663±0.030.713±0.02模型組0.566±0.010.770±0.01** 0.837±0.01**田薊苷組0.571±0.000.770±0.020.776±0.02＃＃DAPT 組0.567±0.010.763±0.020.777±0.01＃＃辛伐他汀組0.551±0.030.747±0.050.787±0.04＃＃

3.2 田薊苷對A7R5 細(xì)胞遷移的影響 與對照組比較，模型組細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)（P＜0.05）； 與模型組比較，田薊苷組、DAPT 組和辛伐他汀組細(xì)胞遷移能力減弱（P＜0.05），見圖1。

圖1 田薊苷對A7R5 細(xì)胞遷移的影響（×200，±s，n＝5）

3.3 田薊苷對A7R5 細(xì)胞SM22α、α-SMAmRNA 表達(dá)的影響 與對照組比較，模型組細(xì)胞α-SMAmRNA 表達(dá)降低（P＜0.01），SM22αmRNA 表達(dá)呈下降趨勢，但差異不顯著（P＞0.05）； 與模型組比較，田薊苷組、DAPT 組和辛伐他汀組細(xì)胞α-SMAmRNA 表達(dá)均升高 （P＜0.01），SM22αmRNA 表達(dá)呈增加趨勢，但差異不顯著 （P＞0.05），見表3。

表3 田薊苷對A7R5 細(xì)胞SM22α、α-SMA mRNA 表達(dá)的影響（±s，n＝5）

表3 田薊苷對A7R5 細(xì)胞SM22α、α-SMA mRNA 表達(dá)的影響（±s，n＝5）

注： 與對照組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.05。

組別SM22αα-SMA對照組1.12±0.051.09±0.08模型組1.00±0.020.50±0.06**田薊苷組1.07±0.110.97±0.12＃＃DAPT 組1.07±0.050.90±0.19＃＃辛伐他汀組1.10±0.070.85±0.15＃＃

3.4 田薊苷對A7R5 細(xì)胞Notch1、Hes1、Hes5、Jagged-1 mRNA 表達(dá)的影響 與對照組比較，模型組細(xì)胞Notch1、Hes1、Hes5 和Jagged-1 mRNA 表達(dá)升高（P＜0.01）； 與模型組比較，田薊苷組和DAPT 組細(xì)胞Notch1、Hes1、Hes5、Jagged-1 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01），辛伐他汀組Hes1、Jagged-1 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01），Notch1、Hes5 mRNA 表達(dá)無明顯變化（P＞0.05），見表4。

表4 田薊苷對A7R5 細(xì)胞Notch1、Hes1、Hes5、Jagged-1 mRNA 表達(dá)的影響（±s，n＝5）

表4 田薊苷對A7R5 細(xì)胞Notch1、Hes1、Hes5、Jagged-1 mRNA 表達(dá)的影響（±s，n＝5）

注： 與對照組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.05。

組別Notch1Hes1Hes5Jagged-1對照組0.61±0.070.63±0.060.53±0.100.60±0.06模型組1.02±0.25**1.04±0.07**1.01±0.17**1.01±0.14**田薊苷組0.64±0.17＃＃0.82±0.15＃0.59±0.04＃＃0.64±0.09＃＃DAPT 組0.61±0.03＃＃0.70±0.11＃＃0.45±0.22＃＃0.39±0.10＃＃辛伐他汀組0.89±0.170.71±0.07＃＃0.76±0.250.68±0.08＃

3.5 田薊苷對A7R5 細(xì)胞Notch1、RBP-Jκ、Hes1 蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，模型組細(xì)胞Notch1、RBP-Jκ、Hes1 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01）； 與模型組比較，田薊苷組細(xì)胞Notch1、RBP-Jκ、Hes1 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01），DAPT 組和辛伐他汀組Hes1、RBP-Jκ蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01），Notch1 蛋白表達(dá)無明顯變化（P＞0.05），見圖2。

圖2 田薊苷對A7R5 細(xì)胞Notch1、RBP-Jκ 和Hes1 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝5）

4 討論

VSMCs 位于血管中膜上，在正常狀態(tài)下，VSMCs 表現(xiàn)為高度分化的收縮型，增殖和遷移能力較差； 當(dāng)血管受損或ox-LDL 刺激時，VSMCs 由收縮型轉(zhuǎn)化為異常增殖的合成型，此過程稱為表型轉(zhuǎn)化。合成型的VSMCs 遷移到內(nèi)膜吞噬膽固醇，導(dǎo)致脂質(zhì)積累和泡沫細(xì)胞形成［11］，斑塊穩(wěn)定性下降，進(jìn)一步加速AS 的發(fā)展。因此，控制VSMCs 表型轉(zhuǎn)化對防治AS 具有重要意義。

本研究CCK-8 和Transwell 結(jié)果表明，田薊苷可抑制ox-LDL 誘導(dǎo)的細(xì)胞異常增殖和遷移。α-SMA 和SM22α 作為收縮型VSMCs 的標(biāo)志［12-13］，當(dāng)細(xì)胞處于增殖、修復(fù)或病變狀態(tài)時，該基因表達(dá)減少。本研究結(jié)果顯示，ox-LDL 刺激使α-SMAmRNA 表達(dá)降低，表明VSMCs 向合成型轉(zhuǎn)化，田薊苷處理可上調(diào)α-SMAmRNA 表達(dá)，抑制ox-LDL 誘導(dǎo)的VSMCs 的表型轉(zhuǎn)化。SM22αmRNA 表達(dá)無明顯變化，可能是因?yàn)镾M22α 表達(dá)具有時空性特點(diǎn)，在VSMCs 發(fā)育過程中，SM22α 的表達(dá)晚于α-SMA［14-15］； 并且平滑肌SM22α 表達(dá)的激活有從量變到質(zhì)變的過程，表現(xiàn)出時間、劑量儲積性［16-17］。以上結(jié)果表明，田薊苷可抑制VSMCs 的異常增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)化。

Notch 信號通路由Notch 配體、受體、下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子和核內(nèi)應(yīng)答過程組成，與細(xì)胞的增殖和分化密切相關(guān)［18］。其中，受體Notch1 被廣泛關(guān)注，Notch1 信號通路能調(diào)控平滑肌細(xì)胞的分化［19-21］，配體Jaggde1 在平滑肌細(xì)胞成熟的過程中發(fā)揮作用［22］，Hes1 和Hes5 是下游靶基因。Notch 信號通路在生物進(jìn)化過程中高度保守，組成部分的缺失會引起生理功能障礙，為了保證通路的完整性，本研究測定了包括受體Notch1、配體Jaggde1、靶基因Hes1 和Hes5 在內(nèi)的通路基因。結(jié)果顯示，ox-LDL 誘導(dǎo)A7R5 細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化后，Notch1 通路相關(guān)基因Notch1、Hes1、Hes5、Jagged-1 mRNA 和Notch1、RBP-Jκ、Hes1 蛋白表達(dá)均上調(diào)，而田薊苷處理可逆轉(zhuǎn)表達(dá)的上調(diào)，且在基因水平的作用與DAPT 相當(dāng)。值得注意的是，DAPT 抑制RBP-Jκ、Hes1 蛋白表達(dá)，對Notch1 蛋白的抑制作用不明顯，其原因可能是由于DAPT 是γ-分泌酶抑制劑［23］，而Notch1 信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是Notch1 與配體結(jié)合形成胞內(nèi)域，胞內(nèi)域在γ-分泌酶的作用下被裂解、釋放，活化的胞內(nèi)域易位到細(xì)胞核與RBP-Jκ 結(jié)合形成復(fù)合物，進(jìn)而激活下游靶蛋白Hes1 和Hes5 的表達(dá)［20，24］，因此DAPT 對單獨(dú)的Notch1 蛋白的抑制作用有限，而不影響對下游的RBP-Jκ、Hes-1 蛋白的抑制作用。鑒于DAPT 對Notch1 通路中胞內(nèi)域的這種抑制過程，故而在蛋白表達(dá)層面測定通路蛋白Notch1，形成復(fù)合物的關(guān)鍵蛋白RBP-Jκ 和下游靶蛋白Hes-1。

綜上所述，田薊苷對ox-LDL 誘導(dǎo)的A7R5 細(xì)胞有確切的保護(hù)作用，其機(jī)制與抑制VSMCs 的異常增殖、遷移、表型轉(zhuǎn)化，調(diào)控Notch1 信號通路有關(guān)。然而，對于田薊苷在體內(nèi)是否具有同樣的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。