于魯敏,信 陽,楊傳宗,羅 茜,高艷宏,薛 挺

(1.臨沂大學農(nóng)林科學學院,山東臨沂 276000;2.安徽農(nóng)業(yè)大學生命科學學院,安徽合肥 230036)

禽致病性大腸埃希氏菌(avian pathogenicEscherichiacoli,APEC)是腸道外致病性大腸埃希氏菌(extra-intestinal pathogenicEscherichiacoli,ExPEC)的一個亞群,能夠引起雞、鴨、鵝等禽類局部或全身性腸道外感染性細菌病,并伴有多器官損傷的復雜性綜合征,比如氣囊炎(Airsacculitis)、心包炎(Pericarditis)、腹膜炎(Peritonitis)、 多發(fā)性漿膜炎(Polyserositis)、滑膜炎(Arthromeningitis)、骨髓炎(Osteomyelitis)、 敗血癥(Septicemia)、全眼球炎(Panophthalmitis)、骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis)、肝周炎(Perihepatitis)、肉芽腫(Granuloma)、蜂窩組織炎(Cellulitis)、輸卵管炎(Salpingitis)和卵黃囊感染(Yolk sac infection)等,統(tǒng)稱為禽大腸桿菌病,從而導致禽類的高發(fā)病率和高病死率,同時不但對世界養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失,而且限制了養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展[1-4]。近年來的研究證明APEC能夠通過禽類及其產(chǎn)品或者其他感染方式引起包括人在內(nèi)的哺乳動物疾病,表明APEC是人獸共患病的潛在病原體[5-6]。因此,控制APEC的感染具有十分重要的意義。研究發(fā)現(xiàn),細菌生物被膜的形成不但增強細菌對抗菌藥物的耐藥性,而且導致宿主持續(xù)和反復性感染[7-8]。為了了解由生物被膜引起的APEC感染,本文概述了生物被膜的形成過程及各調(diào)控系統(tǒng)對生物被膜的影響,以期探尋破壞生物被膜形成的新策略,從而控制由生物被膜引起的感染和抗菌藥物耐藥性。

1 生物被膜

在APEC感染宿主的過程中,生物被膜的形成有助于APEC從免疫系統(tǒng)中逃逸而持續(xù)定植于宿主細胞,引發(fā)禽大腸桿菌病[9]。生物被膜是生長在生物表面的微生物群落,它們在一個由胞外多糖、蛋白質(zhì)和eDNA組成的自產(chǎn)胞外基質(zhì)中緊密地黏附在一起[8-9]。生物被膜的形成是一個非常復雜的過程包括可逆黏附、不可逆黏附、微菌落形成、生物被膜的成熟和解離5個階段[10-11]。生物被膜的早期黏附階段由多種細胞表面附屬物,如鞭毛、Ⅰ型菌毛、Curli菌毛以及胞外多糖(如纖維素、可拉酸等)參與附著在生物表面[8,11]。在生物被膜的成熟過程中,細菌細胞的增殖導致微菌落的擴大,從而達到數(shù)百微米的厚度,并展示出復雜的結(jié)構(gòu)和功能骨架[8-9]。而生物被膜的解離有利于浮游細菌的傳播和尋找新的定植區(qū)域,以促使浮游細菌開啟生物被膜形成的新一輪循環(huán)[7]。生物被膜是APEC的一層保護膜,用于保護APEC免受抗菌藥物治療和逃避宿主的免疫應答,從而導致宿主持續(xù)和反復性感染,并且很難被預防、控制和清除[12-13]。因此,詳細闡釋調(diào)控APEC生物被膜形成的分子機制對探尋抗生物被膜感染的藥物靶標變得尤為重要。

2 調(diào)控系統(tǒng)

為了更好地適應宿主細胞外環(huán)境的變化,APEC已經(jīng)發(fā)展了一系列嚴密的調(diào)控系統(tǒng),這些調(diào)控系統(tǒng)在生物被膜形成的每一個階段均有參與,以調(diào)控生物被膜相關(guān)基因的表達,進而維持生物被膜結(jié)構(gòu)的完整性[11]。該調(diào)控系統(tǒng)主要包括群體感應(quorum sensing,QS)、雙組份系統(tǒng)(two-component system,TCS)和第二信使(second messenger,SM)等[14-16]。其中,自誘導物-2 (autoinducer-2,AI-2)、BasSR和環(huán)二鳥苷酸(cyclic diguanosine monophosphate,c-di-GMP)均在信號傳導途徑中發(fā)揮了重要的作用,并參與調(diào)控生物被膜的形成[12,17-18]。

2.1 自誘導物-2群體感應

QS是一種細胞與細胞交流的過程,在此過程中細菌細胞利用其自身分泌的化學分子也稱為自誘導物(autoinducers,AIs)來調(diào)節(jié)特定的生理功能,以響應群體密度的波動,從而更好地適應外部環(huán)境[1,14]。當AIs濃度達到閾值時,能夠觸發(fā)下游基因的表達,進而引起細菌的群體性變化并且調(diào)節(jié)細菌的各種生理特性,如生物發(fā)光、細胞運動性、毒力基因表達、抗菌藥物敏感性和生物被膜形成等[19-20]。其中,AI-2 QS被許多革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌產(chǎn)生,并且在細菌種內(nèi)和種間的通訊中起了重要的作用[21]。在E.coli中,胞外AI-2的濃度在指數(shù)期達到閾值水平時,激活信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)反應以促使ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白體攝取和修飾AI-2[1]。隨后,胞內(nèi)AI-2被胞質(zhì)激酶LsrK磷酸化形成活性分子AI-2-P,該分子與其胞內(nèi)受體LsrR結(jié)合以激活QS系統(tǒng),進而調(diào)控毒力基因表達、抗菌藥物敏感性和生物被膜形成等[1,2,11,14]。為此,有學者提出,通過抑制QS的方式抑制生物被膜的形成,進而控制E.coli感染[14,21]。

2.2 BasSR雙組份系統(tǒng)

TCS是一種獨特的對外部環(huán)境持續(xù)監(jiān)控的系統(tǒng)。致病菌依靠它檢測環(huán)境中各種生理因素的變化,并據(jù)此迅速調(diào)節(jié)自身的結(jié)構(gòu)和生理行為,以達到適應新環(huán)境和生存繁殖的目的[22-23]。在TCS信號傳導通路中,TCS參與調(diào)控生物發(fā)光、生物被膜形成、致病基因的表達以及抗菌藥物耐藥性等多種生物過程[15]。BasSR是一個典型的TCS,由位于細胞膜上的組氨酸激酶(histidine kinase,HK)和位于胞漿內(nèi)的響應調(diào)節(jié)子(response regulator,RR)組成,其功能研究已有相關(guān)報道,如在E.coliK-12中,BasSR不僅調(diào)控膜結(jié)構(gòu)的形成和修飾相關(guān)的基因表達,而且調(diào)控壓力響應細胞功能的基因表達,包括生物被膜形成的主要調(diào)節(jié)子CsgD[24];而在APEC臨床分離株中,BasSR不僅特異性結(jié)合多重藥物外排泵EmrD的啟動子以激活EmrD的表達,進而影響APECX40對多西環(huán)素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、林可霉素、克林霉素、SDS和紅霉素8種抗菌藥物的耐藥性[25],BasSR還通過調(diào)控生物被膜形成相關(guān)基因bcsA、csgA、fliC、fimA、motA和wcaF的表達,進而增強APECX40生物被膜的形成[26]。該研究為探究TCS調(diào)控生物被膜形成的分子機制奠定了基礎(chǔ),也為抑制TCS以破壞生物被膜形成提供了新線索。

2.3 環(huán)二鳥苷酸

SM是細胞表面受體接受胞外信號后通過一系列酶促反應在胞內(nèi)產(chǎn)生的一種小分子物質(zhì)[27]。細菌中常見的第二信使包括環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)、鳥苷四磷酸(guanosine tetraphosphate,ppGpp)和c-di-GMP等[27]。其中,c-di-GMP是近年來發(fā)現(xiàn)的廣泛存在于細菌中的一種第二信使分子,與細菌的致病性、運動性、毒力、鞭毛合成、生物被膜的形成以及細胞分化等生物功能過程密切相關(guān)[28]。一般來說,低濃度c-di-GMP與浮游細菌的運動性和高致病性有關(guān),而高濃度c-di-GMP促進細菌細胞表面黏附、生物被膜形成以及慢性感染[29]。在c-di-GMP信號傳導途徑中,胞外信號經(jīng)傳導后轉(zhuǎn)變?yōu)閏-di-GMP的濃度變化,而c-di-GMP的濃度受二鳥苷酸環(huán)化酶(diguanylate cyclase,DGC)和磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)的調(diào)控[27,30]。研究發(fā)現(xiàn),腸出血性大腸埃希氏菌(enterohemorrhagicEscherichiacoli,EHEC)O157:H7 c-di-GMP PDE VmpA的失活增強生物被膜形成以及降低其泳動性[31];而E.coliK-12 c-di-GMP PDE YfgF參與調(diào)控K-12細胞表面的重塑、c-di-GMP濃度變化以及生物被膜形成[32]。這些結(jié)果為干擾c-di-GMP代謝和信號傳導以控制生物被膜形成奠定了基礎(chǔ),并為探尋破壞生物被膜的形成提供了新思路。

2.4 兩個系統(tǒng)間的互作研究

近年來,盡管c-di-GMP信號網(wǎng)絡(luò)將環(huán)境刺激與細菌細胞的特定適應性反應建立了關(guān)聯(lián),但是仍然存在許多問題有待解決,如依賴于c-di-GMP的不同調(diào)控通路之間的相互作用是如何被規(guī)避的?以及c-di-GMP信號網(wǎng)絡(luò)是如何與細菌細胞中其他的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)相互聯(lián)系的?基于上述問題的研究已有相關(guān)報道,如Liu Y T等[33]報道,RstAB TCS通過調(diào)節(jié)c-di-GMP濃度控制EHEC O157:H7生物被膜的形成和毒力因子的表達。Li S Y等[34]報道,AI-2 QS通過激活YeaJ DGC誘導鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)胞內(nèi)c-di-GMP合成,進而調(diào)控生物被膜的形成和Ш型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion system,T3SS)活性以影響S.typhimurium的致病性。作者前期研究工作發(fā)現(xiàn),BasSR TCS通過調(diào)控c-di-GMP PDE YfgF影響APEC生物被膜的形成[1]。這些研究表明,QS和TCS信號通路整合到c-di-GMP,進而調(diào)控生物被膜的形成和毒力因子的表達。這或許為干擾c-di-GMP代謝以破壞生物被膜的形成或預防細菌感染提供了新途徑。

3 展望

生物被膜形成是一個非常復雜的過程,包括可逆黏附、不可逆黏附、微菌落形成、成熟和解離5個階段。在生物被膜形成的每個階段中,都需要多個系統(tǒng)共同參與調(diào)控生物被膜相關(guān)基因的表達以促進生物被膜的形成和維持生物被膜結(jié)構(gòu)的完整性。盡管學者們在分子水平上已經(jīng)詳細的闡明了生物被膜的形成機制,以及QS、TCS、c-di-GMP 等系統(tǒng)均參與調(diào)控生物被膜形成的分子機制,但是仍然沒有提出任何破壞生物被膜形成的新策略[7]。因此,充分了解多系統(tǒng)間的互作網(wǎng)絡(luò)以及多系統(tǒng)共同調(diào)控生物被膜形成的分子機制仍然是一項艱巨的挑戰(zhàn)。換言之,探尋多系統(tǒng)互作或者共同調(diào)控生物被膜形成的中間調(diào)控蛋白,或許可以作為破壞生物被膜形成的研究策略。希望通過本文的概述,利用中間調(diào)控蛋白阻斷生物被膜的早期黏附,以期從源頭破壞生物被膜的形成,從而為控制由生物被膜引起的抗菌藥物耐藥性和慢性感染或持續(xù)性感染提供研究方向,最終為徹底治療與生物被膜相關(guān)的疾病帶來希望。

被動治療是養(yǎng)禽業(yè)中一件不得已而為之的事情,只有嚴格認真地做好了平時的預防工作,才能保障養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。在禽病防控過程中,要做到給禽群以舒適的飼養(yǎng)環(huán)境,平衡的日糧營養(yǎng),良好的飼養(yǎng)管理,科學合理及時的藥物預防,只有這樣才能夠阻止各種致病菌的侵入,以防止禽群受到疾病的危害,真正做到“養(yǎng)防結(jié)合、養(yǎng)重于防、防重于治、預防為主”的綜合防控措施,從而提高禽群的健康水平和抗病能力,控制禽群不發(fā)病[35]。