薛崇祥，張 旭，魯星妤，崔慧娟

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院/國家呼吸醫(yī)學(xué)中心/國家中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)學(xué)中心 中西醫(yī)結(jié)合腫瘤內(nèi)科，北京 100029）

肺癌是全球癌癥死亡的首要原因，其中非小細(xì)胞 肺 癌（non-small cell lung cancer， NSCLC）約 占85%［1］。EGFR是NSCLC 患 者 中 最 常 見 的 驅(qū) 動(dòng) 基因，突變頻率可達(dá)48%～56%，亞洲女性人群中突變率甚至更高［2］。以表皮生長因子抑制劑（epidermal growth factor receptor inhibitors， EGFRIs）為代表的肺癌靶向藥物，顯著提高了患者的生存獲益［3］。

精準(zhǔn)的分子分型是NSCLC 靶向治療的基礎(chǔ)條件，所以準(zhǔn)確、可靠的基因檢測(cè)方法對(duì)靶向用藥的患者篩選及臨床預(yù)后監(jiān)測(cè)具有積極意義。EGFR 是最早發(fā)現(xiàn)的驅(qū)動(dòng)基因，1990 年首個(gè)EGFR 抑制劑苯胺基喹唑啉誕生。2003 年，吉非替尼作為首個(gè)小分子EGFR 酪氨酸激酶抑制劑研發(fā)成功，并于2005 年在國內(nèi)上市，肺癌靶向治療時(shí)代開啟［4］。同年，“鉆石突變”ALK 融合突變被發(fā)現(xiàn)，2010 年首個(gè)ALK 抑制劑克唑替尼研發(fā)上市，2013 年國內(nèi)外指南開始推薦將ALK 與EGFR 納入治療前檢測(cè)［5］。ROS1 融合基因于2007 年由Rikova 等［4］首次發(fā)現(xiàn)，2016 年納入美國臨床實(shí)踐指南推薦。后續(xù)NSCLC 分子靶點(diǎn)的研究及相應(yīng)靶向藥物開發(fā)不斷推進(jìn)，越來越多的驅(qū)動(dòng)基因及伴隨基因被發(fā)現(xiàn)。按最新指南推薦，肺腺癌患者驅(qū)動(dòng)基因檢測(cè)內(nèi)容已擴(kuò)展為至少包括EGFR、ALK、ROS1、BRAF、RET、NTRK、MET、HER-2 等基因［6］。

通過對(duì)組織樣本或體液標(biāo)本進(jìn)行基因檢測(cè)，攜帶特定驅(qū)動(dòng)基因的患者可以選擇針對(duì)該驅(qū)動(dòng)基因的靶向藥物，并可以科學(xué)地預(yù)測(cè)用藥效果以及副作用。其中，外周血循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA， ctDNA）是目前腫瘤液體活檢最主要的標(biāo)本來源，已成為腫瘤基因檢測(cè)的有力手段［7］。有研究表明，放化療等治療方式可能會(huì)影響EGFR 突變的狀態(tài)，可見肺癌基因檢測(cè)結(jié)果并非都是一成不變的［8］。因此，初始標(biāo)本所檢測(cè)的基因突變狀態(tài)可能不足以預(yù)測(cè)一線化療后的藥物療效，所以需要?jiǎng)討B(tài)監(jiān)測(cè)患者的基因突變狀態(tài)［8，9］。另一方面，盡管驅(qū)動(dòng)基因陽性NSCLC 患者對(duì)特定靶向藥物的客觀緩解率較高，但幾乎所有患者均會(huì)出現(xiàn)耐藥。隨著二代測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）的發(fā)展，耐藥后的伴隨基因突變檢測(cè)對(duì)于早期耐藥預(yù)警、后續(xù)治療指導(dǎo)以及肺癌病人的全程管理和長期獲益具有重要影響。因此，本文就非小細(xì)胞肺癌ctDNA 動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)及耐藥相關(guān)伴隨基因研究進(jìn)展作一綜述。

1 臨床上常見的基因檢測(cè)方式

ctDNA 檢測(cè)的方法主要包括Sanger 測(cè)序、即時(shí)定量PCR（qRT-PCR）、NGS 等，各有不同優(yōu)缺點(diǎn)，需根據(jù)檢測(cè)內(nèi)容及臨床需求選擇恰當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法［10］。

1.1 Sanger 測(cè)序法

即雙脫氧鏈末端終止測(cè)序法，是最原始的一代基因測(cè)序技術(shù)。Sanger 測(cè)序讀取片段較長，準(zhǔn)確度接近100%，早期廣泛應(yīng)用于EGFR 等基因突變檢測(cè)。單次檢測(cè)可覆蓋已知少量突變位點(diǎn)，檢測(cè)速度快，但如需檢測(cè)多位點(diǎn)突變情況需要大量寶貴的樣本多次檢測(cè)［11］。另外，Sanger 測(cè)序的靈敏度不足，容易產(chǎn)生樣本稀釋甚至污染，已不能滿足現(xiàn)階段臨床基因檢測(cè)的現(xiàn)實(shí)需求［12］。

1.2 qRT-PCR

qRT-PCR 檢測(cè)的基礎(chǔ)是已知基因突變類型設(shè)計(jì)的引物探針，費(fèi)用相對(duì)低廉，檢測(cè)流程和判讀結(jié)果簡捷，通過閉管操作改進(jìn)Sanger 測(cè)序擴(kuò)增產(chǎn)物污染的不足，便于臨床實(shí)際開展，于是成為目前基因檢測(cè)常用方法之一［13］。雖然靈敏度相對(duì)較高，但qRT-PCR 檢測(cè)無法檢測(cè)出所有可能的突變；對(duì)肺癌早期或低DNA 脫落腫瘤細(xì)胞狀態(tài)患者的基因檢測(cè)來說，也仍具有一定挑戰(zhàn)性［14］。

1.3 NGS 技術(shù)

NGS 屬于高通量測(cè)序技術(shù)，靈敏度高，所需檢測(cè)樣本量小，以其在DNA 及RNA 水平上可進(jìn)行多位點(diǎn)、廣深度且同時(shí)檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，逐步成為肺癌分子病理臨床檢測(cè)領(lǐng)域的主流［6］。相較于傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)，NGS 技術(shù)可以檢測(cè)重要的未知罕見伴隨突變，涉及多種變異類型，為NSCLC 患者的全程管理提供更加全面可靠的診療依據(jù)［15］。而且，NGS 技術(shù)還可同時(shí)檢測(cè)免疫治療相關(guān)指標(biāo)，而且也是目前分子殘留病灶的主要檢測(cè)方法，占據(jù)臨床診斷與科研熱點(diǎn)前沿［16］。

然而，NGS 并非絕對(duì)完美。技術(shù)層面上，NGS測(cè)序步驟多、程序復(fù)雜，讀長較之前的方法更短，后續(xù)數(shù)據(jù)拼接難度增加，且結(jié)果的判讀對(duì)于生物信息的準(zhǔn)確分析具有依賴性。目前，基因檢測(cè)市場(chǎng)并不規(guī)范，第三方檢測(cè)標(biāo)本缺乏病理科質(zhì)控而造成結(jié)果準(zhǔn)確性參差不齊。可及性方面，因NGS 檢測(cè)對(duì)設(shè)備和技術(shù)要求較高，故而檢測(cè)費(fèi)用也相對(duì)較高，并未全部納入醫(yī)保，患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)相對(duì)更大，所以還難以全面普及［17］。

2 ctDNA 檢測(cè)在NSCLC 診治中的作用及優(yōu)勢(shì)

2.1 ctDNA 檢測(cè)可作為組織學(xué)檢測(cè)的替代或聯(lián)合手段

由于相當(dāng)一部分患者尚無法獲取足夠組織標(biāo)本，則推薦外周血ctDNA 活檢，以彌補(bǔ)樣本不足和不可及性［6］。在NSCLC 中，外周血ctDNA 檢測(cè)能夠較好地反映當(dāng)前患者的腫瘤負(fù)荷與基因突變狀態(tài)，已成為組織檢測(cè)的有效代替，兩者的臨床指導(dǎo)價(jià)值相當(dāng)［18］。且組織+ctDNA 聯(lián)合檢測(cè)（35.8%）對(duì)比僅單純組織檢測(cè)（20.5%）或僅ctDNA 檢測(cè)（28.8%），驅(qū)動(dòng)基因檢出率更高［19］。

2.2 ctDNA 檢測(cè)可作為早期肺癌患者病理分型及術(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)補(bǔ)充

對(duì)于早中期肺癌患者，與影像學(xué)檢測(cè)同時(shí)，基于NGS 技術(shù)的ctDNA 圖譜在早期NSCLC 病理亞型分類中也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值［20］。手術(shù)后ctDNA 動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)在預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)方面相比于影像學(xué)更早，未來甚至或許能發(fā)揮蛋白類腫瘤標(biāo)志物的作用，用于監(jiān)測(cè)肺癌高?；颊叩哪[瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)［21］。

2.3 ctDNA 檢測(cè)可協(xié)助預(yù)測(cè)臨床治療療效

目前肺癌治療的療效評(píng)估仍主要依據(jù)影像學(xué)Recist 或iRecist 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，但傳統(tǒng)影像學(xué)手段難以預(yù)測(cè)患者的預(yù)后，且存在滯后效應(yīng)和輻射損傷風(fēng)險(xiǎn)［22，23］。晚期肺癌患者腫瘤負(fù)荷更大，初診時(shí)外周血ctDNA 濃度一般更高；經(jīng)治療后其ctDNA 顯著降低，則其對(duì)放化療敏感，說明臨床治療有效［24］。但對(duì)于局部晚期肺癌患者，倘若治療前ctDNA 就為陰性，可能是腫瘤ctDNA 因位置局限的原因未釋放到血液中，或此時(shí)外周血ctDNA 無法反映腫瘤真實(shí)狀態(tài)。一項(xiàng)真實(shí)世界研究［25］驗(yàn)證了ctDNA 監(jiān)測(cè)對(duì)肺癌治療中的療效預(yù)測(cè)價(jià)值，基線ctDNA 狀態(tài)與患者總生存期（overall survival， OS）呈負(fù)相關(guān)，ctDNA清除可作為臨床獲益的預(yù)測(cè)依據(jù)之一。有研究發(fā)現(xiàn)［26，27］，相對(duì)于常規(guī)影像學(xué)檢查，ctDNA 監(jiān)測(cè)能夠提前4～9 周時(shí)間判斷治療效果，并可能彌補(bǔ)影像學(xué)評(píng)效的不足，所以ctDNA 監(jiān)測(cè)更具優(yōu)勢(shì)。

3 NGS 檢測(cè)在ctDNA 監(jiān)測(cè)中優(yōu)勢(shì)明顯

目前NGS 技術(shù)不僅可以一次性獲得大量腫瘤組織內(nèi)部變異信息，還具備了足夠的靈敏性進(jìn)行ctDNA 的基因變異檢測(cè)，為我們從基因水平深入了解腫瘤復(fù)發(fā)提供了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)［28］。

3.1 NGS 檢測(cè)技術(shù)可靠，準(zhǔn)確性高

在國內(nèi)外研究中，Tuononen 等［29］和支修益等［30］團(tuán)隊(duì)先后對(duì)腫瘤組織樣本進(jìn)行了NGS 和qPCR 技術(shù)檢測(cè)比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確率相似，且NGS 技術(shù)提供的基因突變信息更加豐富、精確。目前，越來越多的實(shí)體瘤NGS 伴隨診斷產(chǎn)品獲批，以Guardant 360 CDx 為例，其在組織和液體活檢結(jié)果一致性98.2% 以上，ctDNA 陽性預(yù)測(cè)值100%［31］。

3.2 NGS 檢測(cè)范圍廣泛，一網(wǎng)打盡

NGS 技術(shù)的檢測(cè)通量和單堿基成本均優(yōu)于Sanger 測(cè)序，甚至能夠檢測(cè)ROS1 重排、MET 擴(kuò)增、NTRK 融合、NGR1 融合等PCR 法無法檢測(cè)的罕見突變［28］。對(duì)于ALK 等適用于免疫組化或熒光原位雜交檢測(cè)的特定基因，NGS 檢測(cè)則可避免多基因不同檢測(cè)方法的重復(fù)，節(jié)省檢測(cè)成本和時(shí)間［32］。隨著檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，更大panel 的伴隨基因診斷產(chǎn)品逐漸從研究走向市場(chǎng)，實(shí)現(xiàn)NSCLC 驅(qū)動(dòng)基因與伴隨基因一網(wǎng)打盡的目的。

3.3 NGS 監(jiān)測(cè)腫瘤耐藥，精準(zhǔn)預(yù)測(cè)

NGS 檢測(cè)助力臨床用藥，能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤療效，早期發(fā)現(xiàn)NSCLC 耐藥突變靶點(diǎn)，并協(xié)助研究者對(duì) 耐 藥 機(jī) 制 進(jìn) 行 深 入 探 索［33，34］。NGS 檢 測(cè) 指 導(dǎo) 臨床決策者及時(shí)調(diào)整患者的個(gè)性化治療方案，并為NSCLC 患者帶來確實(shí)可靠的生存獲益。而且，NGS 或取更廣泛的基因圖譜，是成藥靶點(diǎn)與新藥研發(fā)的重要途經(jīng)［32］。

4 伴隨基因診斷及臨床意義

近年來，肺癌少見基因變異被逐漸鑒定，靶向藥物獲得性耐藥機(jī)制也隨之更加完善，臨床對(duì)基因檢測(cè)提出了更高需求。ctDNA 檢測(cè)允許患者可實(shí)時(shí)取樣評(píng)估病情，對(duì)于監(jiān)測(cè)NSCLC 伴隨基因動(dòng)態(tài)變化具有明顯優(yōu)勢(shì)。如此，患者可及時(shí)掌握腫瘤狀態(tài)和病情變化，提高療效評(píng)價(jià)準(zhǔn)確度，從而更好地及時(shí)調(diào)整治療方案［19］。國內(nèi)外各大指南均建議使用更大panel 的基因檢測(cè)產(chǎn)品以獲取更多基因圖譜信息，識(shí)別罕見變異或耐藥相關(guān)伴隨基因，確定可用于臨床治療靶點(diǎn)［32］。

從基因?qū)用鎭碚f，EGFR 突變合并其他伴隨基因突變，容易導(dǎo)致下游或旁路信號(hào)通路激活［35］。檢測(cè)出的伴隨基因突變?cè)蕉?，越容易出現(xiàn)EGFR-TKI耐藥［35-37］。

肺癌伴隨基因譜系主要包括TP53、KRAS、ERBB2、MET、NRAS、BRAF 等，肺鱗癌中伴隨基因 多 見 中FGFR1 擴(kuò) 增、PIK3CA 和BRAF 等，其 突變頻率或可高達(dá)50%以上［38］。抑癌基因TP53 突變后損害基因監(jiān)視功能，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［39］。伴隨TP53 基因突變的患者無進(jìn)展生存期（progression free survival， PFS）和OS 明顯縮短，提示TP53 伴隨突變患者預(yù)后不良［39］。例如，BENEFIT 研究發(fā)現(xiàn)僅存在EGFR 敏感突變患者，PFS 可達(dá)13.2 個(gè)月，合并TP53 突變組PFS 減少為9.3 個(gè)月［37］。Blakely等［40］將1 122 例 晚 期EGFR 突 變 型 與944 例EGFR野生型肺癌患者ctDNA 檢測(cè)結(jié)果對(duì)比，鑒定出PIK3A、BRAF、MET、MYC、CDK6 和CTNNB1 等具有功能意義的伴隨基因，而CTNNB1 或PIK3CA等伴隨突變通過協(xié)同作用以利于腫瘤耐藥和轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

總之，伴隨突變對(duì)NSCLC 的預(yù)后差異有較大影響，臨床上應(yīng)根據(jù)不同分子分型結(jié)果，并結(jié)合患者實(shí)際情況制定個(gè)體化治療方案，從而更有利于控制疾病進(jìn)程，提高患者生存獲益［41，42］。

5 總結(jié)

對(duì)NSCLC 患者進(jìn)行ctDNA 動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，不僅能夠幫助研究經(jīng)典驅(qū)動(dòng)基因突變對(duì)靶向治療療效獲益的影響，還能夠識(shí)別非經(jīng)典伴隨基因突變的致病差異以及對(duì)臨床預(yù)后的影響。臨床對(duì)外周血液體活檢標(biāo)準(zhǔn)制定和質(zhì)量控制尚未統(tǒng)一，仍然需要改進(jìn)基因檢測(cè)技術(shù)，以提高其精確性、及時(shí)性和臨床實(shí)用性。而且，仍有太多的伴隨基因機(jī)制尚不清楚，未來對(duì)于伴隨基因在臨床用藥和療效監(jiān)測(cè)中的實(shí)際意義、基因檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)化提升等方面仍需深入研究，以期擴(kuò)大靶向治療的受益人群范圍，改善患者預(yù)后與生活質(zhì)量。

作者貢獻(xiàn)度說明：

薛崇祥：文獻(xiàn)的整理和文章撰寫；張旭：文獻(xiàn)資料檢索與整理；魯星妤：為本文寫作思路提供了指導(dǎo)，參與了文獻(xiàn)的搜索和文章修改；崔慧娟：負(fù)責(zé)論文設(shè)計(jì)、修改并審校。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。