段慧慧,于 瑞,劉忠虎,杜向黨,商艷紅*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,河南鄭州 450046;2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動物醫(yī)藥學(xué)院,河南鄭州 450046)

豬鏈球菌(Streptococcussuis,SS)是危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的一種重要病原體,可使豬出現(xiàn)腦膜炎、敗血癥和心內(nèi)膜炎等疾病[1],嚴(yán)重時會發(fā)生猝死現(xiàn)象[2]。1998年江蘇省和2005年四川省暴發(fā)的兩起致命性人類鏈球菌中毒性休克綜合征,證實(shí)了豬鏈球菌也具有感染人并使人患病的能力[3]?？咕幬锏牟徽_使用導(dǎo)致臨床分離豬鏈球菌耐藥范圍逐漸擴(kuò)大,這預(yù)示著耐藥機(jī)制也更加復(fù)雜。先前的研究已將豬鏈球菌描述為關(guān)鍵的抗菌藥物抗性基因庫和驅(qū)動抗菌藥物發(fā)生耐藥性進(jìn)化的基因傳遞系統(tǒng)[4]。

可移動遺傳元件(mobilizable genetic elements,MGEs)包括質(zhì)粒、基因組島、整合性接合元件(integrative and conjugative elements,ICEs)、轉(zhuǎn)座子、噬菌體和嵌合元件,它們都可攜帶單/多個抗菌藥物抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)且將其轉(zhuǎn)移到相同/不同細(xì)菌中[3]。細(xì)菌的大多數(shù)耐藥機(jī)制與ARGs表達(dá)有關(guān),且基因的水平轉(zhuǎn)移(horizontal gene transfer,HGT)在細(xì)菌耐藥性方面占據(jù)主要地位,不斷促進(jìn)細(xì)菌發(fā)生進(jìn)化。與基因的垂直轉(zhuǎn)移相比,HGT能夠在遠(yuǎn)親細(xì)胞之間獲得外源基因[5]。HGT的3種常見機(jī)制是轉(zhuǎn)化、接合和轉(zhuǎn)導(dǎo)[6],其中,接合機(jī)制是豬鏈球菌在外界壓力存在時獲得優(yōu)勢生長條件的最常見機(jī)制。ICEs是近年來在豬鏈球菌中發(fā)現(xiàn)的一種越來越常見且能夠發(fā)生移動的基因水平轉(zhuǎn)移載體[7]。它位于宿主細(xì)胞的染色體上,可將細(xì)菌間的基因通過接合轉(zhuǎn)移的方式發(fā)生水平轉(zhuǎn)移,使細(xì)菌獲得更多具有多種功能且有利于其生存的適應(yīng)性基因。研究證明[8]ICEs是一類兼具質(zhì)粒和噬菌體特征的鑲嵌元件,它依據(jù)噬菌體的方式對宿主細(xì)胞的染色體進(jìn)行復(fù)制,通過質(zhì)粒接合的方式對染色體進(jìn)行轉(zhuǎn)移。ICEs的存在對宿主細(xì)菌的進(jìn)化起著重要作用,包括增強(qiáng)細(xì)菌毒力、對抗菌藥物和重金屬的抗性、生物膜形成和毒素/抗毒素系統(tǒng)。因此,對豬鏈球菌中的ICEs等可移動元件的研究是十分必要的。本文主要通過對ICEs的發(fā)現(xiàn)、分類、存在形式和相互作用、轉(zhuǎn)移途徑和相關(guān)結(jié)構(gòu)作用及其與細(xì)菌耐藥性和致病性等方面進(jìn)行介紹,為豬鏈球菌中ICEs的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 整合性接合元件的發(fā)現(xiàn)

ICEs又稱為接合轉(zhuǎn)座子,是編碼蛋白質(zhì)的可移動元件,其通過接合的方式從宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受體中。1967年人們在雷氏普羅維登斯菌中發(fā)現(xiàn)一個可對金屬元素和卡那霉素產(chǎn)生抗性的89 kb基因元件Inc J質(zhì)粒(R391)。隨后,又在霍亂弧菌O139中鑒定出62 kb基因元件SXT,其能夠引起流行性霍亂且攜帶的部分基因促使細(xì)菌對磺胺甲惡唑和甲氧芐胺嘧啶表現(xiàn)出抗性。由于此類元件越來越多,為了更好地研究它們的特性,人們將其統(tǒng)稱為ICEs[7]。隨著基因分析技術(shù)不斷進(jìn)步,R391家族和SXT家族被認(rèn)定為一個家族,同時明確了SXT/R391家族目前是由40多個成員構(gòu)成,核心結(jié)構(gòu)包含52個保守基因和1個位于prfC基因5′端的共同染色體整合位點(diǎn)。它們的不同之處在于骨架結(jié)構(gòu)上的4個高頻插入位點(diǎn)處被插入了不同種類的DNA片段,使ICEs具有特殊的功能[9]。隨后,在美國的1株無乳鏈球菌2603V/R中發(fā)現(xiàn)了和SXT/R391家族具有相似功能的ICEs(ICESa2603)[10]。在中國的高毒力SS2菌株中發(fā)現(xiàn)了89K毒力島(89K PAI),它的出現(xiàn)不僅傳播了四環(huán)素和大環(huán)內(nèi)酯類ARGs,而且還造成了毒力基因的傳播[11]。

隨著生物信息技術(shù)的快速發(fā)展,人們對ICEs的研究日益增多,為了讓人們更方便地獲得與ICEs相關(guān)的信息,Bi等創(chuàng)建了ICEs數(shù)據(jù)庫ICEberg(http://db-mml.sjtu.edu.cn/ICEberg/)并且不斷地對其進(jìn)行更新[12]。經(jīng)過ICEberg對數(shù)據(jù)信息的分析,將ICEs分為了28個家族,促進(jìn)了人們對ICEs在其他領(lǐng)域的創(chuàng)新性研究[13]。

2 整合性接合元件的分類

由于所有革蘭氏陰性菌和大多數(shù)革蘭氏陽性菌中ICEs以線性單鏈DNA (ssDNA)的形式傳遞,傳遞過程中涉及一種松弛酶,因此以這種方式轉(zhuǎn)移的屬于接合型Ⅳ分泌系統(tǒng) (type Ⅳ secretion system,T4SS)[14]。然而,在放線菌中,一些ICEs以雙鏈DNA (dsDNA)的形式發(fā)生轉(zhuǎn)移,其過程涉及RepSA或RepAM型復(fù)制起始蛋白(Rep)和包含F(xiàn)tsK/SpoIIIE結(jié)構(gòu)域的蛋白(Tra)用于易位。因此,根據(jù)整合酶分類的28個ICEs家族,又可分為T4SS型ICEs和放線菌ICEs (actinomycete ICEs,AICEs)[15]。

2.1 Ⅳ型分泌系統(tǒng)型整合性接合元件

T4SS是一種跨膜的多蛋白復(fù)合物,專門用于細(xì)菌中蛋白質(zhì)的分泌或接合DNA的轉(zhuǎn)運(yùn),從而傳播耐藥性和致病性特征[14]。T4SS蛋白家族分別是:激活組分(運(yùn)動蛋白)家族、PG水解酶家族、T4SS支架/核心組分家族和表面因子/黏附素家族。這些蛋白家族在ICEs的轉(zhuǎn)移中進(jìn)行分工合作,促進(jìn)它在親緣關(guān)系密切的細(xì)菌中傳播ARGs和毒力因子[16]。此外,T4SS型ICEs在接合過程中涉及到的一種特殊的松弛酶是多種蛋白DNA加工復(fù)合體的關(guān)鍵元件,松弛酶在轉(zhuǎn)移起始處與DNA接合并切割DNA,形成的松弛酶-DNA核蛋白復(fù)合物通過Ⅳ型接合蛋白(type Ⅳ coupling proteins,T4CP)與T4SS接合,隨后,T4SS通過供體細(xì)胞的細(xì)胞膜將松弛酶-DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)到受體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中[17]。

雖然接合元件已經(jīng)研究了幾十年,但在原核生物中ICEs的數(shù)量和多樣性尚不清楚。先前的研究[18]發(fā)現(xiàn)ICEs是原核生物中最豐富的接合元件,但含有T4SS的部分細(xì)菌染色體缺乏T4SS共定位松弛酶,因此,推測出T4SS也許是用于蛋白質(zhì)運(yùn)輸而不是接合。這類元素在小型基因組中占優(yōu)勢,與整合酶的關(guān)聯(lián)較少,在質(zhì)粒中也較為罕見。當(dāng)然,在變形菌中,ICEs和接合質(zhì)粒對不同類型的T4SS有不同的偏好,但所有類型的T4SS都存在于染色體和質(zhì)粒中,且質(zhì)粒與ICEs之間的轉(zhuǎn)換是頻繁的。雖然接合質(zhì)粒和ICEs具有不同的基因組穩(wěn)定方式,但它們通過接合的遷移機(jī)制卻驚奇的一致,這為原核生物通過HGT從而獲得基因組接合的統(tǒng)一觀點(diǎn)提供了證據(jù)[9]。

2.2 放線菌整合性接合元件

AICEs[15]是在鏈霉菌屬中發(fā)現(xiàn)的一類能夠像質(zhì)粒一樣自主復(fù)制的MGEs ,大小為9～24 kb之間,它的復(fù)制起始蛋白大多是RepSA和RepAM這兩類蛋白,也有一部分是Prim-Pol類型聚合酶。由于鏈霉菌菌屬是一類革蘭氏陽性、多細(xì)胞的絲狀土壤微生物,它以菌絲體形式生長,遺傳物質(zhì)通過菌絲轉(zhuǎn)移,因此,AICEs從供體到受體的過程是以雙鏈的形式通過菌絲間的緊密接合進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移的[19]。鏈霉菌S.coelicolorA3中多個AICEs有著不同的功能和插入位點(diǎn)[20];阿維鏈霉菌[21]中的兩個AICEs以串聯(lián)的形式整合在同一個tRNA-Arg位點(diǎn),但二者功能獨(dú)立且完整,此現(xiàn)象說明了它們編碼的整合酶在插入到tRNA-Arg位點(diǎn)時具有特異性。此外,鏈霉菌中的AICEs還攜帶有一些與限制修飾系統(tǒng)相關(guān)的基因,這些基因主要位于MGEs上,它們的存在可抵抗外來DNA入侵宿主,對宿主形成一種保護(hù)作用[20]。

3 整合性接合元件在豬鏈球菌中的存在形式

到目前為止,已經(jīng)報道的豬鏈球菌中ICEs主要以單個[5]、串聯(lián)[21](ICEs-ICEs和ICEs-前噬菌體)和雜合[3](ICEs在其他ICEs中進(jìn)行整合)的形式在生物界中存在并繼續(xù)發(fā)揮作用。豬鏈球菌中報道的ICEs家族主要有Tn5252、Tn1549、TnGBS2、Tn916、vanG和ICESt3和TnGBS1家族。Tn5252家族中出現(xiàn)的新的染色體整合位點(diǎn)(ADP核糖焦磷酸酶基因)使得部分ICEs擁有6個靶基因;Tn1549家族常與Tn5252家族以串聯(lián)的形式呈現(xiàn);其他家族的出現(xiàn)頻率較低[3]。研究表明豬鏈球菌ICESsu32457和無乳鏈球菌ICESa2603的接合產(chǎn)生了串聯(lián)ICEs,在實(shí)驗(yàn)室條件下可在化膿鏈球菌菌株之間轉(zhuǎn)移,ICESa2603還可以獲得其他MGEs,產(chǎn)生“嵌合”或“復(fù)合”[22]。有趣的是,串聯(lián)ICEs攜帶的ARGs更容易被轉(zhuǎn)移到受體菌中,進(jìn)而表達(dá)[23]。

4 整合性接合元件之間的相互作用

由于ICEs的存在形式多樣化,它們之間的相互作用也值得研究。通常情況下,細(xì)胞內(nèi)不會同時存在兩種同/不同類型ICEs[7]。但SXT/R391家族卻與眾不同,雖然兩種ICEs的接合基因幾乎相同,且都擁有一個入口排斥系統(tǒng)(能夠特異性抑制帶有相同類型ICEs的細(xì)胞之間發(fā)生重復(fù)的接合轉(zhuǎn)移),但是它們之間卻沒有編碼相互排斥的基因,因此,受體細(xì)胞并沒有因?yàn)橐呀?jīng)存在的ICEs而降低自身獲得另外一種ICEs的能力;且當(dāng)細(xì)胞內(nèi)含有SXT/R391家族兩種ICEs時,它們會以串聯(lián)的形式共同轉(zhuǎn)移[7]。串聯(lián)ICEs的出現(xiàn)不會妨礙它們的移動性,反而會促使種間基因發(fā)生轉(zhuǎn)移[24]。與此同時,豬鏈球菌和其他鏈球菌中串聯(lián)MGEs轉(zhuǎn)移頻率增多,這種流行趨勢表明了串聯(lián)MGEs在細(xì)菌進(jìn)化中發(fā)揮重要作用;但值得注意的是,部分MGEs或ARGs整合到ICEs中后,會造成ICEs中原有的整合酶活性降低或與ARGs相關(guān)的元素出現(xiàn)衰變從而失去流動性[24]。此外,ICEs之間或ICEs與其他的MGEs(例如噬菌體)之間的相互作用可能改變插入位點(diǎn)特異性或產(chǎn)生修改宿主范圍的新型ICEs[22]。

5 整合性接合元件的轉(zhuǎn)移途徑及其相關(guān)結(jié)構(gòu)的作用

5.1 整合性接合元件的轉(zhuǎn)移途徑

ICEs是在革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌中發(fā)現(xiàn)的一組不同的移動元件,它能整合到細(xì)菌染色體上,具有編碼功能齊全的接合機(jī)制,可在細(xì)菌細(xì)胞之間傳播。ICEs又是基因島的一員,因此,豬鏈球菌中ICEs從供體菌轉(zhuǎn)移到受體菌的步驟為切離、裂缺、解旋、識別和整合[6]。

豬鏈球菌中部分ICEs能夠以反式或順式方式移動其他遺傳元件,例如染色體攜帶的整合可移動元件(integrative mobilizable elements,IMEs)[24]和順式可移動元件(cis-movable element,CIME)[25]。IMEs是編碼自身切除和整合的基因組島,但缺乏用于自主接合轉(zhuǎn)移的完整接合裝置,而CIME丟失了整合和轉(zhuǎn)移基因,但保留了完整的attL和attR重組位點(diǎn)。這些元素雖然沒有接合裝置,但是經(jīng)常充當(dāng)ICEs和其他接合元件的便車。在嗜熱鏈球菌中,CIMEL3catR3可以通過ICESt3的整合被ICESt3以順式方式調(diào)動,隨后作為一個復(fù)合元件切除和轉(zhuǎn)移。IMEs和CIME因在鏈球菌中呈現(xiàn)出多樣性被認(rèn)為是比ICEs更能廣泛傳播毒力因子基因和獲得性ARGs的重要載體[25]。

5.2 整合性接合元件相關(guān)結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)移途徑中的作用

ICEs通常由一個主干(整合與剪切模塊、接合對形成模塊、DNA移動和加工模塊和調(diào)節(jié)模塊)組成,附屬基因(編碼毒力因子和獲得性ARGs等)被插入其中,可以賦予宿主選擇性優(yōu)勢,使ICEs成為細(xì)菌適應(yīng)和進(jìn)化的重要驅(qū)動力[6]。除此之外,它還擁有位于核心區(qū)間的插入熱點(diǎn)區(qū)(hot spots,HS)和可變區(qū)(variable region,VR),位于HS和VR的特性基因使得ICEs具有獨(dú)特的功能[26]。研究證實(shí)rplL和rumA基因位點(diǎn)是鏈球菌和其他革蘭氏陽性菌中的兩個跨物種保守插入熱點(diǎn)[22]。

豬鏈球菌ICEs中的整合酶(Int)基因和切離酶(Xis)基因是其整合與剪切模塊的重要組成部分,Xis負(fù)責(zé)將ICEs從宿主細(xì)胞的染色體中切離,Int用于將切離的環(huán)狀DNA整合到受體菌中[27],且Int和Xis的兩端一般為attL和attR的反向重復(fù)序列。負(fù)責(zé)ICEs重組的Int通常局限于酪氨酸、絲氨酸或DDE家族。此外,豬鏈球菌中ICEs與T4SS存在大量相似的基因,因此T4SS在ICEs的接合對形成模塊中起著很大的作用[26]。ICEs在發(fā)生接合轉(zhuǎn)移前其DNA移動和加工模塊可對ICEs的DNA進(jìn)行加工處理,整個過程類似于質(zhì)粒DNA的加工,即環(huán)狀DNA與釋放酶共價接合后,在轉(zhuǎn)移起始位點(diǎn)(origin of transfer,oriT)處生成開環(huán)缺口,隨后在oriT處合成單鏈DNA,借助接合轉(zhuǎn)移蛋白G,穿過接合孔道,最終抵達(dá)宿主菌體內(nèi)[8]。

ICEs的轉(zhuǎn)移受多種因素的影響,這些因素對它的轉(zhuǎn)移既有促進(jìn)作用又有抑制作用。SXT/R391家族的主要調(diào)節(jié)因子為setR,它可以抑制setC和setD產(chǎn)生用于編碼SXT轉(zhuǎn)錄的蛋白[7];ICESa2603家族擁有3個具有促進(jìn)作用的特征基因,即ICESa2603rplL的Int基因(整合在無乳鏈球菌2603 V/R的rplL基因)、ICESa2603 tRNA Lys的2個Int基因(整合在無乳鏈球菌2603 V/R的tRNA賴氨酸基因和Tn916的松弛酶基因)。銅綠假單胞菌中的ICEPapi-1可以通過專門的GI-T4SS方式發(fā)生水平轉(zhuǎn)移,且ICEPapi-1編碼的調(diào)節(jié)劑TprA在轉(zhuǎn)移過程中起誘導(dǎo)作用。此外,由于某些細(xì)胞會受到營養(yǎng)、細(xì)胞信號傳導(dǎo)限制或兩者兼有者,其體內(nèi)部分ICEs具有生長階段依賴性切除的特征[28]。

6 整合性接合元件與細(xì)菌耐藥性及致病性

細(xì)菌通過HGT獲得遺傳信息,HGT是在不同細(xì)菌種/屬之間交換ARGs的重要方式,因此它們能夠迅速適應(yīng)多變的生態(tài)環(huán)境,并導(dǎo)致菌株之間的基因序列有很大差異[5]。豬鏈球菌ICEs除了參與其移動、調(diào)節(jié)或維持相關(guān)的基因外,還含有多種ARGs;ICEs與其他MGEs的交換能力促使它成為ARGs儲存庫[23]。此外,ICEs增強(qiáng)了生物體定殖真核宿主、固定氮、促進(jìn)生物膜形成和插入毒力基因的能力[29]。隨著研究的深入,豬鏈球菌中ICEs可在相同/不同種屬間發(fā)生轉(zhuǎn)移,且能夠在受體細(xì)菌中復(fù)制和表達(dá)相同的功能,賦予細(xì)菌獨(dú)特的生長優(yōu)勢,給臨床預(yù)防和治療造成困難[5,30-32]。

近些年,世界上關(guān)于感染耐多種抗菌藥物鏈球菌的事件逐漸增多,部分國家具有季節(jié)性和聚集性[33]。豬鏈球菌感染事件于1987年在曼谷被首次報道,隨后世界各地均出現(xiàn)零星病例[33]。人類感染豬鏈球菌主要是表現(xiàn)為腦膜炎或鏈球菌中毒性休克綜合征(Streptococcal toxic shock syndrome,STSS)[34],與之前流行的STSS為特征的ST1毒株相比,流行性ST7菌株中的89K毒力島被認(rèn)為是造成菌株毒力增加的原因。值得注意的是,易感人員大多從事相關(guān)職業(yè),且發(fā)病率大多與種族起源、部落、文化和生活方式有關(guān)。

7 小結(jié)

目前報道的豬鏈球菌中ICEs形式多樣化,可攜帶單個/多個ARGs和毒力基因等元素通過接合/自然轉(zhuǎn)化的方式從供體菌轉(zhuǎn)移到受體菌中,賦予細(xì)菌更多的生長優(yōu)勢,造成耐藥機(jī)制復(fù)雜多樣,給臨床預(yù)防和治療造成了很大程度的困難。本文通過對豬鏈球菌中ICEs進(jìn)行綜述,闡述了其發(fā)現(xiàn)、分類、存在形式和相互作用、轉(zhuǎn)移途徑和相關(guān)結(jié)構(gòu)作用及與細(xì)菌耐藥性和致病性等方面的研究進(jìn)展,為防范豬鏈球菌病提供一定的思路,也為新藥物和疫苗的研發(fā)提供參考。