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      LC-MS/MS 法同時(shí)測定活血止痛膠囊/片中16 種真菌毒素及污染狀況分析

      2024-03-25 06:13:42胡紫艷
      中成藥 2024年3期
      關(guān)鍵詞:黃曲霉甲酸乙腈

      史 達(dá),陳 潔,張 玲,胡紫艷,曹 玉*

      (1.南京市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)院,江蘇 南京 211198; 2.南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京 211112)

      活血止痛膠囊/片均由三七、土鱉蟲等6 味藥材組成,具有活血散瘀、消腫止痛的功效[1]。真菌毒素是真菌產(chǎn)生的具有生物體內(nèi)蓄積效應(yīng)的有害次生代謝物,具有人體造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等毒性以及致癌和致畸作用[2-4]。據(jù)已有文獻(xiàn)研究,處方中三七與土鱉蟲均有玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素、伏馬毒素、雜色曲霉毒素等真菌毒素殘留現(xiàn)象[5-9]。同時(shí),活血止痛膠囊及活血止痛片制備工藝均為全粉入藥,2020 年版《中國藥典》 通則“9305 中藥中真菌毒素測定指導(dǎo)原則” 規(guī)定,處方中含有易污染的藥材及生粉投料的中成藥品種應(yīng)注意相關(guān)真菌毒素的測定。

      2020 年版《中國藥典》 僅對處方中土鱉蟲規(guī)定黃曲霉毒素限度,活血止痛膠囊規(guī)定項(xiàng)下及活血止痛片劑執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)[10]均未規(guī)定真菌毒素殘留限度。目前較為成熟的測定方法有液相色譜法[11]、酶聯(lián)免疫法[12]及液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[13-15]; 真菌毒素常用的前處理方法包括QuEChERS 凈化[13]、液液萃取[16]、固相萃取[17]、免疫親和凈化[18]等。本實(shí)驗(yàn)通過對比QuEChERS 凈化、固相萃取凈化、免疫親和柱凈化這3 種前處理方法,建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS) 法準(zhǔn)確、靈敏、快速篩查活血止痛膠囊和活血止痛片劑中16 種真菌毒素,以期為合理評價(jià)活血止痛制劑質(zhì)量及為該類中成藥安全監(jiān)管提供數(shù)據(jù)支撐與技術(shù)參考。

      1 材料

      1.1 儀器 Agilent 1290 液相色譜儀、Agilent 6470 三重四級桿質(zhì)譜(美國Agilent 公司); CPA225D 十萬分之一電子天平(德國Sartorius 公司); Milli-Q 純水儀(美國Merck公司); KQ-250B 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司,功率250 W,頻率30 kHz); 渦旋混勻器 (德國Wiggens 公司); N-EVAP24 型氮吹儀(美國Organomation公司); Oasis Prime HLB 固相萃取柱、Oasis HLB 固相萃取柱(美國Waters 公司)。

      1.2 試劑與藥物 黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2對照品溶液(25 μg/mL),黃曲霉毒素M1、M2對照品溶液(10 μg/mL),伏馬毒素對照品溶液(50 μg/mL),HT-2 毒素對照品溶液(100 μg/mL),T-2 毒素對照品溶液(100 μg/mL),雜色曲霉毒素對照品溶液(50 μg/mL),脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對照品溶液 (100 μg/mL),赭曲霉毒素A 對照品溶液(10 μg/mL),玉米赤霉烯酮對照品溶液 (100 μg/mL),桔青霉毒素對照品溶液(100 μg/mL),真菌毒素六合一復(fù)合免疫親合柱(黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、伏馬毒素、T-2 毒素,6 mL),均購自青島普瑞邦生物工程有限公司。QuEChERS 試劑1(MgSO46 g、CH3COONa 1.5 g,貨號 5982-5755)、QuEChERS 試劑2 (PSA 800 mg、MgSO41 200 mg,貨號5982-6666)、QuEChERS 試劑3 (PSA 400 mg、MgSO41 200 mg,貨號5982-5058)、QuEChERS 試劑4 (Carbon S 90 mg、C18300 mg、PSA 300 mg、SiO2300 mg、MgSO4900 mg,貨號5610-2056)、QuEChERS 試劑5 (PSA 150 mg、C18EC 150 mg、MgSO41 200 mg,貨號5982-5156) 購自美國Agilent 公司。甲醇、乙腈為色譜純 (美國Honeywell 公司); 甲酸、甲酸銨、乙酸銨為色譜純(上海阿拉丁生化科技股份有限公司); 水為超純水(實(shí)驗(yàn)室自制)。活血止痛膠囊、活血止痛片均為市售,共40 批,來源于6 家生產(chǎn)企業(yè),具體見表1。

      表1 樣品信息

      2 方法與結(jié)果

      2.1 LC-MS/MS 條件

      2.1.1 色譜 Agilent RRHD Eclipse Plus C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.8 μm); 流動(dòng)相水(含有0.1% 甲酸和2 mmol/L 甲酸銨,A) -乙腈 (B),梯度洗脫 (0 ~3 min,90%A; 3 ~8 min,90% ~60%A; 8 ~12 min,60% ~30% A;12~14 min,30% ~10% A; 14 ~15 min,10% A; 15 ~15.1 min,10% ~90% A; 15.1 ~18 min,90% A); 體積流量0.3 mL/min; 柱溫35 ℃; 進(jìn)樣量3 μL。

      2.1.2 質(zhì)譜 電噴霧離子源(ESI),正、負(fù)離子掃描; 離子源溫度350 ℃; 毛細(xì)管電壓3 500 V (+)、2 500 V (-);鞘氣體積流量12 L/min,溫度350 ℃; 霧化器壓力45 psi(1 psi=6.895 kPa); 采集模式,動(dòng)態(tài)多反應(yīng)離子監(jiān)測模式(DMRM)。其他質(zhì)譜參數(shù)見表2,MRM 色譜圖見圖1。

      圖1 各真菌毒素MRM 色譜圖

      表2 各真菌毒素質(zhì)譜參數(shù)

      2.2 溶液制備

      2.2.1 對照品溶液 精密吸取黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2,黃曲霉毒素M1、M2,伏馬毒素B1、B2、B3,赭曲霉毒素A,玉米赤霉烯酮,T-2 毒素,HT-2 毒素,脫氧雪腐鐮刀菌烯醇,桔青霉毒素,雜色曲霉毒素對照品溶液適量,置于20 mL 量瓶中,乙腈稀釋至刻度,制成含黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2,桔青霉毒素80 ng/mL,伏馬毒素B1、B2、B3,T-2 毒素800 ng/mL,玉米赤霉烯酮200 ng/mL,赭曲霉毒素A、雜色曲霉毒素160 ng/mL,HT-2 毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇2 000 ng/mL 的貯備液,密封,在-20 ℃下保存。精密吸取0.5 mL,置于10 mL 量瓶中,50%乙腈稀釋至刻度,逐級稀釋,即得(含黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2,桔青霉毒素0.1、0.2、0.4、1、2、4 ng/mL,伏馬毒素B1、B2、B3,T-2 毒素1、2、4、10、20、40 ng/mL,玉米赤霉烯酮0.25、0.5、1、2.5、5、10 ng/mL,赭曲霉毒素A、雜色曲霉毒素0.2、0.4、0.8、2、4、8 ng/mL,HT-2 毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇2.5、5、10、25、50、100 ng/mL,編號S1~S6)。

      2.2.2 供試品溶液

      2.2.2.1 QuEChERS-HLB 凈化法 取本品約5 g,精密稱定,置于50 mL 離心管中,精密加入提取液(80% 乙腈-15%水-5%甲酸) 20 mL,渦旋振蕩2 min,加入QuEChERS提取試劑盒(含PSA 150 mg、C18150 mg、MgSO41 200 mg)渦旋振蕩5 min,10 000 r/min 離心5 min。精密量取上清液5 mL,加水稀釋至10 mL,搖勻,10 000 r/min 離心5 min,精密量取3 mL,緩慢通過已處理好的Oasis HLB 固相萃取柱(3 mL/150 mg,依次用甲醇、水各3 mL 洗脫) 直至有適量空氣通過,收集洗脫液,用3 mL 含0.2%甲酸的乙腈洗脫,收集合并洗脫液,40 ℃氮?dú)饩徛抵两?,加?0%乙腈(含0.2%甲酸) 定容至1.5 mL,0.22 μm 微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,即得。

      2.2.2.2 Prime HLB -IAC 凈化法 取本品約5 g,精密稱定,置于50 mL 離心管中,精密加入提取液(80% 乙腈-15%水-5%甲酸) 20 mL,渦旋振蕩2 min,10 000 r/min 離心5 min。精密量取上清液5 mL,緩慢通過Oasis Prime HLB固相萃取柱,1 mL 乙腈洗脫柱子,接凈化液加PBS 磷酸緩沖液配方(8.0 g NaCl、l.2 g Na2HPO4、0.2 g KH2PO4、0.2 g KCl,加990 mL 水溶解,鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至7.0,再加水稀釋至1 000 mL) 稀釋至40 mL,稀釋液以重力自然速度通過免疫親合柱,20 mL 水洗脫,棄去洗脫液,使空氣進(jìn)入柱子,將水?dāng)D出柱子后再用1.5 mL 乙腈(含0.2%甲酸)、0.5 mL 水依次洗脫(乙腈洗脫時(shí)稍作停留),收集洗脫液,0.22 μm 微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,即得。

      2.2.2.3 QuEChERS 凈化法 取本品約5 g,精密稱定,置于50 mL 離心管中,精密加入提取液(80% 乙腈-15% 水-5%甲酸) 20 mL,渦旋振蕩2 min,加入6 g MgSO4、1.5 g CH3COONa 渦旋振蕩2 min,10 000 r/min 離心5 min,精密吸取上清液10 mL,置于50 mL 離心管中,加入QuEChERS提取試劑(PSA 150 mg、C18150 mg、MgSO41 200 mg),渦旋5 min,10 000 r/min 離心5 min,取上清液5 mL,40 ℃氮?dú)饩徛抵两桑?0% 乙腈 (含0.2% 甲酸) 定容至1 mL,0.22 μm 微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,即得。

      2.2.3 基質(zhì)效應(yīng) 取未檢出16 種真菌毒素的活血止痛膠囊(批號190328) 作為空白基質(zhì),按“2.2.2.1” 項(xiàng)下方法制備空白基質(zhì)溶液,將“2.2.1” 項(xiàng)下貯備液分別用空白基質(zhì)溶液、50%乙腈逐級稀釋,以各真菌毒素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y) 進(jìn)行回歸,分別以空白基質(zhì)、50%乙腈制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率的比值對基質(zhì)效應(yīng)(ME) 進(jìn)行評估[17,19],以ME>100%為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),ME<100%為基質(zhì)抑制效應(yīng),ME 85% ~115% 為基質(zhì)效應(yīng)不明顯。結(jié)果,黃曲霉毒素B2、T-2 毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇毒素均有明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng),而黃曲霉毒素M1、黃曲霉毒素M2、伏馬毒素B1、伏馬毒素B3、HT-2 毒素存在明顯基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),見圖2。

      圖2 各真菌毒素基質(zhì)抑制效應(yīng)(A)、基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)(B)

      2.3 方法學(xué)考察

      2.3.1 線性關(guān)系考察 取“2.2.3” 項(xiàng)下基質(zhì)空白溶液適量,按“2.2.1” 項(xiàng)下方法制備對照品溶液S1 ~S6,在“2.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo)(Y) 進(jìn)行回歸,并以S/N =10 時(shí)的質(zhì)量濃度為定量限,S/N=3 時(shí)的質(zhì)量濃度作為檢測限,結(jié)果見表3,可知各真菌毒素在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

      表3 各真菌毒素線性關(guān)系

      2.3.2 精密度試驗(yàn) 取“2.3.1” 項(xiàng)下對照品溶液S2,在“2.1 “項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定6 次,測得黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2,伏馬毒素B1、B2、B3,赭曲霉毒素A,玉米赤霉烯酮,脫氧雪腐鐮刀菌烯醇,T-2 毒素,HT-2 毒素,桔青霉毒素,雜色曲霉毒素峰面積RSD 分別為2.39%、2.68%、4.76%、2.70%、5.28%、3.84%、2.12%、5.87%、4.36%、7.91%、7.29%、5.77%、3.82%、3.77%、4.11%、3.48%,表明儀器精密度良好。

      2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取本品(批號190328) 5 g,按“2.2.2.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,室溫下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定,測得黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2,伏馬毒素B1、B2、B3,赭曲霉毒素A,玉米赤霉烯酮,脫氧雪腐鐮刀菌烯醇,T-2毒素,HT-2 毒素,桔青霉毒素,雜色曲霉毒素峰面積RSD分別為2.39%、1.67%、2.87%、2.93%、1.72%、1.41%、5.18%、9.32%、8.31%、11.06%、9.32%、9.05%、1.97%、3.58%、8.11%、6.13%,表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

      2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取本品(批號190328) 5 g,平行6 份,按“2.2.2.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定,測得黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2,伏馬毒素B1、B2、B3,赭曲霉毒素A,玉米赤霉烯酮,脫氧雪腐鐮刀菌烯醇,T-2 毒素,HT-2 毒素,桔青霉毒素,雜色曲霉毒素含量RSD 分別為1.78%、1.88%、3.11%、4.85%、3.89%、1.88%、6.20%、5.50%、10.76%、8.46%、6.39%、3.81%、1.22%、7.93%、3.91%、2.33%,表明方法重復(fù)性良好。

      2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取本品(批號190328)5 g,按低、中、高質(zhì)量濃度水平分別精密加入對照品溶液50、125、500 μL,平行3 份,按“2.2.2.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定,計(jì)算回收率,結(jié)果見表4。

      表4 各真菌毒素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

      2.4 樣品含量測定 取 40 批樣品,各 2 份,按“2.2.2.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定,以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定含量。結(jié)果,檢出黃曲霉毒素B1、G1、伏馬毒素B1、B2、赭曲霉毒素A、雜色曲霉毒素,檢出率分別為20%、32.5%、57.5%、25%、42.5%、27.5%,其中黃曲霉毒素B1、G1檢出量分別為1.96~10.26、2.16~20.41 μg/kg,伏馬毒素B1、B2檢出量分別為22.45~812.2、12.52 ~913.8 μg/kg,赭曲霉毒素A檢出量為2.75 ~12.50 μg/kg,雜色曲霉毒素檢出量為2.99~32.78 μg/kg,表明真菌毒素殘留較嚴(yán)重,存在潛在用藥安全隱患。

      3 討論

      3.1 色譜條件、提取溶劑選擇 乙腈較甲醇洗脫能力強(qiáng),柱效更高,甲酸銨較乙酸銨各真菌毒素響應(yīng)更好,加入0.10%甲酸可明顯提高部分毒素離子化效率,故最終選擇乙腈-甲酸銨(2 mmol/L,0.10%甲酸) 作為流動(dòng)相。甲醇雖比乙腈有更好的溶解性,但乙腈具有更好的選擇性,可有效避免過多提取脂肪、色素等雜質(zhì)成分,并且一定比例水及甲酸可使部分水溶性、酸敏感性真菌毒素(伏馬毒素、赭曲霉毒素) 有更好響應(yīng),同時(shí)還可使樣品保持較高滲透性,故最終選擇80% 乙腈-15% 水-5% 甲酸系統(tǒng)作為提取溶劑。

      3.2 凈化方式優(yōu)化 活血止痛膠囊/片存在基質(zhì)效應(yīng),同位素內(nèi)標(biāo)能夠最大程度減少基質(zhì)效應(yīng)的干擾,但其定制繁瑣,價(jià)格昂貴,而合適的提取凈化方式也能有效減少基質(zhì)效應(yīng),本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[13-14],比較不同凈化方式選擇最優(yōu)去除干擾物方式,發(fā)現(xiàn)僅以QuEChERS 提取凈化活血止痛基質(zhì),伏馬毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、赭曲霉毒素A 和HT-2 毒素回收率較差,但加入PSA、MgSO4試劑后有助于水相與有機(jī)相分層,而加入carbon S、SiO2等可導(dǎo)致黃曲霉毒素、伏馬毒素、雜色曲霉毒素、赭曲霉毒素A 等響應(yīng)值偏低,并且過多PSA 也會影響伏馬毒素回收率,最終選擇PSA 150 mg、C18150 mg、MgSO41 200 mg 為提取試劑。進(jìn)一步研究不同凈化方式組合,發(fā)現(xiàn)基質(zhì)經(jīng)過QuEChERS 提取并過Oasis HLB 固相萃取柱凈化或者直接通過Oasis Prime HLB 固相萃取柱與免疫親合柱串聯(lián)凈化可滿足目標(biāo)真菌毒素回收率要求,但免疫親合柱中不含有雜色曲霉毒素、HT-2 毒素和桔青霉毒素等抗體導(dǎo)致該部分毒素回收率較差[20-24]??紤]到活血止痛膠囊/片中雜色曲霉毒素有較高的檢出率,因此本實(shí)驗(yàn)為合理考察活血止痛膠囊/片中16 種真菌毒素殘留情況,最終選擇更經(jīng)濟(jì)、適合高通量真菌毒素篩查的QuEChERS 提取組合Oasis HLB 固相萃取柱凈化作為提取凈化方式。

      4 結(jié)論

      本實(shí)驗(yàn)采用LC-MS/MS 法,從40 批活血止痛膠囊/片中檢出黃曲霉毒素B1、G1,伏馬毒素B1、B2,赭曲霉毒素A,雜色曲霉毒素,提示該類中藥品種存在潛在的真菌毒素污染風(fēng)險(xiǎn),患者口服用藥后有較大安全隱患,故應(yīng)加強(qiáng)其來源藥材、加工、儲存等環(huán)節(jié)的監(jiān)管。另外,該方法快速簡便,準(zhǔn)確靈敏,可為合理評價(jià)活血止痛膠囊/片中真菌毒素殘留風(fēng)險(xiǎn)提供技術(shù)支撐,并為安全監(jiān)管提供參考依據(jù)。

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