張 蕾,陳 亮,江波濤,馮萬宇,蘭世捷,苗 艷,沈思思,李 丹,田秋豐,楊昊天,張 艷,劉雪松,黃宣凱,鐘 鵬,史同瑞

(黑龍江省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)分院,黑龍江齊齊哈爾 161000)

體外核酸擴增(invitronucleic acid amplification,NAA)技術已廣泛應用于動物疫病病原體的分子診斷, 聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)和實時聚合酶鏈反應(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)均已被證實是精準和高效的診斷工具。但是,此類擴增方法需要具備專業(yè)儀器、嚴格的加熱和冷卻熱循環(huán)條件、高質量的核酸反應組分、熟練的操作人員和良好的實驗室環(huán)境。近年來,常規(guī)PCR隨著技術的發(fā)展已有所改進,但仍比較耗時。

為了突破傳統(tǒng)PCR的局限性,學者們已經開發(fā)了基于不同酶(反應)機制和擴增系統(tǒng)的多種等溫擴增技術,主要包括環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、轉錄介導擴增(transcription mediated amplification,TMA)、鏈置換擴增(strand displacement amplification,SDA)、解旋酶依賴性擴增((helicase-dependent amplification,HDA)、重組酶聚合酶擴增(recombinase polymerase amplification,RPA)和滾動環(huán)擴增(rolling loop amplification,RCA)等[1]。與常規(guī)PCR相比,等溫擴增技術更易于在低資源配置環(huán)境中實施,并且該技術可通過去除加熱和冷卻步驟,允許多種分子反應同時進行,縮短了反應時間。在多種等溫擴增技術中,RPA技術雖然開發(fā)較晚,卻因其不依賴專業(yè)設備、操作簡單、反應快速、高敏感性和特異性的特點而得到快速發(fā)展和應用[2]。迄今為止,基于RPA開發(fā)的動物疾病診斷和病原檢測(病毒、細菌、真菌和和寄生蟲)方法已有諸多報道。

1 重組酶聚合酶技術

1.1 反應體系和原理

RPA是一種等溫擴增技術,由Niall Armes(ASM Scientific Ltd of Cambridge,UK)于2006年研發(fā),其優(yōu)勢是不依賴于常規(guī)PCR反應的熱循環(huán)。RPA反應體系包括3種關鍵蛋白、枯草芽孢桿菌DNA聚合酶Ⅰ(Bsu)或金黃色葡萄球菌聚合酶(Sau)、引物、模板和輔助組分。3種關鍵蛋白分別是T4 UvsX蛋白、T4 UvsY蛋白和T4 gp32蛋白。T4 UvsX蛋白是具有識別配對和轉移活性的重組酶。介體蛋白T4 UvsY是重組酶負載因子。單鏈結合蛋白T4 gp32可優(yōu)先與解開的單鏈DNA結合[3]。

反應體系在恒溫條件下開始擴增時,重組酶T4 UvsX在負載因子T4 UvsY的幫助下與引物結合,形成重組酶引物復合物。復合物在雙鏈DNA中尋找同源序列位點,一旦識別到靶位點,復合物直接侵入雙鏈DNA并結合,引發(fā)鏈交換反應,形成D環(huán)結構,D環(huán)的另一側仍然是單鏈。移位的單鏈則會被單鏈結合蛋白T4 gp32結合,以防止復合物中的引物解離[4]。隨后,重組酶引物復合物在水解ATP的同時,自身構象發(fā)生改變,繼而重組酶從核蛋白細絲釋放出來,并可立即與另一對引物結合,開始新一輪的鏈置換反應。同時,引物的3′端暴露并被DNA聚合酶識別,由DNA聚合酶催化開始擴增,擴增反應從兩端的正向和反向引物同時進行,合成的擴增產物不斷成為新的模板,從而實現(xiàn)指數擴增[1,5]。值得注意的是,負載因子T4 UvsY阻礙了單鏈結合蛋白與重組酶T4 UvsX競爭引物結合位點,避免引物與單鏈結合蛋白相結合[6]。

1.2 引物和探針設計

RPA反應引物的推薦長度為30～35個核苷酸,以利于重組酶和引物形成復合物,引物過短(18～25個核苷酸)可能降低反應的速度和靈敏度,引物過長(大于45個核苷酸)則會形成二聚體和發(fā)夾結構。設計引物時,在5′端不推薦使用長鏈鳥嘌呤,3′端則應包含鳥嘌呤和胞嘧啶,G、C含量應為30%～70%,以及避免回紋結構和發(fā)夾結構[7]。也可以引入自回避分子識別系統(tǒng)(SAMRs)寡核苷酸,天然堿基被A*、T*、G*和C*取代,其中A*和T配對,T*和A配對,G*和C配對,C和G配對,但A*不和T*配對,G*不和C*配對,從而避免形成引物二聚體。對于實時熒光RPA反應中使用的Exo探針(46～52個核苷酸)和Fpg探針(32～35個核苷酸),以及側流層析結合RPA反應中使用的Nfo探針(46～52個核苷酸)的設計,Twist D xTM商品化RPA反應試劑盒手冊中有較細的描述。RPA反應的引物和探針比較復雜,要獲得最佳組合,必需經過設計、優(yōu)化和評估。RPA反應獲得的目的片段長度應少于500 bp,多數研究成果表明最佳擴增長度是100～200 bp,然而也有學者報告擴增了79 bp和1 941 bp的目的片段[1]。

1.3 反應條件

除了保障反應順利進行的關鍵蛋白和酶,RPA反應的原理決定了目標序列的選擇以及引物、探針的設計是其敏感性和特異性的內在決定因素,在下文中會做詳細闡述。外部影響因素則包括溫度和攪拌。RPA檢測不需要精確的溫度控制,重組酶在25～42 ℃就可以發(fā)揮活性,然而,幾個研究小組在15～50 ℃的溫度范圍對RPA反應進行了測試,發(fā)現(xiàn)產生陽性結果的臨界溫度應大于30 ℃,如果溫度低于30 ℃,延長反應時間也無法保證RPA反應的穩(wěn)定性[4,8],研究表明,RPA反應的最佳溫度為37～42 ℃[9]。在反應體系中,重組酶通常可以在25 min內消耗所有ATP,所以無需長時間反應。攪拌可以促進RPA反應各組分間的相互作用,在反應開始和第4分鐘對體系進行攪拌,可以提高反應效率,并且持續(xù)的溫和振動也使RPA擴增結果能更快速、穩(wěn)定地顯示在側流層析試紙條上[7]。

2 檢測方法

2.1 常用檢測方法

常規(guī)的PCR檢測方法適用于RPA,如凝膠電泳和實時熒光檢測。RPA擴增產物常含有蛋白質和其他雜質,不適宜直接進行凝膠電泳,因為這會影響電泳時目的基因片段的正確遷移,從而干擾結果判定。擴增產物在電泳檢測前,可通過去污劑(如十二烷基硫酸鈉,SDS)、加熱(如65 ℃或95 ℃加熱10 min)、酶消化(如蛋白酶 K)以及進行純化回收等方法處理。其中,加熱、SDS洗滌和蛋白酶K消化效果相似,相比之下,經過試劑盒純化后的目的條帶特異性更好,但純化后會產生一些DNA損耗[10]。另外,Babu B等[11]報道,通過高速離心將待檢物中的蛋白質進行沉淀,效果與在65 ℃ 加熱10 min相似。實時熒光PCR技術可用于檢測RPA反應過程中和反應終點的結果,然而,當使用如SYBR Green的熒光染料時,由于無法區(qū)分擴增的目的基因和引物二聚體,可能導致假陽性結果。為了避免這個問題,可以使用不同格式的探針,包括以相應酶命名的Exo、Fpg和Nfo探針。熒光PCR的常規(guī)探針與RPA不兼容(如TaqMan探針),是由于5′- 3′端的核酸外切酶活性與RPA不兼容,阻礙DNA擴增。Exo探針是與靶序列同源的寡核苷酸,它的3′端被阻斷以防止探針伸長,探針兩端分別攜帶熒光基團和淬滅基團,二者之間被四氫呋喃(tetrahydrifuran,THF)隔開,反應時核酸外切酶Ⅲ識別并切割THF,使兩個基團分開,從而促使熒光產生[12]。Fpg探針與Exo探針相似,Fpg酶在堿性脫氧核糖(deoxyribose,dR)基團的位置切割并釋放熒光基團,產生熒光信號[13]。在實時熒光RPA試驗中,應設計和評估多組引物和探針,以獲得最佳組合。

側流層析(lateral flow chromatography,LFC)是目前應用廣泛的RPA終點檢測技術。RPA-LFC技術可以快速、便捷地實現(xiàn)結果的可視化判斷,通常用來定性或半定量檢測,適用于條件有限和非實驗室的環(huán)境[14]。RPA-LFC技術通常使用TwistAmp?nfo試劑盒、生物素(biotin)標記的引物和羧基熒光素(carboxyfluorescein,FAM)標記的探針。反應中,攜帶FAM標記的探針與擴增產物反應,使5′端形成FAM標記,攜帶生物素標記的下游引物使3′端擴增產物形成生物素標記。經過雙標記的擴增產物吸附在側向流動試紙條樣品墊上,產物上的FAM與抗FAM抗體的膠體金顆粒結合形成免疫復合物,免疫復合物在擴散的過程中,被檢測線上的鏈霉親和素(streptavidin,SA)捕獲,從而產生顏色變化[15]。除了常用的羧基熒光素外,地高辛(DIG)或Alexa fluor 488染料也是較好的抗原候選標記。在此方法基礎上,以不同的抗原標記結合生物素,設計多重檢測線,同時設置內部控制,即可達到在同一擴增體系內檢測不同病原基因的目的[13]。

2.2 特殊檢測方法

除了常規(guī)檢測方法,還有多種檢測方法已經與RPA相結合,如電化學、化學發(fā)光、絮凝分析和基于硅微環(huán)諧振器 (silicon microring resonator,SMR) 的光子檢測、表面增強拉曼散射 (surface enhanced Raman scattering,SERS)和CRISPR/Cas( clustered regularly interspaced short palindromic repeats /CRISPR-associated)系統(tǒng)。電化學RPA的原理是通過電化學活性化合物來產生與擴增產物相關的信號,一種方法是使用磁珠標記的正向引物和金納米顆粒(AuNP)標記的反向引物,獲得的雙標記的擴增產物被磁體捕獲到工作電極上,通過電催化析氫反應直接檢測AuNP。Ng B Y C等[16]以AuNP作為RPA擴增產物的信號傳感器,能夠檢測到低至1 CFU單位的結核分支桿菌DNA,且便攜式電化學傳感器的使用為即時醫(yī)療(point-of-care,POC)提供了便利。此外,也可使用差分脈沖伏安法進行基于AuNP的電化學檢測?；瘜W發(fā)光檢測是將氧化或水解反應產生的化學能轉化為可見光的發(fā)射。Kober C等[17]開發(fā)了一種流式化學發(fā)光DNA微陣列,使其結合等溫不均勻RPA,可在1 h內定量檢測軍團菌以及嗜肺軍團菌的活菌和死亡菌體。此方法程序相對繁瑣,在聯(lián)合便攜式檢測設備使用時,可提高其現(xiàn)場實用性。橋接絮凝試驗是使長聚合物交聯(lián)多個顆粒,從而在特定緩沖體系(如 pH和鹽濃度)中從溶液中絮凝出來。一般情況下,交聯(lián)的DNA長度需大于100 bp,將磁珠與RPA擴增產物混合,經過乙醇洗滌后使顆粒懸浮在低pH緩沖液中,如果形成絮凝物則說明結果陽性[18]?；诠栉h(huán)諧振器 (SMR) 的光子檢測是以不對稱方式進行核酸擴增,首先將一個引物固定在SMR上,核酸與之結合后可引起波導表面處折射率的變化,通過SMR 實時監(jiān)測獲得檢測結果。DAO等報告了一種RPA-SMR與富集病原體的微流體平臺相結合的方法,該系統(tǒng)對10 mL 尿液中沙門氏菌和布魯氏菌的檢測線分別為50 CFU和102 CFU[1]。表面增強拉曼散射 (SERS)的原理是一些分子被吸附到某些粗糙的金屬(如銀、銅、金等) 表面時,它們共振驅動表面電荷,產生高度局域化(等離子體)光場,使拉曼散射強度增加。Wang J等[19]報告了多重RPA-SERS檢測,將純化的擴增產物與銀納米顆粒孵育,對43例患者尿液樣本進行分析,所得結果的敏感性、特異性和準確率分別為95.3%、93.0%和94.2%。 CRISPR/Cas系統(tǒng)是新興的基因編輯工具,基于CRISPR的檢測依賴于Cas蛋白的切割活性,當Cas蛋白結合到CRISPR RNA(crRNA)時,crRNA與靶序列特異性配對,隨后誘導靶序列被酶切以及單鏈DNA、RNA被非靶向側切。CRISPR/Cas聯(lián)合RPA,通過靶向結合后切割熒光淬滅基團,可以放大信號來提高檢測靈敏度。但是,CRISPR/Cas-RPA需要使用額外標記的ssDNA、ssRNA報告基因,增加了檢測成本,該方法用于動物病原檢測仍需要更多的探究[20]。

3 重組酶聚合酶技術在動物病原菌檢測中的應用

RPA技術可用于檢測多種目標生物,包括病毒、細菌、真菌、原生動物等。細菌是感染人和動物的重要病原,在世界范圍內危害人類健康,威脅生物安全,造成巨大經濟損失,快速、準確的檢測是有效防治細菌性疾病的重要手段。過去十幾年,動物細菌病的分子診斷技術取得了顯著進步,RPA技術作為具有現(xiàn)場應用價值的新的等溫擴增技術,在動物常見病原菌檢測中已有諸多研究報道,其中,檢測方法仍以凝膠電泳、RT-RPA和RPA-LFD最為常見。

3.1 革蘭氏陽性菌

革蘭氏陽性菌包括金黃色葡萄球菌、鏈球菌、產氣莢膜梭菌、結核分支桿菌、炭疽桿菌等,能引發(fā)動物和人體不同程度的疾病。吳華華等[21]以金黃色葡萄球菌nuc基因保守序列為模板設計特異性引物,優(yōu)化擴增條件,對培養(yǎng)物、牛奶和肉質樣本進行RPA檢測,在35 min內獲得了特異性強、靈敏度高的結果。徐健皓等[22]基于金黃色葡萄球菌femB基因設計并優(yōu)化引物和Exo熒光探針,建立了金黃色葡萄球菌實時熒光 RPA檢測方法,可在39 ℃、5～10 min快速檢出最低量為 3.82 fg的金黃色葡萄球菌基因組DNA,檢測模擬臨床血液樣本的敏感性好,有潛力應用于現(xiàn)場快速檢測?；赗PA-LF可視化技術,兩組研究分別報告了針對豬肺炎鏈球菌2型的cpsJ2基因和豬鏈球菌谷氨酸脫氫酶(gdh)基因設計引物、探針,建立了比細菌分離和常規(guī)PCR方法更高效率的RPA-LF檢測法,有效指標評估和臨床檢測適用性較好[22-24]。由于疊氮溴化丙錠(propidium monoazide,PMA)能穿過死亡細菌的細胞膜與 DNA 結合。Chen J等[25]首次使用PMA處理的DNA作為模板,排除雜質DNA產生的假陽性干擾,開發(fā)了快速、準確的化膿性鏈球菌和無乳鏈球菌雙實時RPA檢測系統(tǒng),適用于食品和臨床檢測。炭疽桿菌作為烈性傳染病病原體,其快速準確的診斷深受重視。王素華等[26]根據炭疽桿菌BA5445保守基因序列,建立了最低檢測線為100拷貝/μL的RPA檢測方法,該方法對被炭疽桿菌污染的毛皮標本的檢出率為65.71%,稍低于RT-PCR(71.43%),具有重要的臨床診斷和防控價值。兩組研究分別報告了單核細胞增生李斯特菌 RPA-LFD 檢測系統(tǒng)與qRPA和免疫磁分離(immunomagnetic separation,IMS)相結合的技術。前者在基因組上選取多組序列設計、優(yōu)化引物,完全去除了引物二聚體的假陽性干擾,后者用IMS技術對樣品進行預處理,達到了純化和濃縮樣本、排除干擾的目的,提高了敏感性和特異性[27-28]。此外,RPA技術還應用于產氣莢膜梭菌、蠟樣芽孢桿菌、白色念珠球菌等的快速檢測[29-31]。

3.2 革蘭氏陰性菌

革蘭氏陰性菌包含有多種常見的動物病原菌,RPA技術問世以來已經在此領域報告了許多新的檢測方法。劉婧文等應用RT-RPA技術在20 min內完成了對人工污染大腸埃希氏菌樣品增菌9 h培養(yǎng)物的定性檢測,最低檢測限為0.01 ng/μL。McQuillan J S等[33]針對大腸埃希氏菌ybbW基因設計RT-RPA方法,在3 min內可獲得檢測結果,對從99株大腸埃希氏菌提取的DNA檢出率為100%,最低檢測限為100拷貝/μL,并排除了30種非目標菌。針對大腸埃希氏菌O157:H7 的RPA-LFD技術不僅能快速、靈敏地檢測出飲用水和生牛乳中的大腸埃希氏菌,還通過結合PMA處理做到了僅檢測大腸埃希氏菌O157:H7活菌,檢出限為102CFU/mL[34-35]。不同血清型的沙門氏菌對人/動物具有致病性,已報道的針對鼠傷寒沙門氏菌開發(fā)的RPA-LFD檢測方法不僅最低檢測限可達到1 CFU/μL,并且通過在引物和探針序列中引入特定的替換堿基,經分析和篩選,消除了引物二聚體和引物-探針復合物的假陽性干擾[36-37]。Stringer O W等[38]報道,針對胸膜肺炎放線桿菌種特異性apxIVA基因建立了最低檢測限為10拷貝/μL的RPA診斷方法,對61份臨床樣本進行檢測,結果敏感性和特異性分別為84.3%和100%,同時,將14份肺組織樣本直接在FTA卡上形成印記,RPA檢測結果的敏感性和特異性分別為76.9%和100%,表明該方法用于現(xiàn)場篩查病原菌是可行的。多殺性巴氏桿菌可引發(fā)家畜呼吸道疾病和出血性敗血癥,以KmtⅠ基因為靶序列建立的RPA-LFD檢測方法能在39 ℃、30 min內檢測到多殺性巴氏桿菌,最低檢測限為120拷貝/μL,對臨床樣本檢測結果顯示出高敏感性和特異性[39]。 張珊珊等[40]基于布魯氏菌bcsp31基因序列保守區(qū)建立的RPA-LFD檢測方法,最低檢測限為5.89 CFU/mL,對比酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA),臨床樣本檢測結果一致。溶血性曼氏菌、多殺性巴氏桿菌、睡眠嗜組織菌和牛支原體是引發(fā)牛呼吸道疾病(BRD)的4種主要病原體,Conrad C C等[41]基于以上病原的種特異性基因、7種耐藥基因和整合結合元件(ICE)設計并驗證了11種RPA反應,建立了多重RPA檢測方法,并對100份牛場采集的深鼻咽拭子進行試驗,與培養(yǎng)法和常規(guī)PCR相比,該方法能在更短的時間內從樣本中直接鑒定4種病原體和AMR/ICE基因,具有作為BRD和耐藥基因現(xiàn)場檢測工具的巨大潛力。RPA技術在革蘭氏陰性菌檢測方面的開發(fā)還包括空腸彎曲菌、鼠疫耶爾森菌等,兼具反應時間短、靈敏度高和易操作的特點是RPA與其他分子生物學方法相比較的優(yōu)勢[42-43]。

4 小結與展望

RPA是一種新興的等溫擴增技術,自2006年首次被報道以來,該技術在刊物發(fā)表、普及度和應用方面均呈指數增長。學者們除了對RPA的應用做了廣泛的研究外,還在尋求進一步提升RPA性能的方法。RPA在等溫擴增技術中具有簡單、快速、敏感性高和環(huán)境要求低的突出優(yōu)勢,并且與其他檢測技術的兼容性好。此外,即使樣本是粗提或存在PCR抑制劑,RPA也可以在20 min內實現(xiàn)對低濃度模板的擴增。然而,RPA也存在一些局限性,RPA試劑盒供貨商的單一可能會影響其定價,也限制了用戶的靈活使用。并且,由于RPA靈敏度較高,檢測容易受到氣溶膠污染,未來的研究可考慮建立DNA 提取與RPA反應一體的系統(tǒng)或試劑盒,降低暴露和氣溶膠污染的可能性。需要注意的是,RPA的實時擴增反應是基于時間閾值而不是周期閾值,而時間閾值受到模板濃度、溫度和混合步驟的影響,為了能更好的控制實時RPA,建議減慢反應速率和降低乙酸鎂濃度。RPA對引物和探針有嚴格的要求,但目前尚沒有設計軟件和成熟的設計方案,未來可以開發(fā)相關引物、探針的設計軟件或網站,用于篩選最佳的引物、探針組合,從而提高檢測效率。

細菌性病原體危害全球養(yǎng)殖業(yè),造成巨大經濟損失,并威脅人類的健康、生命和公共生物安全,為了滿足對病原體的檢測要求,必須建立靈敏、快速、特異、多元的檢測方法。雖然RPA技術已在人的醫(yī)學和藥學廣泛應用,并開始用于檢測人畜共患病病原體,但是其在動物疾病檢測中的應用還不夠先進和多樣化,將RPA與便攜式設備、生物傳感器、橫向流動裝置和微流體設備等結合,開發(fā)用于動物疾病現(xiàn)場診斷的便攜、易操作和多重分子診斷方法,將成為重要的研究領域,有巨大的潛在應用價值。