血清miR-155、miR-23b 在特發(fā)性肉芽腫乳腺炎和乳腺癌中的差異性表達(dá)及意義

何 姣,周瑜輝,馬曉霞,齊 晶 （西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺外科，陜西 西安 710061）

特發(fā)性肉芽腫乳腺炎（idiopathic granulomatous mastitis，IGM）是一種罕見的慢性良性乳腺炎癥疾病，其病因不明，臨床和影像學(xué)表現(xiàn)與乳腺癌（breast cancer，BC）相似[1-2]。關(guān)于IGM 的診斷和治療是臨床探討的熱點(diǎn)，其常通過病理組織活檢確診[2-3]。但是穿刺病理檢查在不同病程患者中難度不一，且創(chuàng)傷較大，費(fèi)用昂貴，診斷周期長，因此，研究非侵入性的方法和分子進(jìn)行早期診斷十分必要。微小RNA（microRNA，miRNA）是內(nèi)源性的小而高度保守的單鏈非編碼RNA，存在與mRNA 互補(bǔ)的序列片段，其作用是減少mRNA 的表達(dá)[4-5]。循環(huán)miRNA 是一種穩(wěn)定存在于多種體液中的分子，由于其具有高穩(wěn)定性、可靠性和可反映腫瘤狀態(tài)的能力，可能成為癌癥生物標(biāo)志物[6]。目前有研究探討了一些miRNAs 在BC 發(fā)病機(jī)制中的作用[6-8]，如miRNAs 表達(dá)改變會影響癌癥進(jìn)展，然而其是否會引起腫瘤抑制或致癌活性等仍存在爭議[9-10]，且miRNA 在IGM 中的診斷價(jià)值也有待進(jìn)一步探索。因此，本研究探討既往文獻(xiàn)報(bào)道的7 種BC 相關(guān)miRNAs（miR-155[6]、 miR-16-5p[7]、 miR-23b[8]、 miR-21-5p[9]、miR-210-3p[11]、miR-222-3p[12]和miR-29c-3p[13]）作為血清標(biāo)志物診斷IGM 和BC 的價(jià)值，以期為IGM 的診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2018年10月至2021年11月我院收治的IGM患者32例和BC 患者40例；另外納入33例具有相匹配的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征的健康女性作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡大于18歲的女性患者；微生物培養(yǎng)陰性；經(jīng)組織病理學(xué)檢查證實(shí)為IGM 或BC；首次診治，無BC 或IGM 史；既往未接受過化療或放療；具有完整臨床、實(shí)驗(yàn)室、影像學(xué)相關(guān)資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：有其他惡性腫瘤史、糖尿病、高血壓、腎或心血管疾?。惶幱谌焉锘虿溉槠?；真菌、寄生蟲等感染，結(jié)節(jié)病，異物性肉芽腫，肉芽腫性多血管炎，巨細(xì)胞動(dòng)脈炎及結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎；有肺結(jié)核或肺外結(jié)核、結(jié)核病感染者接觸史、硅膠乳房植入及近期破傷風(fēng)疫苗接種。本研究由我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（2018-00376），并根據(jù)《赫爾辛基宣言》進(jìn)行，獲得所有研究對象的知情同意。

1.2 方法

收集所有研究對象的臨床資料，包括年齡，BMI，肝功能、腎功能等生化參數(shù)[血糖（glucose，Glu）、尿素（urea，Ure）、肌酐（creatinine，Cr）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanineamino transferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartateamino transferase，AST）、白蛋白（albumin，ALB）、總蛋白（total protein，TP）]，炎癥標(biāo)志物[C 反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）]，血細(xì)胞分析[白細(xì)胞計(jì)數(shù)（white blood cell count，WBC）、血紅蛋白（hemoglobin，Hb）、紅細(xì)胞比容（hematocrit，Hct）、血小板計(jì)數(shù)（platelet count，PLT）]，腫瘤標(biāo)志物[癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）、CA15-3、CA125]。所有檢測均由對研究終點(diǎn)不知情的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員進(jìn)行。

1.3 血清miRNAs水平檢測

禁食12 h 后，收集各組患者的靜脈血，3 000 r/min離心15 min。將血清轉(zhuǎn)移到無RNase/Dnase的ependorf管中，于-80 ℃保存。使用TRIzol試劑（美國Invitrogen）提取總RNA，使用TaqMan miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒試劑（美國Applied Biosystems）獲得cDNA。在StepOnePlus實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)（美國Applied Biosystems）上使用TaqMan Universal Master Mix Ⅱ和UNG 試劑（美國Applied Biosystems）對每個(gè)樣本進(jìn)行3 次定量PCR：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)。將定量數(shù)據(jù)歸一化為對照cel-miR-39，并采用2-ΔΔCt法計(jì)算。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。首先對連續(xù)變量進(jìn)行Kolmogorov-Smirnov正態(tài)性檢驗(yàn)，正態(tài)分布的連續(xù)變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，進(jìn)行單因素方差分析和兩兩LSD-t檢驗(yàn)。分類變量以率（%）表示，使用χ2檢驗(yàn)。使用Pearson相關(guān)系數(shù)法評估相關(guān)性。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估血清miR-155、miR-23b 對IGM 和BC 的診斷價(jià)值。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料比較

3 組CRP、WBC、Hb、Hct、CA19-9、CA15-3、CA125水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。IGM 組血清Hb、Hct 水平低于對照組，同時(shí)CRP、WBC、CA19-9 和CA125 水平高于對照組（P<0.05）。BC 組血清腫瘤標(biāo)志物CA19-9、CA15-3、CA125水平高于對照組（P<0.05），CRP、WBC低于IGM組（P<0.05），見表2。

表2 3組臨床資料比較（）

表2 3組臨床資料比較（）

*：與對照組相比，P<0.05；#：與IGM組相比，P<0.05

?

2.2 血清miRNAs變化

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果顯示，IGM 組患者血清miR-155、miR-16-5p、miR-21-5p、miR-210-3p、miR-222-3p、miR-29c-3p 表達(dá)水平高于對照組，血清miR-23b 表達(dá)水平低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；BC組患者血清中以上miRNAs 表達(dá)水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），見圖1。進(jìn)一步比較BC 組和IGM 組發(fā)現(xiàn)，只有血清miR-155 和miR-23b 水平存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中BC 組患者血清miR-155表達(dá)水平低于IGM 組（P<0.001），miR-23b 表達(dá)水平高于IGM 組（P<0.001），其余miRNAs 未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），見圖1。

圖1 miRNAs相對表達(dá)

2.3 ROC曲線分析

血清miR-155和miR-23b水平鑒別診斷IGM 和BC的ROC曲線下面積（area under the curve,AUC）分別為0.722（95%CI：0.601～0.843）、0.765（95%CI：0.657～0.874），敏感度分別為81.00%、77.50%，特異度分別為65.00%、59.40%。二者聯(lián)合鑒別診斷IGM 和BC 的AUC為0.869（95%CI：0.786～0.951），敏感度和特異度分別為84.10%和92.50%，見圖2。

2.4 相關(guān)性分析

IGM 組患者中血清miR-155 與WBC（r=0.529，P=0.002）、CRP（r=0.589，P<0.001）水平均呈正相關(guān)，而血清miR-23b 與WBC（r=-0.444，P=0.011）和CRP（r=-0.495，P=0.004）水平均呈負(fù)相關(guān)，與其他指標(biāo)未見明顯相關(guān)性（P>0.05），見圖3。

圖3 IGM組血清miR-155、miR-23b與WBC、CRP的相關(guān)性分析

3 討論

IGM是一種罕見的良性乳腺疾病，復(fù)發(fā)率高，治療較為棘手，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1-2]。IGM 的臨床和影像學(xué)表現(xiàn)與BC 相似，需經(jīng)組織病理學(xué)檢查才能鑒別，但是不同病程患者中穿刺病理檢查難度不一，且為有創(chuàng)檢查，費(fèi)用高，診斷周期長，因此，臨床亟需一種可以快速且有效診斷的非侵入性檢查方法。近年來，無創(chuàng)生物標(biāo)志物和miRNA 芯片等技術(shù)不斷出現(xiàn)，有助于IGM 與BC 的鑒別診斷。本研究通過評估幾種BC 相關(guān)的血清miRNAs 表達(dá)水平，結(jié)果顯示，血清miR-155 和miR-23b 具備鑒別診斷IGM 和BC 的潛力。

miR-155 已被證明可調(diào)節(jié)BC 細(xì)胞凋亡、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[14]。Anwar等[15]檢測了BC 患者和健康女性血清miR-155 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，BC 患者血清miR-155 表達(dá)上調(diào)。Khalighfard 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，BC 組患者miR-155表達(dá)顯著高于健康對照組，并與BC 的臨床病理學(xué)特征存在相關(guān)性。本研究中BC 組患者miR-155 表達(dá)明顯高于對照組，與上述研究一致，提示miR-155 與BC 發(fā)生密切相關(guān)；而IGM 組患者miR-155表達(dá)高于BC 組，分析其原因，IGM 中miR-155 的進(jìn)一步上調(diào)可能與IGM 免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)。miR-155 作為自身免疫性疾病密切相關(guān)的miRNA 之一，可通過Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）配體、炎癥細(xì)胞因子和特異性抗原在多種免疫細(xì)胞譜系中上調(diào)[17]。miR-155介導(dǎo)的多種免疫相關(guān)靶點(diǎn)在哺乳動(dòng)物免疫中具有不同的作用，包括參與B 細(xì)胞功能的調(diào)控，調(diào)節(jié)初始CD4+T 細(xì)胞向輔助性T 細(xì)胞（T helper cell，Th）1、Th2、Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory cell，Treg）分化等[18-19]。Zhang 等[20]也發(fā)現(xiàn)，miR-155 在小鼠乳腺炎中具有促炎作用，其表達(dá)水平升高伴隨著血清腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β 和TLR2 的產(chǎn)生，同時(shí)也可促進(jìn)核因子活化B 細(xì)胞-κ 輕鏈增強(qiáng)子（nuclear factor kappa-B，NF-κB）和MAPK磷酸化。以上研究提示，miR-155可能通過調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)介導(dǎo)IGM的發(fā)生。

miR-23b 是一種新的潛在自身免疫調(diào)節(jié)分子，參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展，包括腫瘤和自身免疫性疾病[8,21-23]。有研究表明，BC 患者中miR-23b 升高，可能是通過促進(jìn)腫瘤生長、增殖和轉(zhuǎn)移發(fā)揮癌基因的作用[8]。Papadaki 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移性BC 患者循環(huán)miR-23b 表達(dá)水平較高，且與預(yù)后不良有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，BC 組患者miR-23b 表達(dá)水平明顯高于對照組，提示miR-23b 與BC 的發(fā)生密切相關(guān)；而IGM 組患者中miR-23b表達(dá)顯著低于BC 組和對照組，這可能是自身免疫性炎癥反應(yīng)引起。據(jù)報(bào)道，miR-23b 可能通過靶向轉(zhuǎn)化生長因子β 激活激酶1-結(jié)合蛋白2（TAK1-binding protein 2，TAB2）、TAB3 和NF-κB 抑制物激酶α，抑制NF-κB 信號通路，從而抑制關(guān)鍵促炎細(xì)胞因子IL-17、IL-1β 和TNF-α 的分泌，抑制自身免疫炎癥反應(yīng)[21-22]。miR-23b 對NF-κB 信號通路的抑制作用在乳腺炎動(dòng)物模型中也已得到證實(shí)[23]。以上研究提示，miR-23b 可能通過介導(dǎo)免疫性炎癥反應(yīng)影響IGM 的發(fā)生。

除了血清miR-155、miR-23b外，本研究BC組和IGM組患者miR-16-5p、miR-21-5p、miR-210-3p、miR-222-3p、miR-29c-3p 表達(dá)水平均較對照組顯著升高，提示這些miRNAs 與BC 和IGM 的發(fā)生有關(guān)；但進(jìn)一步比較BC組和IGM 組，這些miRNAs 均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因而不能用于BC 和IGM 的鑒別診斷。我們推測上述miRNAs 在IGM 和BC 中的共同上調(diào)可能是由于IGM和BC 都與免疫異常、激素水平異常和炎癥反應(yīng)有關(guān)。雖然IGM 的確切病因尚不清楚，但其是一種自身免疫性炎性疾病的假說已經(jīng)得到了流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)、免疫抑制治療效果以及血清學(xué)和組織病理學(xué)等多方面的證據(jù)支持[25-26]。如Ling等[26]通過GO 和KEGG 富集分析表明，IGM的發(fā)生和發(fā)展可能與自身免疫性炎癥、代謝和致病微生物有關(guān)。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，Th、Treg和相關(guān)細(xì)胞因子是介導(dǎo)IGM 發(fā)病的關(guān)鍵介質(zhì)[27]。本研究中，IGM 組患者血清WBC和CRP水平明顯高于對照組和BC 組，提示IGM 與炎癥相關(guān)；且IGM 組中血清miR-155 表達(dá)與WBC、CRP 水平呈正相關(guān)，而miR-23b與WBC、CRP 水平呈負(fù)相關(guān)，推斷miR-155 和miR-23b作為重要的自身免疫調(diào)節(jié)分子可能在IGM 的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，這也是其作為IGM 和BC 鑒別診斷標(biāo)志物的理論基礎(chǔ)。本研究中ROC曲線分析顯示，miR-155 和miR-23b 聯(lián)合鑒別診斷IGM 和BC 的AUC、敏感度及特異度均較高，提示除了組織病理學(xué)和影像學(xué)表現(xiàn)外，血清miR-155和miR-23b有望成為IGM和BC鑒別診斷的靶標(biāo)。

綜上，血清miR-155 和miR-23b 有助于區(qū)分IGM和BC，有潛力成為IGM和BC早期鑒別診斷的靶標(biāo)。