淡豆豉發(fā)酵過程中影響因素研究

鐘榮榮，王奕博，范亞楠，周 旭，孫曉叢，陳彥琳，杜 杰

（中國中藥有限公司，北京 102600）

淡豆豉為豆科植物大豆Glycinemax（L.） Merr.成熟種子的發(fā)酵加工品，味苦、辛，性涼，具有解表、除煩、宣發(fā)郁熱的功效，主要用于治療感冒、寒熱頭痛、煩躁胸悶、虛煩不眠等［1］。淡豆豉為臨床常用藥，但受限于不同的發(fā)酵條件，其市售品質(zhì)量參差不齊。淡豆豉的發(fā)酵是大豆在微生物及酶的作用下，大分子有機物不斷分解為小分子（如脂肪分解為脂肪酸）、黃酮苷（大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷） 分解為黃酮苷元（大豆素、黃豆黃素、染料木素） 的過程，發(fā)酵菌種、溫濕度、發(fā)酵時間等均是影響飲片成品質(zhì)量的因素［2-5］。2020 年版《中國藥典》 以青蒿、桑葉為輔料，使用二次發(fā)酵法生產(chǎn)淡豆豉，但對于前酵和后酵（再悶） 溫濕度無明確規(guī)定，現(xiàn)代研究對前酵工藝分歧較少，確定的發(fā)酵溫度多為25～32 ℃，相對濕度為80%左右，發(fā)酵時間4～7 d。但不同研究者選擇的后酵溫度差距極大，30～60 ℃范圍內(nèi)均有，后酵時間為12～20 d［5-11］。為探索淡豆豉發(fā)酵原理，穩(wěn)定淡豆豉生產(chǎn)工藝，本實驗以黃酮類成分含量、酸值、色度為評價指標，比較不同后酵溫度及時間（35～65 ℃、1～15 d）、單次發(fā)酵（直接后酵）所得淡豆豉質(zhì)量，以探討不同因素對淡豆豉發(fā)酵過程的影響。

1 材料

1.1 儀器 Waters e2695 型高效液相色譜儀（美國Waters公司）； XS205 型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； Labonce-380GS 型穩(wěn)定性實驗箱（江蘇蘭貝石儀器有限公司）； BGZ-246 型電熱鼓風干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司）； KQ-500DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率500 W，頻率50 kHz）； 超純水儀（美國默克密理博公司）； CS-820 型色度儀（杭州彩譜科技有限公司）；FW100 型粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 藥材 黑豆購自安國藥材市場； 青蒿 （批號C427210202）、桑葉（批號C449210402） 購自安國市深豪藥業(yè)有限公司，均經(jīng)中國中藥有限公司主任中藥師陳彥琳鑒定為正品。

1.3 試劑 甲醇（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司）；冰醋酸、95% 乙醇、石油醚均（分析純，北京化工試劑廠）； 水為超純水。大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素對照品（批號111738-201904、111709-201702、111502-202003、111704-202104，中國食品藥品檢定研究院）； 黃豆黃苷、黃豆黃素對照品 （ 批號 N24GB169100、G26N11L132454，上海源葉生物科技有限公司）； 氫氧化鉀容量分析用溶液（0.100 5 mol/L，批號55K1，北京海岸鴻蒙標準物質(zhì)技術有限責任公司）。

2 方法與結果

2.1 淡豆豉HPLC 檢測方法學的建立

2.1.1 色譜條件 Agilent Zobax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相甲醇（A） -0.5% 冰醋酸（B），梯度洗脫（0～25 min，30% ～45% A； 25～50 min，45% ～60% A）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測波長260 nm［12-13］。

2.1.2 對照品溶液制備 取大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素分別為0.072、0.020 52、0.144、0.063 6、0.010 33、0.065 7 mg 的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液制備 取淡豆豉粉末1 g （過60 目篩），精密稱定，加5 mL 石油醚，60 ～90 ℃條件下浸泡3 h 脫脂，過濾，濾渣加入80% 甲醇25 mL，超聲處理（功率500 W，頻率50 Hz） 30 min，放冷并補足減失質(zhì)量，取上清液過0.45 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 線性關系考察 精密吸取對照品溶液0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、5.0、8.0 mL，分別置于10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列梯度標準溶液。對照品溶液和梯度標準溶液在“2.1.1” 項條件下進樣測定，進樣量10 μL。以質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關系良好。

表1 各成分線性關系

2.1.5 重復性試驗 稱取同一淡豆豉粉末，按“2.1.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素的平均含量RSD 分別為1.94%、2.92%、1.87%、2.29%、3.89%、2.98%，表明該方法重復性良好。

2.1.6 中間精密度試驗 取“2.1.4” 項下重復性試驗所用淡豆豉6 份，2 個實驗員分別按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素峰面積RSD 分別為3.84%、2.86%、4.86%、3.50%、4.21%、3.60%，表明該方法精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，于0、1、2、4、8、12、24 h 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，進樣量10 μL，測得大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素峰面積RSD 分別為3.55%、1.61%、2.50%、0.90%、0.82%、1.33%。

2.1.8 加樣回收率試驗 取“2.1.5” 重復性試驗項下含量已知的淡豆豉粉末6 份，精密稱定，每份0.5 g，按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，分別精密加入對照品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素平均加樣回收率分別為107.59%、101.17%、99.70%、101.60%、96.08%、101.99%，RSD 分別為1.40%、1.69%、1.09%、1.68%、1.28%、1.20%。

2.2 酸值測定 單以黃酮苷類成分的轉化為指標難以全面評價淡豆豉的發(fā)酵程度，故需補充酸值、色度等評價指標。酸值反映脂肪水解程度，酸值越高，說明淡豆豉發(fā)酵過程中微生物或相關酶作用越活躍，淡豆豉發(fā)酵越完全。具體方法為精密稱取淡豆豉1.5 g，置250 mL 錐形瓶中，加乙醇-石油醚（1 ∶1） 50 mL，靜置30 min，過濾，濾渣使用乙醇-石油醚（1 ∶1） 20 mL 清洗2 次，清洗液合并，用氫氧化鈉滴定液滴定，至粉紅色持續(xù)30 秒不褪［14］。

2.3 色度測定方法 因發(fā)酵溫度和時間不同，淡豆豉樣品斷面顏色可能呈現(xiàn)棕黃色、棕紅色、棕黑色等，一般發(fā)酵越完全，顏色越接近棕黑色，故有必要對淡豆豉色度進行測定。色差儀可用于淡豆豉粉末顏色的測定，其中L 代表明暗度（黑白），a 代表紅綠色，b 代表黃藍色。L 值越低，說明淡豆豉顏色越深，a 值越大，說明淡豆豉顏色越紅，b值越大，說明淡豆豉顏色越黃，越接近2020 年版《中國藥典》 要求的“斷面棕黑色”。參考文獻［15］ 中的方法進行測定，其中淡豆豉粉末過三號篩。

2.4 淡豆豉制備 參照2020 年版《中國藥典》［1］方法，取桑葉、青蒿，加10 倍水煎煮2 次，過濾，藥液濃縮至5 倍生藥量后拌入凈制的黑豆，浸泡過夜，藥液被吸盡后，隔水蒸熟，晾至40 ℃以下。將黑豆放入竹筐中，以濕紗布覆蓋，再覆以煎過的藥渣，在溫度（26±2）℃、相對濕度（75±10）%下培養(yǎng)，待黃衣便上，取出，洗曲，瀝干，裝入容器中，45 ℃密閉發(fā)酵15 d 后，取出，略蒸，45 ℃干燥，即得。每1 000 g 黑豆，用桑葉100 g，青蒿80 g。

2.5 后酵條件對淡豆豉質(zhì)量的影響

2.5.1 樣品制備 按“2.4” 項下方法，其中后酵溫度分別為35、45、50、55、65 ℃，后酵時間分別為0、1、2、3、4、5、6、7、9、11、13、15 d，每批后酵品使用300 g洗曲樣品，平行重復2 次。結果發(fā)現(xiàn)，后酵15 d 后淡豆豉各指標變化速度趨于平緩，且成品豉香味濃郁，外觀性狀符合2020 年版 《中國藥典》 規(guī)定，故確定后酵時間為15 d。

2.5.2 黃酮類成分含量測定 不同后酵溫度、時間下，淡豆豉黃酮類成分含量測定結果見圖1 ～5，其中第0 天為洗曲后樣品。因洗曲后干燥時間不同，不同后酵溫度第0 天樣品黃酮苷類成分存在部分差異。由圖可知，35 ℃后酵3 d內(nèi)苷類成分轉化較快，之后苷元類成分增加速度較慢，在第13 天時到達頂峰； 45 ℃后酵第1 天，苷類成分即快速轉化，第2～3 天時轉化速度下降，苷元類成分在第11 天到達頂峰； 50 ℃后酵第1 天，苷類成分即大部分轉化，第2 天苷類成分完全轉化，之后染料木素含量緩慢降低，大豆素含量較為穩(wěn)定； 55 ℃后酵黃酮類變化趨勢接近50 ℃，但染料木素含量下降速度更快； 60 ℃后酵第1 天，苷類成分即大部分轉化，第2 天苷元含量達到頂峰，之后苷元基本不轉化，染料木素含量快速降低，大豆素含量較穩(wěn)定。

圖1 35 ℃后酵黃酮類成分含量測定結果（n＝2）

圖2 45 ℃后酵黃酮類成分含量測定結果（n＝2）

圖3 50 ℃后酵黃酮類成分含量測定結果（n＝2）

圖4 55 ℃后酵黃酮類成分含量測定結果（n＝2）

圖5 65 ℃后酵黃酮類成分含量測定結果（n＝2）

2.5.3 酸值變化規(guī)律 發(fā)酵過程中酸值動態(tài)分析結果見圖6?？芍?，后酵過程中酸值會不斷增加，隨著后酵溫度的上升，淡豆豉酸值越小，其中65 ℃時酸值最低。

圖6 不同溫度后酵酸值測定結果（n＝2）

2.5.4 色度變化規(guī)律 淡豆豉亮度（L） 分析結果見圖7，不同溫度后酵時，淡豆豉亮度均呈下降趨勢，以55、50 ℃亮度下降最快。淡豆豉紅度（a） 測定結果見圖8，除65 ℃外，不同溫度后酵時，淡豆豉紅度均呈上升趨勢，其中65、55、50 ℃后酵產(chǎn)品紅度接近，35、45 ℃紅度接近。淡豆豉黃度（b） 測定結果見圖9，50、55 ℃后酵時，隨著發(fā)酵時間的增加，淡豆豉b 值逐漸減小，其他溫度對b 值影響不明顯。淡豆豉顏色一方面是黑豆種皮中水溶性成分帶入的，另一方面是高溫和酶促反應共同介導的美拉德反應產(chǎn)生的類黑精等物質(zhì)［2］。因此35～45 ℃時淡豆豉顏色較淺，50 ～55 ℃時淡豆豉呈棕黑色，65 ℃時淡豆豉呈棕紅色，高溫導致酶促反應速率降低，其類黑精成分較少。

圖7 不同后酵溫度亮度測定結果（n＝2）

圖8 不同后酵溫度紅度測定結果（n＝2）

2.5.5 不同指標相關性分析 為更好地闡述酸值、色度和黃酮類成分含量3 個評價指標的關系，更好地控制淡豆豉產(chǎn)品質(zhì)量，對不同溫度發(fā)酵過程中共60 個樣品的3 種黃酮苷、3 種黃酮苷元、3 個色度和酸值間的相關性進行分析。各組數(shù)據(jù)不均呈正態(tài)分布，故使用SAS 8.2 軟件進行spearman 相關系數(shù)分析，結果見表2?？芍蘸颗c苷元含量、酸值呈負相關，苷元含量與酸值呈正相關，說明在正常發(fā)酵條件下，酸值和黃酮類成分含量關系較為密切，發(fā)酵越充分，酸值越高。亮度與苷含量呈正相關，紅度與苷含量呈負相關，黃度與苷元含量呈正相關，顏色指標整體與其他指標相關性較小。

2.6 直接后酵對淡豆豉質(zhì)量的影響

2.6.1 樣品制備方法 按“2.4” 項下淡豆豉制備方法，省去前酵過程，將蒸熟的黑豆直接45 ℃密閉發(fā)酵15 d 后干燥，得到直接后酵品； 將蒸熟的黑豆混入質(zhì)量分數(shù)0.04%米曲霉孢子后，分別拌入0、2.5%、5%、10%的水，45 ℃密閉發(fā)酵15 d 后干燥，得到不同加水量種曲后酵品，平行重復2 次。

2.6.2 淡豆豉指標成分變化規(guī)律 不同發(fā)酵方法淡豆豉指標成分測定結果見圖10 ～11。黑豆原料中不含黃酮苷元類化合物，由圖10 可知，直接后酵品仍有少量黃酮苷轉化為苷元，說明即使沒有酶促反應，高溫環(huán)境也可以導致黃酮類成分分解。45 ℃遠超過米曲霉適宜生長溫度，實驗發(fā)現(xiàn)種曲后酵品表面無明顯菌落，加入種曲僅能起到帶入米曲霉孢子中的酶的作用［16］。種曲后酵品黃酮類轉化率超過50%，說明酶促反應的確是淡豆豉發(fā)酵過程中成分轉化的因素。加入種曲的同時再加入2.5%的水，黃酮苷類成分幾乎完全轉化為苷元，其原因是一方面少量的水可以使米曲霉孢子更深入黑豆內(nèi)部，另一方面適宜的含水量可以促進酶活性，也可能是適宜的含水量加速了黃酮苷的分解，而加入更多水不會更明顯促進黃酮苷的轉化。對于酸值而言，后酵品酸值均低于5 mg KOH/g，遠小于正常發(fā)酵品的15 mg KOH/g 以上。不同工藝條件下，淡豆豉亮度變化較小，黃度和紅度變化較大，其中以加水2.5%種曲后酵品顏色最鮮艷，其原因是適量的水促進了美拉德反應，而過量的水對顏色具有稀釋作用。

圖10 不同工藝淡豆豉黃酮類成分含量及酸值測定結果（n＝2）

圖11 不同工藝淡豆豉色度測定結果（n＝2）

3 討論

2020 年版《中國藥典》 和1988 年版《全國中藥炮制規(guī)范》［17］均使用二次發(fā)酵法制備淡豆豉，其中前酵是微生物、菌絲和相關酶深入黑豆內(nèi)部的階段，后酵是酶分解大分子化合物、使淡豆豉產(chǎn)生特有風味的階段。但部分地區(qū)仍采用單次發(fā)酵法制備淡豆豉（僅前酵），所得產(chǎn)品豉香味淡、斷面色淺發(fā)酵并不完全，若想得到色香味濃的優(yōu)質(zhì)淡豆豉，后酵過程必不可少。

酸值一般用來表征油脂或食品的酸敗程度，也可以表征淡豆豉的發(fā)酵程度。后酵過程中酸值會不斷增加，說明淡豆豉中的脂肪在不斷水解。隨著后酵溫度的上升，淡豆豉酸值越小，其中65 ℃后酵淡豆豉酸值明顯低于其他溫度，其原因可能是高溫抑制了酶活性。在適宜溫度下，隨著發(fā)酵時間的增加，酸值不斷增高，且未前酵樣品酸值明顯較低，故推測發(fā)酵越完全，淡豆豉酸值越高。僅以外觀性狀和黃酮苷元含量為指標無法表征淡豆豉發(fā)酵情況，如加水2.5%種曲直接后酵制作的淡豆豉表面呈黑色，有皺縮，質(zhì)脆，斷面棕黃色，大豆苷元和染料木素的總量大于0.20%，基本符合2020 年版《中國藥典》 規(guī)定的外觀性狀和含量測定標準，但其沒有前酵過程，酸值只有2.86 mg KOH/g，遠低于完全發(fā)酵淡豆豉。因此有必要增加酸值作為淡豆豉的質(zhì)量控制指標。

近年來研究者多關注不同發(fā)酵工藝終點時淡豆豉飲片質(zhì)量［6，18］，但對發(fā)酵過程中成分轉化分析較少。對淡豆豉后酵不同溫度、時間所得產(chǎn)品進行分析，有利于揭示淡豆豉發(fā)酵原理，穩(wěn)定生產(chǎn)工藝。后酵溫度50 ～55 ℃時可促進黃酮苷快速轉變?yōu)檐赵部梢栽诘? 天時使酸值大量增加，但長時間加熱會導致黃酮苷元的損失，其中以染料木素最不穩(wěn)定。且隨著發(fā)酵時間的增加，淡豆豉酸值仍在緩慢增加，亮度持續(xù)降低，說明此時不同成分的轉化速率是不同步的，當黃酮類成分完全轉化乃至發(fā)生分解時，脂肪的水解、類黑精物質(zhì)的生成仍不完全。若按2020 年版《中國藥典》 要求后酵15 ～20 d，則尋找適宜的后酵溫度，使三者轉化速率接近才是保證淡豆豉“發(fā)透” 且不“發(fā)過”的關鍵。35、45 ℃后酵時黃酮苷轉化、酸值增加、顏色變化3 個指標變化率較為同步，說明此溫度下是適宜的淡豆豉后酵溫度，其中以45 ℃后酵成品豉香味更濃。若從減少生產(chǎn)周期的角度考慮，應選擇后酵溫度50 ～55 ℃、發(fā)酵2 d，此時黃酮類成分轉化完全，分解較少，酸值、顏色等指標雖未達到頂峰，但也接近45 ℃后酵7 d 所得淡豆豉質(zhì)量。