張風(fēng)雨，楊 璐，姜雯玉，黃 忍

（成都威斯津生物醫(yī)藥科技有限公司，四川 成都 610218）

羊口瘡病毒（ORFV）是痘病毒科、脊椎動(dòng)物痘病毒亞科、副痘病毒屬的典型代表［1］。ORFV具有高度的嗜上皮性，主要通過(guò)破損的皮膚及黏膜感染，是一種引起綿羊、山羊及人發(fā)病的急性高度接觸性人獸共患?。?］。臨床上主要以感染動(dòng)物的唇、鼻孔、口腔黏膜、乳房、陰部等部位皮膚形成紅斑、水皰、膿皰、丘疹和疣狀痂皮為特征［3］。已有研究表明，羊口瘡病毒為線性雙鏈DNA 病毒，基因組大小為134～139 kb，其中包含末端基因區(qū)（ORFs001-008和112-134）和中間核心區(qū)（ORFs009-111），編碼134個(gè)基因［4］。早有研究報(bào)道ORFV 編碼dUTPase［5］，dUTPase 由ORFV中483 bp的基因序列編碼產(chǎn)生，該蛋白常以融合形式表達(dá)［6］。dUTPase 是一種普遍存在的酶，它催化dUTP 水解生成脫氧尿苷單磷酸（dUMP）和焦磷酸（PPI），從而降低細(xì)胞中dUTP/dTTP 的比值，阻止尿嘧啶進(jìn)入DNA，降低發(fā)生錯(cuò)配的幾率［7］。dUMP經(jīng)甲基化變?yōu)樾叵汆奏っ撗鹾颂呛塑杖姿幔╠TTP），dTTP 是胸腺核苷酸生物合成的前體。研究表明，當(dāng)胞內(nèi)dUTPase 酶活性不足以支持病毒進(jìn)行有效復(fù)制時(shí)，編碼dUTPase 基因的病毒則可以上調(diào)胞內(nèi)dUTPase 酶活性，確保病毒正常復(fù)制［8］。本研究對(duì)山羊口瘡病毒四川分離株007基因（dUTPase）進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆，并利用生物信息學(xué)軟件對(duì)該基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，為進(jìn)一步研究ORFV dUTPase蛋白在ORFV致病中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 山羊口瘡病毒四川分離株SC-LZ1和pET-32a（＋）載體由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；DNA提取試劑盒、PCR試劑、膠回收試劑盒、Plasmid DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)至Takara 公司；限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI購(gòu)自NEB公司。

1.2 方法

1.2.1 ORFV 007基因的擴(kuò)增 根據(jù)GenBank 中ORF strain SJ1（KP010356.1）dUTPase 基因序列，用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)一對(duì)帶有酶切位點(diǎn)的特異性引物。上游引物：5′-CGCGGATCCATGGAG TTCTGCTGCACG-3′，下游引物：5′-CCGCTCGAG TTAAAGAGCTACATTTTACAATTTTGAT-3′。預(yù)期目的基因片段大小為507 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。根據(jù)DNA 提取試劑盒說(shuō)明提取山羊口瘡病毒四川分離株SCLZ1 的DNA。按以下體系進(jìn)行基因擴(kuò)增：DNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，PreMix 酶12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，反應(yīng)體系總體積為25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；16 ℃保存。

1.2.2 pET-32a（＋）-007重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將所擴(kuò)增的目的基因經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，采用膠回收試劑盒對(duì)目的條帶進(jìn)行膠回收。分別用限制性內(nèi)切酶BamHI 和XhoI 對(duì)膠回收產(chǎn)物和pET-32a（＋）進(jìn)行雙酶切（雙酶切體系見(jiàn)表1）。在37 ℃水浴條件下酶切30 min，酶切產(chǎn)物采用純化試劑盒進(jìn)行純化回收。將酶切純化產(chǎn)物與pET-32a（＋）在16 ℃金屬浴中連接過(guò)夜（連接體系見(jiàn)表2）。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，再均勻涂布于含100 μg/mL AMP 的LB 平板上，再倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜。次日，挑取疑似陽(yáng)性單菌落至含有100 μg/mL AMP的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃160 r/min 增菌培養(yǎng)過(guò)夜。采用Plasmid Miniprep Kit質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行PCR 鑒定和雙酶切鑒定。將鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的質(zhì)粒送往生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果為陽(yáng)性的質(zhì)粒命名為pET-32a（＋）-007。

表1 雙酶切體系

表2 連接體系

1.2.3 ORFV 007基因序列分析 將測(cè)序所得序列在NCBI上進(jìn)行同源性比較，并利用Mega7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4 dUTPase蛋白結(jié)構(gòu)及功能預(yù)測(cè) 采用在線軟件ExPasy 服務(wù)器上ProtParam 工具對(duì)基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析；利用ExPasy服務(wù)器的ProtScale工具，計(jì)算基于K-D法的蛋白質(zhì)疏水性；使用TMHMM Server v.2.0進(jìn)行跨膜區(qū)分析；使用Signal P 3.0 server 進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；利用NPSA和CBS在線軟件對(duì)該蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；利用NCBI 在線軟件對(duì)蛋白保守域進(jìn)行分析進(jìn)而預(yù)測(cè)其功能；利用SWISS-MODEL 進(jìn)行同源建模，預(yù)測(cè)其三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 ORFV 007 基因的擴(kuò)增 以提取的山羊口瘡病毒四川分離株SC-LZ1的DNA為PCR擴(kuò)增模板，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果成功擴(kuò)增出約500 bp條帶，與預(yù)期擴(kuò)增條帶大小相符（圖1）。

圖1 ORFV 007 PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定 由圖2可知，重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物與預(yù)期結(jié)果相符。

圖2 pET-32a（＋）-007重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

2.3 ORFV 007基因序列分析

2.3.1 ORFV 007 基因全序列 ORFV 007 基因全長(zhǎng)為483 bp，測(cè)序結(jié)果顯示擴(kuò)增基因無(wú)缺失。

2.3.2 ORFV 007基因的遺傳進(jìn)化樹(shù) 將本研究擴(kuò)增測(cè)序的ORFV 007 基因與NCBI 上收錄的所有ORFV 007 基因進(jìn)行比對(duì)分析，并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果該基因全序列與NCBI 收錄的編號(hào)為MF4890951 基因的同源性最高，達(dá)98.96%；構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示本試驗(yàn)分離毒株 與 MF489089.1、MF489095.1、MF489093.1、MF489088.1、MF489090.1 及MF489094.1 在同一分支，說(shuō)明親緣關(guān)系較近，但又單獨(dú)為一小支，存在一定的變異（圖3）。

圖3 ORFV 007基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.4 ORFV 007 編碼的dUTPase 蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)利用ExPasy 服務(wù)器上的ProtParam 工具對(duì)該蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果顯示：ORFV 007 編碼161個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為16 945.11，理論P(yáng)I值為5.27，消光系數(shù)為11 960，不穩(wěn)定系數(shù)為21.53，脂肪系數(shù)為82.19，總平均親水性為－0.016；該蛋白包含了除Pyl 和Sec 兩個(gè)氨基酸之外的其余18種常見(jiàn)氨基酸，其中Gly 含量最高，為13.1%，Met和Trp 含量最低，均為0.6%，其他氨基酸含量在1.9%～9.4%；帶正電荷氨基酸殘基總數(shù)為14 個(gè)，帶負(fù)電荷氨基酸殘基總數(shù)為18 個(gè)。利用ExPasy的ProtScale 程序計(jì)算基于K-D 法的蛋白質(zhì)疏水性，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)典型疏水區(qū)域。使用TMHMM Server v.2.0進(jìn)行跨膜區(qū)分析，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)典型跨膜區(qū)域。使用Signal P 3.0 server 進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示此蛋白不存在信號(hào)肽，不是分泌蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示ORFV 007編碼蛋白主要由無(wú)規(guī)卷曲和延伸鏈構(gòu)成，其中無(wú)規(guī)卷曲含量最多，為60.62%，位于1-7、14-33、35-46、57-61、67-71、80-82、86-90、99-103、107-110、120-124、130-154、160 區(qū)域；延伸鏈結(jié)構(gòu)占蛋白質(zhì)的33.12%，位于8-13、34、47-56、62-66、72-79、83-85、91-98、104-106、125-128、155-159區(qū)域；除上述結(jié)構(gòu)外，還有少部分α螺旋結(jié)構(gòu)，占蛋白質(zhì)的5.62%，位于111-119 區(qū)域。CBS 在線預(yù)測(cè)顯示，此段蛋白質(zhì)存在12 個(gè)磷酸化位點(diǎn)（絲氨酸9 個(gè)、蘇氨酸2個(gè)、酪氨酸1個(gè)）；在第17位氨基酸位置，含有一個(gè)潛在的N-連接糖基化位點(diǎn)；NCBI 在線預(yù)測(cè)顯示，此蛋白質(zhì)保守域活性位點(diǎn)的保守特征由9個(gè)氨基酸殘基組成，這9個(gè)殘基分別位于65-75、80-95區(qū)域；此段蛋白三聚體界面的保守特征由29 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，分別位于25-50 和80-115 區(qū)域；dUTPase 蛋白氨基酸序列中包含五個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，分別是PHA02703、dut、dUTPase、Dut、trimeric_dUTPase。用SWISS-MODEL 預(yù) 測(cè)該蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖4），QMQE為0.77，QMEAN為0.31，與模板3ehw.1.A 氨基酸序列的相似性為70.21%，屬于dUTP焦磷酸酶。

圖4 dUTPase蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖

3 討論與結(jié)論

3.1 討論 dUTPase 廣泛存在于各類哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、植物、細(xì)菌以及病毒內(nèi)，對(duì)生物體生命發(fā)展有重要意義。ORFV dUTPase 是dUTPase 超家族中的常見(jiàn)成員，與參與催化dUTP轉(zhuǎn)化為dUMP過(guò)程中的其他超家族成員相比，dUTPase 與它們具有相同的四級(jí)結(jié)構(gòu)，但在合成dTTP 過(guò)程中，僅有dUTPase 可以通過(guò)轉(zhuǎn)儲(chǔ)制作將dUTP 轉(zhuǎn)化為dUMP［9］，并且還能消除過(guò)量dUTP，從而降低dUTP與dTTP比例，進(jìn)一步降低尿嘧啶的DNA合成過(guò)程，減少在合成過(guò)程中出現(xiàn)錯(cuò)配［7］。除上述已經(jīng)確定的功能外，已有研究暗示dUTPase 可調(diào)節(jié)病毒毒力和基因組完整性［10］；亦有研究表明病毒dUTPase 在調(diào)節(jié)宿主免疫中起著重要作用，可促進(jìn)Ι型干擾素（IFN）的生成［11］。

3.2 結(jié)論 本試驗(yàn)以山羊口瘡病毒四川分離株SC-LZ1 的DNA 為模板，采用自行設(shè)計(jì)的ORFV dUTPase 特異性引物，經(jīng)PCR 成功擴(kuò)增獲得dUTPase 完整基因，通過(guò)構(gòu)建pET-32a（＋）-007重組表達(dá)質(zhì)粒并測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)該基因全序列與NCBI 收錄的編號(hào)為MF4890951 的基因同源性最高，為98.96%；構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示該分離毒株 與 MF489089.1、MF489095.1、MF489093.1、MF489088.1、MF489090.1 及MF489094.1 在同一分支，說(shuō)明親緣關(guān)系較近，但其又單獨(dú)為一小支，存在一定的變異。利用各類生物軟件對(duì)該蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果編碼蛋白中Gly含量最高，且二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)卷曲所占比例最大；在蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中，就結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性而言，α螺旋＞β折疊＞無(wú)規(guī)卷曲，但就功能而言，無(wú)規(guī)卷曲往往充當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和酶的活性中心，綜合對(duì)蛋白活性位點(diǎn)的預(yù)測(cè)分析，推測(cè)其酶活性中心位于氨基酸序列65-75及80-95；疏水性區(qū)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示此段氨基酸無(wú)疏水性區(qū)域，氨基酸疏水性預(yù)測(cè)值越大則此段氨基酸含有跨膜區(qū)域的可能性越大，跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果也顯示此段氨基酸無(wú)跨膜區(qū)域，所以跨膜區(qū)分析結(jié)果與疏水性區(qū)域分析結(jié)果一致，進(jìn)一步證明該蛋白不是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的膜受體蛋白。